全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 21 期 2013 年 11 月

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• 药材与资源 •
阳春砂二酮辅酶 A 合成酶的基因克隆及序列分析
杨恩泽 1，高 辉 1，吴秋红 1，王 峰 1, 2*
1. 暨南大学药学院，广东 广州 510632
2. 中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室，广东 广州 510632
摘 要：目的 对阳春砂姜黄素生物合成途径的关键酶二酮辅酶 A 合成酶（diketide CoA synthase，DCS）基因的编码 cDNA
序列进行克隆，为研究阳春砂姜黄素生物合成与基因调控奠定基础。方法 结合阳春砂的转录组注释，根据编码区序列设计
引物，通过 PCR 方法克隆阳春砂 DCS 基因的编码区 cDNA。结果 PCR 扩增了一个长 1 170 bp 的基因片段，该片段编码由
389 个氨基酸组成的 DCS。同源性比对结果显示基因编码蛋白与姜黄的 DCS 具有氨基酸一致性达 96%，与水仙等植物的查
耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）氨基酸一致性达 66%～69%。进化树分析结果显示，与姜黄 Curcumae Longae 具有较近
的亲缘关系。结论 首次从阳春砂中克隆 DCS 基因获得其编码区序列，为分析基因表达特性及其在姜黄素生物合成中的功
能奠定基础。
关键词：二酮辅酶 A 合成酶；阳春砂；基因克隆；序列分析；姜黄素
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)21 - 3037 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.21.018
Gene cloning and sequence analysis of diketide CoA synthase in Amomum villosum
YANG En-ze1, GAO Hui1, WU Qiu-hong1, WANG Feng1, 2
1. College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China
2. Guangdong Province Key Laboratory of Pharmacodynamic Constituents of TCM and New Drugs Research, Jinan University,
Guangzhou 510632, China
Abstract: Objective To clone the full length cDNA encoding diketide CoA synthase (DCS) gene which plays an important role in
curcumin biosynthesis pathway in Amomum villosum, and to provide the basis for the further studies on biosynthesis and gene regulation
of curcumin. Methods According to the annotation of root transcriptome of A. villosum, primers were designed and cDNA of DCS gene
was cloned from A. villosum by PCR. Results The complete coding sequence of DCS gene was 1 170 bp and it encoded a protein of 389
amino acids. The deduced DCS amino acid sequence exhibited 96% identity to the DCS of Curcumae Longae and 66%—69% identity to
the chalcone synthase (CHS) of Narcissus tazetta. Phylogenetic analysis on the amino acid sequence of DCS with those of other plants
showed that DCS was closely related to Curcumae Longae. Conclusion The DCS gene is cloned from A. villosum for the first time. This
research lays a foundation for studying the gene expression pattern and regulatory functions of DCS in curcumin biosynthesis.
Key words: diketide CoA synthase (DCS); Amomum villosum Lour.; gene cloning; sequence analysis; curcumin

阳春砂仁为姜科豆蔻属植物阳春砂 Amomum
villosum Lour. 的干燥成熟果实，是广东省阳春市地
道特产南药，是我国四大南药之一。阳春砂的花、
果、根、茎均可入药，其中以果实为主。砂仁，性
辛、温，入脾、肺、膀胱、大小肠。具有化湿开胃、
温脾止泻、理气安胎之功效，用于湿浊中阻、脘痞
不饥、脾胃虚寒、呕吐泄泻、胎动不安等症[1-4]。阳
春砂仁含有多种有机酸、单萜、黄酮、甾醇及苯丙
素类等，为新药研究提供大量资源[5]。
二酮辅酶 A 合成酶（diketide-CoA synthase，DCS）
属于植物类型 III 聚酮化合物合酶超家族（plant-
specific type III polyketide synthasesuperfamily，type III

收稿日期：2013-06-15
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30700704）
作者简介：杨恩泽（1990—），男，硕士研究生，从事生物制药研究。E-mail: 160714351@qq.com
*通信作者 王 峰，博士，副教授，从事生物制药研究。E-mail: 24547680@qq.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 21 期 2013 年 11 月

