全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 5 期 2012 年 5 月

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银杏叶总黄酮纯化工艺研究
黄金龙，殷之武，何新华*，钱笑芳，曾曲梅
浙江尖峰药业有限公司，浙江 金华 321000
摘 要：目的 对银杏叶总黄酮的纯化工艺进行优化研究。方法 通过 DM-130 树脂和 D-101 树脂（比例为 1∶1）进行混
合，色谱纯化银杏叶总黄酮，用 500 mL 混合树脂装柱，上样质量浓度为 10 mg/mL，洗脱体积流量为 2.0 BV/h，pH 值 6.0，
600 mL 75%乙醇一步洗脱，真空浓缩至干。结果 通过上述工艺分离纯化银杏叶总黄酮，可得质量分数大于 24%的精制银
杏叶总黄酮。结论 DM-130 树脂与 D-101 树脂按 1∶1 比例组成的混合树脂对银杏叶总黄酮的纯化效果较二者单独使用好，
可用于银杏叶总黄酮的纯化。
关键词：银杏叶；黄酮；混合树脂；柱色谱；纯化工艺
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)05 - 0922 - 04
Research on purification technology of total flavonoids in leaves of Ginkgo biloba
HUANG Jin-long, YIN Zhi-wu, HE Xin-hua, QIAN Xiao-fang, ZENG Qu-mei
Zhejiang Jianfeng Pharmaceutical Limited Company, Jinhua 321000, China
Key words: leaves of Ginkgo biloba L.; flavonoid; mixed resin; column chromatography; purification technology

银杏叶提取物（Ginkgo Leaves Extract of Ginkgo
biloba L.）主要包含银杏叶总黄酮和银杏萜类内酯
两大类活性成分[1]，其中银杏叶总黄酮包括槲皮素、
山柰素以及异鼠李素，萜类内酯包括白果内酯、银
杏内酯 A、银杏内酯 B 以及银杏内酯 C[2-3]。银杏叶
提取物具有活血化瘀、通络止痛、化浊降脂、抗氧
化等方面的作用[2-5]。鉴于银杏叶总黄酮具有独特的
药理作用、临床治疗和保健价值[6-7]，使银杏叶提取
物及其制剂成为国内外研究开发的热点产品之一[8]。
目前，银杏叶中银杏叶总黄酮的得率低，生产成本
较高，生产符合《中国药典》2010 年版要求的银杏
叶提取物的量较少，无法满足日益增加的市场需求。
因此，不断探索银杏叶中银杏叶总黄酮的纯化工艺，
提高得率、降低成本，以满足市场需求，具有很现
实的意义。目前，对银杏叶总黄酮纯化工艺文献报
道主要有关于银杏叶总黄酮提取和精制工艺的研
究[9]，关于银杏叶提取物工艺研究[10-12]均采用大孔
树脂色谱柱进行分离纯化银杏叶总黄酮，色谱柱的
填料树脂分别为 D-101 大孔树脂和 DM-130 大孔树
脂，梯度洗脱，分别浓缩干燥的方法，无疑增加了
操作的复杂性，减少了银杏叶总黄酮的收率。本实
验旨在通过研究确定最佳的纯化工艺，提高银杏叶
总黄酮得率，降低生产成本。结合相关研究报道，
在本实验中将 D-101 和 DM-130 大孔树脂按一定比
例（1∶1）混合，对银杏叶粗提物进行色谱纯化，
考察了银杏叶粗提物上样质量浓度、洗脱体积流量
和上样液 pH 值 3 个因素的影响，结果从银杏叶粗
提物分离银杏叶总黄酮取得较好的效果，最终确定
了最佳的银杏叶总黄酮色谱纯化工艺条件。
1 仪器和材料
岛津高效液相色谱仪（日本 Shimadzu 公司）。
银杏叶（批号 110801，金华医药有限公司，经
刘丽珊中药师鉴定符合《中国药典》2010 年版银杏
叶项下规定）；槲皮素（批号 200907）、山柰素（批
号 200808）、异鼠李素（批号 200608）对照品均购
于中国药品生物制品检定所；乙醇（AR 级）。
2 方法与结果
2.1 分析方法的建立[2]
2.1.1 色谱条件 色谱柱为 Agilent ODS C18 柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-0.4%磷酸溶液

