全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 20 期 2013 年 10 月 ·2859·
细柱五加茎多糖闪式提取工艺优化及其免疫活性研究
谢 霞 1, 2，李 芝 1, 2，黄玮超 1, 2，叶惠煊 1, 2，戴 玲 1, 2，刘向前 1, 2*
1. 湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208
2. 湖南省中药现代化研究重点实验室，湖南 长沙 410208
摘 要：目的 优化细柱五加茎多糖的闪式提取工艺，并研究其细胞毒性和免疫活性。方法 运用球面对称设计试验，综合
考虑料液比、提取温度、提取时间 3 因素，优化细柱五加茎多糖的闪式提取工艺；对闪式提取法与回流、超声 2 种传统提取
方法进行比较。通过体外试验对提取所得多糖的细胞毒性和免疫活性进行初步研究。结果 细柱五加茎多糖闪式提取最佳工
艺为料液比 1∶13.2，提取温度 80 ℃，提取时间 420 s。在此条件下，细柱五加茎中多糖提取率为 0.78%，且优于回流和超
声法提取所得多糖提取率。体外活性实验结果显示，细柱五加茎多糖质量浓度在 10～20 μg/mL 对 RAW 264.7 细胞无明显毒
性，在 10～40 μg/mL 能够促进 RAW 264.7 细胞 NO 的分泌。结论 建立了稳定、简便的细柱五加茎多糖的闪式提取工艺方
法, 初步研究了其多糖的免疫活性，为合理的开发细柱五加资源提供理论依据。
关键词：细柱五加；多糖；闪式提取法；球面对称设计；免疫活性
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)20 - 2859 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.20.013
Smashing tissue extraction technology optimization for polysaccharides from
stems of Acanthopanax gracilistylus and their in vitro immunological activities
XIE Xia1, 2, LI Zhi1, 2, HUANG Wei-chao1, 2, YE Hui-xuan1, 2, DAI Ling1, 2, LIU Xiang-qian1, 2
1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China
2. Hunan Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Modernization, Changsha 410208, China
Abstract: Objective To optimize the extraction process for polysaccharides from the stems of Acanthopanax gracilistylus by
smashing tissue extraction (STE) and to further investigate their cytotoxicity and immunological activities. Methods Extraction
process for the polysaccharides from the stems of A. gracilistylus was optimized by using the spherical symmetrical design test, and
three factors were considered (material-liquid ratio, extraction temperature, and extraction time). The test compared STE with two
traditional extraction methods, reflux extraction and ultrasonic extraction. The bioassay tests of cytotoxicity and immunological
activities on polysaccharides extracted were studied in vitro. Results The optimal extraction conditions for polysaccharides from the
stems of A. gracilistylus were as follows: material-liquid ratio was 1∶13.2, the extraction temperature was 80 , ℃ and the extraction
time was 420 s. With the best extraction conditions, the yield of polysaccharides from the stems of A. gracilistylus was 0.78%. The
yield by STE was higher than those by reflux extraction and ultrasonic extraction in this research. In addition, the bioassay results
showed the polysaccharides had no significant toxicity on RAW 264.7 cells at the dose of 10－20 μg/mL and facilitated the secretion of
nitric oxide (NO) in the cells supernatant at the dose of 10－40 μg/mL in vitro. Conclusion These results establish a steady and
convenient extraction technology for polysaccharides from the stems of A. gracilistylus using STE method, indicating the
polysaccharides have immunological activity to some extent, which provides a theoretical basis for the reasonable development of A.
gracilistylus resources.
Key words: Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith; polysaccharides; smashing tissue extraction; spherical symmetrical design;
immunological activity