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PKS）。DCS 用于催化丙二酰辅酶 A（malonyl-CoA）
与阿魏酰辅酶 A（feruloyl-CoA）或对香豆酰辅酶 A
（p-coumaroyl-CoA）缩合生成阿魏酰二酮辅酶 A 或
对香豆酰二酮辅酶 A，为姜黄素类化合物合成的中
间产物。在聚酮化合物生物合成起始反应中行使着
关键的作用，决定着化合物基本分子骨架的建成和
代谢途径中碳硫走向，是植物聚酮化合物生物合成
途径的关键酶和限速酶[6-7]。
DCS 被发现与另一种姜黄素合酶（curcumin
synthase，CURS）共同作用时可大大提高姜黄素的
产量。而姜黄根粉末具有抗炎、抗氧化、抗癌作用，
口服用来治疗消化不良、胃胀气、肝脏和尿道疾病。
这些药用特性依赖于姜黄素类化合物，包括姜黄素、
去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素。目前已经从
姜黄根中分离并克隆了 DCS 基因，对阳春砂 DCS
基因的克隆未见文献报道[8]。
本实验克隆了阳春砂 DCS 基因，并通过生物信
息学方法初步分析了酶的结构特点和功能，这为进
一步研究重组阳春砂 DCS 的体外活性以及后期的
转基因研究和聚酮类化合物生物合成与基因调控奠
定了基础。
1 材料
样品由本实验室栽培，经中山大学周仁超副教
授鉴定为阳春砂 Amomum villosum Lour.；PCR 纯化
试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科
技公司；Ex Taq 聚合酶、pMD-18T、cDNA Synthesis
Kit 购自 Takara 公司；抗生素购自鼎国公司；引物
合成于上海英骏公司；其他试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 引物设计
根据本实验室已获得的阳春砂转录组序列，按照
引物设计原则，采用引物设计软件 Primer 6.0，对阳
春砂转录组序列中的 DCS 基因序列设计引物。正向
引物：5’-ATGGAAGTGAACGGCTACCGCATG-3’，
反向引物：5’-CTAGTTCAGTCTGCAACTATGGAGG-3’。
2.2 RNA 提取及反转录
阳春砂叶片 RNA 的提取采用改良后的 CTAB
法进行。总 RNA 的完整性和纯度通过 EB-琼脂糖凝
胶电泳和核酸蛋白定量仪（Bio-Rad）检测。取 1 μg
总 RNA，以 Oligo（dT）为引物，按 M-MLV RTase
cDNA Synthesis Kit 说明操作，反转录生成 cDNA。
2.3 PCR 扩增及克隆
PCR 反应体系为：10×缓冲液 8 μL，10 mmol/L
dNTP 8 μL，20 μmol/L 正向引物 2 μL，20 μmol/L
反向引物 2 μL，cDNA 模板 1 μL，Ex Taq 聚合酶
4 μL，加水至 80 μL。PCR 反应条件为：94 ℃预
变性 5 min 后，进行 32 个循环：94 ℃变性 30 s，
60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 10 s，最后 72 ℃
延伸 7 min。扩增产物经 0.8%琼脂糖凝胶电泳分
析，胶回收纯化后连接至 pMD-18T 载体，并采用
CaCl2 法转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，涂布于
含有氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）的 LB 培养
基平板，37 ℃培养过夜。所得转化子用质粒小提
试剂盒提取质粒 DNA，重组子经质粒 PCR 鉴定
后送交上海英骏公司测序。
2.4 DCS 序列生物信息学分析
分析测序结果，推导开放读码框架（open
reading frame，ORF）及编码蛋白的氨基酸序列，
利用 ProtParam、DAS TMfilter 和 ProtScale 进行编
码蛋白的各种基本理化特性、跨膜结构域和疏水性
分析，利用 NCBI（www.ncbi.nih.gov）的 BLAST
在线分析工具分别对 GenBank 的非冗余核酸数据
库和非冗余蛋白数据库序列进行比对分析。采用
Clustalx 和 Phylip-3.69 进行序列多重比较及系统进
化树构建。并用在线网站 Psipred 和 Phyre2 对该蛋
白进行二级结构和三维结构预测。
3 结果与分析
3.1 总 RNA 质量
取 2 μL 提取的样品 RNA 用 RNase-free 水稀释
10 倍，用蛋白核酸分析仪测定，A260/A280＝1.967，
该比值接近于 2.0，说明提取的 RNA 纯度较高。总
RNA 经电泳检测后可观察到清晰明亮的 28S rRNA
和 18S rRNA 条带以及一些细胞器 rRNA 条带，条
带都无拖尾，RNA 提取效果较好。
3.2 DCS 基因的克隆
RT-PCR 扩增产物经电泳后呈现出 1 条长约 1.2
kb 左右的单一特异性片段（图 1），其长度与预期大
小相符，经过测序得到了阳春砂 DCS 基因的编码序
列（图 2）。测序结果已提交至 GenBank，其登录号
是 KF225598。
3.3 序列生物信息学分析
测序所得阳春砂 DCS 基因的编码基因长 1 170
bp，其编码的 DCS 蛋白包含 389 个氨基酸残基，相
对分子质量 4.22×104，含量最丰富的氨基酸是Leu，
占 12.05%，含量最少的是氨基酸 Trp，占 1.03%。
理论等电点是 5.97。利用 SignalP 4.1 分析了阳春砂
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M-Marker 1-DCS PCR 扩增产物
M-Marker 1-DCS PCR amplification product
图 1 DCS 基因的 PCR 扩增
Fig. 1 PCR amplification of DCS gene
DCS 的信号肽序列，结果表明阳春砂 DCS 氨基酸
序列无信号肽，由此推测 DCS 基因在游离核糖体上
起始合成后，可能不进行蛋白转运，而是保留在细
胞质基质中直接催化二酮辅酶 A 的合成。用
DASTMfilter 在线工具对氨基酸序列的跨膜结构域
进行预测，结果表明 DCS 不存在跨膜结构域。进一
步证明，DCS 在细胞质基质中合成后，不经蛋白转
运，直接锚定于细胞质基质中的特定部位行使催化
功能。用 ProtScale 在线工具分析，DCS 疏水性最
强为 130 位 Ser（1.956），亲水性最强为 118 位 Arg
（−2.556）。整条多肽链表现为疏水性，但没有明显
的疏水区域。