收稿日期：2011-11-23
作者简介：黄金龙（1965—），高级工程师。Tel: (0579)82308978
*通讯作者 何新华 Tel: (0579)82258293 E-mail: hexinhua79_0120@sina.com
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（50∶50）为流动相；检测波长 360 nm，进样量 10
μL，体积流量 1 mL/min，柱温 30 ℃。理论塔板数
按槲皮素计算不低于 2 500。
2.1.2 对照品溶液的制备 分别取槲皮素、山柰素、
异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成分别
含 30、30、20 μg/mL 的混合溶液，作为对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 取银杏叶提取物干粉约
35 mg，精密称定，加甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）
25 mL，置水浴中加热回流 30 min，迅速冷却至室
温，转移至 50 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇
匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液。
2.1.4 样品测定 分别精密吸取对照品溶液与供试
品溶液各 10 μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算
槲皮素、山柰素和异鼠李素的量，按下式换算成总
黄酮苷的量。
总黄酮苷＝(槲皮素＋山柰素＋异鼠李素)×2.51
2.2 银杏叶总黄酮纯化方法
将银杏叶提取液（按料液比为 1∶10、80%乙
醇提取 3 次，提取时间分别为 2、1、1 h）加热浓缩
到一定质量浓度，调节浓缩液的 pH 值，经过大孔
树脂柱色谱，用一定体积分数乙醇洗脱色谱柱，分
离精制银杏叶总黄酮，收集乙醇洗脱液，浓缩至无
醇味，干燥，即得。
2.3 银杏叶总黄酮大孔树脂柱色谱参数的确定
2.3.1 树脂预处理方法 在树脂柱内加入高于树脂
层 10 cm 的 95%乙醇浸泡 4 h，放出浸液，用纯化
水清洗树脂柱，清洗至流出液澄清不浑浊，pH 值为
7，即可使用。
2.3.2 不同树脂对银杏叶总黄酮分离纯化的影响
为了选择较好的纯化银杏叶总黄酮的树脂，分别对
D-101、DM-130、AB-8、ADS-8、HPD-417、D-201
和聚酰胺树脂 7 种树脂进行对比试验。分别取 800
mL 银杏叶提取液（质量浓度 10 mg/mL），树脂用
量 500 mL 进行色谱纯化分离，7 种树脂分别进行 3
次平行试验，结果总黄酮的质量分数分别为
22.67%、24.43%、18.94%、17.25%、20.38%、14.56%、
10.39%。D-101 和 DM-130 树脂对分离纯化银杏叶
总黄酮效果最好。
2.3.3 D-101 和 DM-130 混合树脂对银杏叶总黄酮
分离纯化的影响 由“2.3.1”项结果可知，D-101
和 DM-130 两种型号的树脂用于分离纯化银杏叶总
黄酮效果较好，但是单独进行色谱分离，不能很好
地确保得到符合《中国药典》2010 年版要求的银杏
叶总黄酮的质量标准（银杏叶总黄酮质量分数≥
24%）[2]，因此对 D-101 和 DM-130 两种型号的树
脂进行进一步研究，将两者按照不同比例混合进行
色谱分离纯化银杏叶总黄酮。将 D-101 与 DM- 130
按比例 1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、0∶1
进行混合。分别取 800 mL 银杏叶提取液（10
mg/mL），混合树脂用量 500 mL 进行色谱分离纯化
银杏叶总黄酮，6 种不同比例的混合树脂分别进行 3
次平行试验，结果总黄酮的质量分数分别为
22.97%、25.43%、27.18%、26.02%、25.48%、24.79%。
表明D-101与DM-130按 1∶1混合得到的混合树脂
对分离纯化银杏叶总黄酮效果最好。
2.3.4 上样量对混合树脂吸附银杏叶总黄酮的影响