收稿日期：2013-06-05
基金项目：湖南省自然科学基金重点项目（11JJ2042）；湖南中医药大学药物分析学“十二五”校级重点学科建设项目
作者简介：谢 霞（1985—），女，湖南长沙人，湖南中医药大学药学院天然药物化学方向研究生。Tel: 13787288563 E-mail:329988803@qq.com
*通信作者 刘向前，男，教授，硕士研究生导师。E-mail: lxq0001cn@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 20 期 2013 年 10 月 ·2860·
《中国药典》2010 年版收载的五加皮为五加科
五加属植物细柱五加 Acanthopanax gracilistylus W.
W. Smith 的干燥根皮，具有祛风除湿、补益肝肾、
强筋壮骨、利水消肿的功效。现代药理研究表明五
加属植物细柱五加和刺五加的根皮多糖、红毛五加
的茎皮多糖具有抗癌活性，无梗五加果多糖具有抗
疲劳活性等[1]。NO 作为细胞间和细胞内重要的信使
分子，起着免疫效应分子和免疫调节剂的作用。因
此，NO 的分泌是巨噬细胞被激活的重要标志，是
巨噬细胞产生免疫效应的重要步骤。通过体外刺激
巨噬细胞产生NO可以判别多糖的体外免疫活性[2]。
细柱五加作为正品五加皮的原植物，使用历史
悠久[3]，应用广泛。但对细柱五加茎多糖的研究几
乎未见报道。作为系统研究细柱五加的一部分[4]，
本研究采用球面对称设计法[5]优化细柱五加茎多糖
的闪式提取工艺[6-7]，并采用 MTT 法测定多糖对
RAW 264.7 细胞毒性，以及观察其对脂多糖（LPS）
诱导的 RAW 264.7 小鼠巨噬细胞 NO 分泌的影响。
1 仪器与材料
JHBE—20A 型闪式提取器（北京金鼐科技有限
公司）；UV—1750 紫外可见分光光度计（日本岛津
公司）；高速冷冻离心机（德国 Beckman 公司）；
AUW220D 分析天平（日本岛津公司）；AS 3120A
型超声波清洗仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；
透析袋 MD7044（上海源叶生物科技有限公司）；超
净工作台（美国 LABCONCO 公司）；二氧化碳培
养箱、−70 ℃超低温冰箱（美国 Thermo 公司）；
Olympus 显微镜（日本理光集团）；96 孔板（美国
Corning 公司）；予华 HH—S 型水浴锅（巩义市英
峪予华仪器厂）。
细柱五加茎于2012年8月采自湖南省长沙市近
郊，经湖南中医药大学药学院刘向前教授鉴定为细
柱五加 Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith 茎，
自然干燥后，粉碎成粗粉（过 24 目筛）备用。标本
（标本号为 120815）保存于湖南省重点实验室中药
新药研究与开发实验室。葡萄糖对照品（中国药品
生物制品检定所，AR 级，批号 150623-200901，质
量分数≥98%）；所用其他试剂均为国产分析纯；蒸
馏水自制。RAW 264.7 巨噬细胞株由韩国细胞株银
行供应；DMEM 培养基、新生牛血清（FCS，美国
Invitrogen 公司）；青链霉素、胰酶、MTT 细胞毒性
分析试剂盒（美国 Life Technologies，Grand Island
公司），Griess 试剂（美国 Sigma 公司）。
2 方法与结果
2.1 细柱五加茎多糖提取工艺