图 2 DCS 基因的编码区序列和氨基酸序列
Fig. 2 Coding sequence and amino acid sequence of DCS gene
用 ClustalX 程序对 DCS 的氨基酸序列与姜黄
Curcuma longa L.的 DCS 氨基酸序列，小果野蕉
Musa acuminata 的植物类型三聚酮合酶 5（type III
PKS5）氨基酸序列，毛果杨 Populus trichocarpa、
荷兰百合 Lilium hybrid、矮牵牛 Petunia hybrida、
中国水仙 Narcissus tazetta var. chinensis、毛花洋
地黄 Digitalis lanata、花烟草 Nicotiana alata 的查
耳酮合酶（chalcone synthase, CHS）氨基酸序列
进行多序列对比。结果表明（图 3）：DCS 与姜黄
DCS 有 96%的同源性，与小果野蕉 type III PKS5
有 88%的同源性，与各类植物的 CHS 有 67%～
69%的同源性。DCS 拥有催化三联体 Cys163、
His302 、 Asn335 和 其 他 关 键 活 性 位 点 残 基
Phe214，以及植物类型三聚酮合酶的标签序列
GFGPG[9-10]。
为了进一步研究 DCS 与其他植物同源基
因的亲缘关系，用 Phylip-3.69 软件采用邻接距
离法（Neighbour-joining，NJ）构建系统发生
进化树（图 4），可以看出 DCS 与姜黄 C. longa、
小果野蕉 M. acuminata 亲缘关系较近。
运用 Psipred 在线工具预测阳春砂 DCS 蛋白的
二级结构，表明该蛋白含有 12 个 α 螺旋（alpha
helix），占 39.59%；12 个延伸链（extended strand），
占 16.45%；87 个无规则蜷曲（random coil），占
43.96%。利用 Phyre2 提交 DCS 蛋白序列，在蛋
白质结构库中搜寻模板，最终 DCS 与苜蓿的 CHS

1 M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1
91
181
271
361
451
541
631
721
811
901
991
1 081
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△-表示活性位点 ▲-表示标签序列
△-indicates active site ▲-indicates tag sequence
图 3 不同物种 DCS 同源氨基酸序列对比
Fig. 3 Comparison on homologous amino acid sequences of DCS for A. villosum and other species