确定混合树脂用量为 500 mL，上样液银杏叶总黄酮
质量浓度为 10 mg/mL，分别量取 600、700、800、
900、1 000 mL 的上样液，控制上样体积流量为 2
BV/h，收集并测量，计算树脂的吸附量。结果吸附
量分别为 6.0、7.0、8.0、8.1、8.1 g，当上样体积为
800 mL，即上样量为 8.0 g 时，混合树脂对银杏叶
总黄酮的吸附能力最佳。
2.3.5 上样体积对混合树脂吸附银杏叶总黄酮的影
响 确定混合树脂用量为 500 mL，上样液中含有银
杏叶总黄酮为 8 g，分别配制成 600、700、800、900、
1 000 mL 不同体积进行上样，控制上样体积流量为
2 BV/h，收集并测量，计算树脂的吸附量，结果吸
附量分别为 6.0、7.5、7.9、7.8、7.5 g。当上样液体
积为 800 mL 时，混合树脂对银杏叶总黄酮的吸附
能力最好。
2.3.6 上样液质量浓度对混合树脂吸附银杏叶总黄
酮的影响 取一定量的原液（提取液浓缩到一定体
积后的银杏叶提取液），分别稀释到质量浓度分别为
6、7、8、9、10、11、12 mg/mL 的不同上样液，确
定上样体积为 800 mL，控制上样体积流量为 2
BV/h，收集流出液并测量，计算树脂的吸附量，结
果吸附量分别为 4.8、5.6、6.4、7.2、8.0、7.9、8.0 g。
当药液质量浓度为 10 mg/mL 时，混合树脂对银杏
叶总黄酮的吸附能力最大。
2.3.7 上样液 pH 值对混合树脂吸附银杏叶总黄酮
的影响 控制 75%乙醇吸附体积流量为 2 BV/h，上
样液质量浓度为 10 mg/mL，上样体积为 800 mL，分
别调节 pH 值为 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，
收集流出液并测量，计算树脂的吸附量，结果吸附
量分别为 5.8、6.2、7.2、7.8、7.9、7.9、7.5 g。当
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pH 值控制在 6.0 时，树脂对银杏叶总黄酮的吸附能
力最大。
2.3.8 不同体积分数乙醇对银杏叶总黄酮洗脱量的
影响 准确量取上样液体积 800 mL，上样液质量浓
度为 10 mg/mL，洗脱体积流量为 2 BV/h，分别配
制成 60%、65%、70%、75%、80%、85%不同体积
分数乙醇 600 mL，洗脱树脂柱，收集流出液并测量，
计算树脂的洗脱量，结果洗脱量分别为 6.3、7.0、
7.5、7.8、7.8、7.7 g。当采用 75%、80%乙醇进行
洗脱时，银杏叶总黄酮洗脱较彻底，综合考虑成本
因素，故选择 75%乙醇为洗脱剂。
2.3.9 不同体积洗脱剂对银杏叶总黄酮洗脱量的影
响 确定上样体积 800 mL，上样液质量浓度为 10
mg/mL，洗脱体积流量为 2 BV/h，乙醇体积分数为
75%，准确量取 450、500、550、600、650、700 mL
不同体积的乙醇溶液洗脱树脂柱，收集流出液并测
量，计算树脂的洗脱量，结果洗脱量分别为 6.2、7.1、
7.6、7.8、7.9、7.8 g。当 75%乙醇的体积为 600 mL
时，对银杏叶总黄酮的洗脱较为彻底。
2.3.10 不同洗脱体积流量对银杏叶总黄酮洗脱量
的影响 取质量浓度为 10 mg/mL，体积为 800 mL
的上样液，用 75%乙醇解吸，分别控制洗脱体积流
量为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 BV/h 对大孔树脂
柱进行洗脱，收集流出液并测量，计算树脂的洗脱
量，结果洗脱量分别为 3.1、4.5、6.8、7.8、7.8、7.9
g。当 75%乙醇解吸体积流量控制在 2.0 BV/h 时，
树脂对银杏叶总黄酮的洗脱能力最大。
2.4 银杏叶总黄酮提取物最佳纯化工艺的确定
为了确定银杏叶总黄酮提取物的最佳提取工
艺，准确量取体积为 800 mL 的银杏叶提取液（银
杏叶总黄酮质量浓度 10 mg/mL），75%乙醇洗脱剂
体积为 600 mL，以上样液质量浓度（A）、洗脱体
积流量（B）、上样液 pH 值（C）3 因素作为试验因
子，总黄酮收集量为指标进行 L9(34) 正交试验。因
素水平及银杏叶总黄酮正交试验结果见表 1，方差
分析见表 2。