称取一定量的细柱五加茎粗粉（过 24 目筛），
加蒸馏水适量，一定条件下闪式提取 2 次，离心，
得上清液，浓缩成浸膏。浸膏加水充分溶解，离心
除去不溶物，上清液加乙醇至乙醇体积分数为 80%，
静置 24 h，离心分离。醇沉物加水复溶，加入等体
积的 Savage 试剂（氯仿-正丁醇 3∶1）除蛋白。向
除完蛋白后的溶液中加入 3% 质量浓度的 H2O2（比
例为 4∶1）脱色，然后溶液装入透析袋流水透析除
去小分子物质。最后醇沉得到醇沉物，用无水乙醇、
丙酮、乙醚依次洗涤，低温真空干燥得到细柱五加
茎多糖粉末。
2.2 多糖提取率的测定[8]
2.2.1 对照品溶液的配制 葡萄糖对照品 105 ℃
恒温干燥到恒定质量，精密称取 125.1 mg，配成 100
mL 溶液，即得质量浓度为 1.251 mg/mL 葡萄糖对
照品溶液，备用。
2.2.2 线性关系考察 分别取葡萄糖对照品溶液
1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL 置 100 mL
量瓶中，分别定容至刻度，摇匀。上述溶液分别取
2.00 mL，置于具塞试管中，加入 1.00 mL 5%的苯
酚溶液中，再快速加入 5.00 mL 浓硫酸。室温静置
5 min，40 ℃水浴中加热 30 min，取出，冰水浴至
室温。于葡萄糖最大吸收波长 490 nm 处测吸光度
（A）值，蒸馏水做空白试验。以 A 值为纵坐标（Y），
质量浓度为横坐标（X），进行线性回归，得出回归
方程 Y＝12.762 X＋0.006 8，R2＝0.999 4，线性范围
12.5～75.1 μg/mL（r＝0.999 7）。
2.2.3 多糖提取率的测定 精密称取干燥至恒定质
量的细柱五加茎多糖 100 mg，置 250 mL 量瓶中，
蒸馏水溶解并定容。从中移取 1.00 mL 置 100 mL
量瓶中，蒸馏水定容，取 2.00 mL 溶液置于具塞试
管中，按“2.2.2”项中方法操作，490 nm 处测定 A
值，根据回归方程计算多糖液中葡萄糖的质量浓度。
再按如下公式计算细柱五加茎多糖提取率［多糖提
取率＝CDM / (WM0)］，其中 C 为溶液中葡萄糖的质
量浓度（mg/mL），D 为稀释倍数，W 为称取的多糖
质量（mg），M 为每一份药材所提取到的粗多糖粉
末质量（g），M0 为药材质量（g）。
2.3 球面对称法设计试验与结果
通过参考相关文献报道[9]和预试验，选取料液
比（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）为考察
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 20 期 2013 年 10 月 ·2861·
因素，以细柱五加茎多糖提取率（Y）为考察指标，
设计球面对称试验。由于提取次数只能是整数，球
面对称设计方法无法将提取次数作为考察因素，参
考孟庆艳等[10]筛选红毛五加茎多糖提取工艺的最
佳提取次数 2 次。因此本试验中每份药材提取次数
固定为 2 次。
取细柱五加茎药材粗粉（过 24 目筛）50 g，精
密称定，按球面对称试验设计方法和“2.1”中操作
制备多糖。因素水平见表 1，球面对称试验设计见
表 2。
使用 DPS 7.55 软件拟合回归方程，将求得的系
数代入细柱五加茎多糖提取率（Y）与料液比（X1）、
提取温度（X2）、提取时间（X3）之间的二项关系式