图 4 不同物种 DCS 系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree based on DCS sequences
from different species
蛋白晶体结构（c1cmlA）序列一致性达到 64%，以
c1cmlA 为模板预测了 DCS 的三维模型（图 5），可
见催化三连体 Cys163、His302、Asn335 围成一个
空穴结构，反应在这个空穴中催化进行。

图 5 DCS 的三维模型
Fig. 5 3D model of DCS
4 讨论
DCS 用于合成具有二酮骨架结构的中间产物，
在姜黄素合成过程中先于 CURS 反应，为 CURS 催
化提供底物，与 CURS 共同作用可大大提高姜黄素
合成效率。由此可见 DCS 是植物聚酮化合物合成的
关键酶，在姜黄素合成过程中发挥极其重要的作用。
随着植物 DCS 基因的分离和克隆，利用酶表达进行
相关药用活性物质的体外合成或改变作物及中药品
矮牵牛 (CHS）
花烟草 (CHS)
毛花洋地黄 (CHS)
毛果杨 (CHS)
水仙 (CHS)
荷兰百合 (CHS)
阳春砂 (DCS)
姜黄 (DCS)
小果野蕉 (typeIII TPSS)


矮牵牛 (CHS）
花烟草 (CHS)
毛花洋地黄 (CHS)
毛果杨 (CHS)
水仙 (CHS)
荷兰百合 (CHS)
阳春砂 (DCS)
姜黄 (DCS)
小果野蕉 (typeIII TPSS)


矮牵牛 (CHS）
花烟草 (CHS)
毛花洋地黄 (CHS)
毛果杨 (CHS)
水仙 (CHS)
荷兰百合 (CHS)
阳春砂 (DCS)
姜黄 (DCS)
小果野蕉 (typeIII TPSS)


矮牵牛 (CHS）
花烟草 (CHS)
毛花洋地黄 (CHS)
毛果杨 (CHS)
水仙 (CHS)
荷兰百合 (CHS)
阳春砂 (DCS)
姜黄 (DCS)
小果野蕉 (typeIII TPS5)
20 40 60 80 100
120 140 160 180 200 220
240 260 280 300 320 340
360 380
389
389
386
391
390
394
389
389
389

99
53
78
79
68
100
100
69
70
80
67 100
33
46
39 98
79
100
100
圆叶葡萄(CHS)
白苏(CHS)
毛花洋地黄(CHS)
通泉草(CHS)
荷兰百合(CHS)
中国水仙(CHS)
小果野蕉(typeIII TPS5)
姜黄(DCS)
阳春砂（DCS）
紫高杯花(CHS)
马铃薯(CHS)
矮牵牛(CHS)
花烟草(CHS)
毛果杨(CHS)
莲(CHS)
黄蜀葵(CHS)
陆地棉(CHS)
月季(CHS)
草莓(CHS)
多蕊金丝桃(PksA)
元宝草(CHS)
Asn335
Phe214
His302
GFGPG 标签
序列
Cystic63
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质成为可能。
生物信息学的迅速发展为功能基因组学的研究
提供了更加便利的研究手段，利用生物信息学方法
对克隆的基因进行功能预测能起到事半功倍的效
果。目前，基于生物学试验数据与计算技术相结合
交叉学科已逐渐成为后基因组时代的重要方法和前
沿领域，也是当今生物学发展的必然潮流[11]。本实
验利用生物信息学方法对阳春砂 DCS 蛋白序列进
行同源序列比对、分析，并构建进化树，对其结构
和功能进行了预测。有助于揭示基因和物种的起源
与进化，发现 DCS 蛋白功能，利于进一步利用相应
的试验手段研究植物 DCS 的理化性质和分子生物
学性质，以及聚酮化合物合成路径。同源性分析有
助于发现新的 DCS 基因。而蛋白定位和功能结构域
的推断，对针对特定性状遗传改良的基因工程和代
谢工程操作，将 DCS 基因进行克隆对于提高中药活
性成分的量或作物品质具有十分重要的作用。
本研究首次从阳春砂中分离克隆 DCS 基因，该
基因在蛋白质水平上与姜黄 DCS 具有 96%相似性，
推测阳春砂 DCS 可能与姜黄 DCS 具有相同或相似
的生物学功能。为后期的实验研究提供了理论参考，
并为姜黄素的生物合成和调控奠定基础。
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