表 1 银杏叶总黄酮提取物 L9(34) 正交试验设计与结果
Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test for total flavonoids extract in leaves of G. biloba
试验号 A / (mg·mL−1) B / (BV·h−1) C D（误差） 收集量 / g
1 9 (1) 1.5 (1) 5.0 (1) (1) 6.53
2 9 (1) 2.0 (2) 5.5 (2) (2) 6.89
3 9 (1) 2.5 (3) 6.0 (3) (3) 6.95
4 10 (2) 1.5 (1) 5.5 (2) (3) 7.45
5 10 (2) 2.0 (2) 6.0 (3) (1) 7.81
6 10 (2) 2.5 (3) 5.0 (1) (2) 7.63
7 11 (3) 1.5 (1) 6.0 (3) (2) 7.37
8 11 (3) 2.0 (2) 5.0 (1) (3) 7.58
9 11 (3) 2.5 (3) 5.5 (2) (1) 7.63
K1 20.37 21.35 21.74 21.97
K2 22.89 22.28 21.97 21.89
K3 22.58 22.21 22.13 21.98
R 2.52 0.93 0.39 0.09

表 2 方差分析
Table 2 Analysis of variance
误差来源 偏差 自由度 F 值 显著性
A 1.259 2 626.500 P＜0.001
B 0.179 2 89.500 P＜0.05
C 0.026 2 13.000
D（误差） 0.002 2
F0.05(2, 2)＝19.00 F0.01(2, 2)＝99.00
由表 1 和 2 可知，R 值由大到小依次为上样液
质量浓度＞洗脱体积流量＞上样液的 pH 值，方差
分析结果表明，因素 A 具有极显著影响（P＜0.001），
因素 B 具有显著影响（P＜0.05）。上述 3 个因素对
银杏叶总黄酮提取物纯化的影响程度为上样液质量
浓度＞洗脱体积流量＞pH 值，其最佳试验方案为
A2B2C3，即用 DM-130 和 D-101 大孔树脂柱（比例
为 1∶1）混合树脂 500 mL 装柱，600 mL 75%乙醇
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洗脱的前提下，洗脱体积流量为 2.0 BV/h，pH 值
6.0，银杏叶总黄酮质量浓度为 10 mg/mL，上柱体
积为 800 mL。
2.5 验证试验
以 A2B2C3 作为优化银杏叶总黄酮纯化工艺条
件，为了确定上述试验结果，需要按照 A2B2C3 的工
艺条件重复试验 5 次，准确称取银杏叶 6 000 g（银
杏叶总黄酮质量分数为 0.82%），按料液比为 1∶10、
75%乙醇提取 3 次，提取时间分别为 2、1、1 h，浓
缩提取液到 500 mL，质量浓度为 88 mg/mL，检测
其浓缩液中银杏黄酮质量分数为 8.53%，分别配制
成 5 份满足工艺条件所需的上柱溶液，按最佳纯化
工艺参数操作。结果银杏叶总黄酮收集量分别为
7.56、7.50、7.45、7.52、7.40 g，平均收集量为 7.48
g，RSD 为 1.7%，银杏叶总黄酮质量分数为 25.4%，
平均得率为 93.5%。该工艺条件下重复性良好。
3 讨论
本实验研究了银杏叶黄酮提取物纯化工艺的优
化条件，摸索了比较完整的适合工业化生产的银杏
叶总黄酮提取物工艺条件。最佳工艺为在混合树脂
500 mL 装柱，600 mL 75%乙醇洗脱的前提下，洗
脱体积流量为 2.0 BV/h，pH 值 6.0，银杏叶总黄酮
质量浓度为 10 mg/mL，过 DM-130 和 D-101 混合大
孔树脂柱（比例为 1∶1），避免了大孔树脂柱色谱
时进行不同体积分数乙醇分步洗脱的过程，简化了
生产操作的步骤，同时也降低了生产成本和生产周
期，通过 75%乙醇一步洗脱混合大孔树脂柱，对树
脂柱内的银杏叶黄酮进行解析，收集洗脱液，浓缩
干燥即得银杏叶黄酮提取物，该银杏叶黄酮提取物
中所含的银杏叶黄酮大于 24%，符合《中国药典》
2010 年版对银杏叶黄酮的规定。
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