表 1 因素水平表
Table 1 Factors and levels
因 素 水平
X1 / (g·mL−1) X2 / ℃ X3 / s
− 3 1∶6 20 60
−1 1∶7.7 33 138
0 1∶10 50 240
1 1∶12.3 67 342
3 1∶14 80 420

表 2 球面对称试验设计及试验值与拟合值的比较 (n＝3)
Table 2 Spherical symmetric design and comparison
between test values and fitting values (n＝3)
试验号 X1 X2 X3
提取
率 / %
拟合
值 / %
拟合误
差 / %
1 −1 −1 −1 0.08 0.08 0
2 −1 −1 1 0.15 0.15 0
3 −1 1 −1 0.26 0.27 −0.01
4 −1 1 1 0.33 0.40 −0.07
5 1 −1 −1 0.17 0.17 0
6 1 −1 1 0.21 0.23 −0.02
7 1 1 −1 0.36 0.42 −0.06
8 1 1 1 0.46 0.51 −0.05
9 − 3 0 0 0.16 0.15 0.01
10 3 0 0 0.35 0.32 0.03
11 0 − 3 0 0.18 0.21 −0.03
12 0 3 0 0.59 0.59 0
13 0 0 − 3 0.11 0.10 0.01
14 0 0 3 0.28 0.25 0.03
15 0 0 0 0.19 0.21 −0.02
中，得Y＝0.513 476 87－0.037 106 66 X1－0.021 212 89
X2＋5.460 3×10−4 X3＋2.195 20×10−3 X12＋2.363 5×
10−4 X22－6.6×10−7 X32＋3.295 8×10−4 X1X2－4.82×
10−6 X1X3＋4.61×10−6 X2X3；r＝0.978 867，F＝
12.729 0，P＝0.006 0，S 余＝0.049 453 13，F*(9, 5)＝
4.77（*P＜0.05）。显然，试验拟合方程的 F＞F*，
因此拟合回归方程是成立的。考察指标多糖提取率
值与拟合值比较见表 2。数据表明试验值与拟合值
非常接近，球面对设计模型对评价指标的拟合较为
成功。
当料液比 1∶14≤X1≤1∶6，提取温度 20≤
X2≤80，提取时间 60≤X3≤420 时，根据上述拟合
回归方程计算出优化条件：料液比为 1∶13.2，提取
温度为 80 ℃，提取时间为 420 s。理论上在此优化
条件下，细柱五加茎多糖提取率为 0.81%。
为验证球面对称设计试验优化结果的准确性，
取细柱五加茎药材粗粉（过 24 目筛）50 g，精密称
定，按细柱五加茎最佳闪式提取工艺进行 3 次验证
试验，同时通过回流提取法[10]和超声提取法[11]提取
细柱五加茎多糖进行对比试验。回流提取料液比为
1∶14，提取温度为 90 ℃，提取 2 次，每次 120 min。
超声提取料液比为 1∶14，提取温度为 60 ℃，提取
2 次，每次 90 min。其余操作同“2.1”项，结果见
表 3。闪式提取法、回流提取法、超声提取法多糖
平均提取率分别为 0.78%、0.26%、0.36%。其中闪
式提取法提取多糖提取率与理论拟合值相比相对误
差为 3.85%，可认为理论值与试验值近似相等。闪
式提取 420 s（7 min）明显比回流提取 120 min、超
声提取 90 min 的多糖提取率分别高出 200%、117%，
且重现性良好。
2.4 细胞毒性与体外免疫活性
取上述细柱五加茎多糖，测定其对 RAW 264.7
细胞毒性作用和对LPS诱导的RAW 264.7小鼠巨噬

表 3 验证试验结果
Table 3 Results of verification test
各提取方法提取率 / % 试验次数
闪式 回流 超声
1 0.77 0.26 0.37
2 0.75 0.26 0.35
3 0.79 0.25 0.36
平均提取率 / % 0.78 0.26 0.36
RSD / % 1.97 2.25 2.78
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细胞中 NO 分泌量的影响[12]。
2.4.1 细胞毒性实验 按 MTT 细胞毒性检测试剂
盒操作。取生长状态良好的 RAW 264.7 细胞接种于
96 孔板中，按梯度浓度将细柱五加茎多糖分别加入
96 孔板中（复孔，n＝3），使目标化合物的最终质
量浓度分别为 10、20、40 μg/mL，同时设置空白组
和调零组。24 h 后，每孔加入 10 μL MTT 溶液（5
mg/mL），在细胞培养箱内继续孵育 4 h，然后每孔
加入 100 μL DMSO 溶解液，直至 DMSO 全部溶解，
终止培养，震荡反应 10 min。在 570 nm 波长处测
定各孔 A 值[13]。实验重复 3 次，实验数据以 x ±s
表示。采用 DPS 7.55 软件对试验结果进行单因素方
差分析比较，P＜0.05 为有统计学意义。如图 1-A
所示，10～20 μg/mL 的细柱五加茎多糖处理 RAW
264.7 细胞 24 h 后，与空白组相比，10 μg/mL 组细
胞存活率具有显著差异（P＜0.05），且 10 μg/mL 的
细柱五加茎多糖可促进细胞生长；细柱五加茎多糖
质量浓度在 40 μg/mL 对 RAW 264.7 细胞具有一定
的细胞毒性作用。
2.4.2 免疫活性实验 取生长状态良好的 RAW
264.7 细胞接种于 96 孔板中，按梯度质量浓度将细
柱五加茎多糖分别加入 96 孔板中（复孔，n＝3），
使目标化合物的最终质量浓度分别为 10、20、40
μg/mL，1 h 后，每孔加入 10 μL LPS 溶液（0.5
μg/mL）；同时设置空白组和对照组。空白组既不使
用多糖处理，也不添加 LPS 溶液刺激；对照组不使
用多糖处理，加同样剂量的 LPS 进行诱导。孵育 24 h
后，收集各组细胞培养上清液 100 μL，加入 Griess
试剂，室温避光孵育 10 min，在 540 nm 下测量其 A
值，检测 NO 的量[14-15]。实验重复 3 次，试验数据
以 x ±s 表示。采用 DPS 7.55 软件对试验结果进行
单因素方差分析比较，P＜0.05 为有统计学意义。
如图 1-B 所示，对照组产生的 NO 的量与空白组比
较显著提高（P＜0.05），细柱五加茎多糖在 10、20、
40 μg/mL 时使 NO 分泌量分别比对照组高出
11.93%、12.76%、9.83%，从不同程度上促进了 NO
的分泌，提示细柱五加茎多糖对巨噬细胞的免疫功
能具有一定的激活作用。
3 讨论
通过优化和验证性试验确定了最佳闪式提取
工艺为料液比 1∶13.2，提取温度 80 ℃，提取时
间 420 s，在此条件下多糖的提取率为 0.78%；另外，
通过与传统提取方法比较，表明闪式提取法不仅节






与空白组比较：*P＜0.05
*P < 0.05 vs blank group

图 1 细柱五加茎多糖对细胞活力 (A) 和 NO 分泌量 (B)
的影响 ( x ±s，n＝3)
Fig. 1 Influence of polysaccharides from stems of A.
gracilistylus on cell viability (A) and NO
secretory amount (B) ( x ±s, n＝3)

约时间和能源，而且在多糖提取率上也优于回流提
取法和超声提取法。体外实验结果提示细柱五加茎
多糖在 10～20 μg/mL 几乎无细胞毒性，在 40 μg/mL
浓度时具有一定的细胞毒性；且在 10～40 μg/mL
浓度范围内不同程度上促进 NO 的分泌，浓度在 20
μg/mL 时作用最强。实验结果提示细柱五加茎多糖
能刺激巨噬细胞释放 NO，具有一定的体外免疫活
性，但在使用上应考虑细胞毒性问题，其作用机制
有待进一步深入研究。
闪式提取的原理是高速机械剪切力和超速动态
分子渗滤作用，在一定的温度和溶剂条件下，将药
材破碎成微粒，使多糖成分迅速达到微粒组织的内
外平衡，具有快速高效、操作方便、节能降耗等很
多优点[16]。但若使用时间过长易导致电机过热烧
坏，本实验中闪式提取器每工作 30 s 停机休息 30 s。
机器高速转动产生一定的热量，尤其是静止时，贴
近破碎提取刀头的溶液温度有些许上升。为保证在
提取的过程中提取容器内整体溶液温度尽可能稳
定，本实验将提取溶液温度调节到试验所需温度，
并将提取容器置于恒温水浴中，使溶液温度基本控
细
胞
存
活
率
/
%

120
100
80
60
40
20
0 空白组 调零组 10 20 40
多糖 / (μg·mL−1)
25
20
15
10
5
0
N
O
的
量
/
μ
m
ol

空白组 对照组 10 20 40
多糖 / (μg·mL−1)
A
B
*
*
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制在±1 ℃内。
由于闪式提取法提取快速，而多糖为大分子物
质，不容易被提取完全，若在闪式提取前用提取溶
剂浸泡药材 30～60 min，提取多糖的效率应该更高。
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