全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 2 期 2011 年 2 月 • 358 •
霍山石斛细胞悬浮培养及条件优化
李 蕤，谭晓芳，陈 群，樊家荣
合肥学院 生物与环境工程系，安徽 合肥 230022
摘 要：目的 利用细胞悬浮培养技术生产霍山石斛单细胞，解决石斛药用植物资源短缺问题。方法 以霍山石斛叶片等外
植体为实验材料，通过不同的制备方法获得霍山石斛单细胞，研究霍山石斛细胞培养的多种影响因素，应用正交设计优化霍
山石斛细胞悬浮培养的条件。结果 在蔗糖 35 g/L，NH4NO3 1.3 g/L，pH 5.6，激素 IAA 0.4 mg/L，6-BA 1.0 mg/L，培养时
间 14～18 d，在此条件下培养的霍山石斛细胞数为 9.42×105个/mL。结论 经过 4 次继代培养后石斛细胞多为圆状或椭圆
状，细胞碎片减少。应用优化的细胞悬浮培养条件，能获得较大量的霍山石斛细胞。
关键词：霍山石斛；细胞悬浮培养；正交试验；培养条件；单细胞
中图分类号：R282.23 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)02 - 0358 - 05
Cell suspension culture of Dendrobium huoshanenes and its optimal conditions
LI Rui, TAN Xiao-fang, CHEN Qun, FAN Jia-rong
Department of Biological and Environmental Engineering, Hefei University, Hefei 230022, China
Abstract: Objective Single-cell of Dendrobium huoshanenes was cultured by using cell suspension culture for solving the problem
of resource shortage of medicinal plant D. huoshanenes. Methods The single-cell of D. huoshanenes was obtained by different
preparing ways, effects of various factors on cell growth were studied and the optimal growing conditions of cell suspension culture
were investigated by orthogonal design. Results Through the orthogonal test, the results indicated that the optimum conditions for
suspension culture of D. huoshanenes cell were as follow: is that the concentration of sucrose was 35 g/L , NH4NO3 was 1.3 g/L, pH
value was 5.6, the hormone IAA was 0.4 mg/L , 6-BA was 1.0 mg/L, the best culture time was 14－18 d. Under optimal culture
conditions, the concnentration of single cells in this test was 9.42×105 cell/mL. Conclusion After four successive subculture,
cellular morphology of D. huoshanenes shows circular shape or elliptic shape and the chip of cell is decreased. The higher
concentration of D. huoshanenes cell could be obtained by using the optimal growing conditions of cell suspension culture.
Key words: Dendrobium huoshanenes C. Z. Tang et S. J Cheng; cell suspension culture; orthogonal test; culture conditions; single cell

近年来，国内外对药用植物石斛进行了大量深
层次的开发，对石斛的需求量也越来越大，而多年
来石斛主要靠采收野生资源供药用和出口，由于野
生石斛繁殖很慢，自然更新能力很差，加之生态环
境的制约，人为过度采掘，致使野生资源日渐枯竭。
其中霍山石斛 Dendrobium huoshanense C. Z. Tang
et S. J Che 等名贵品种已成为日益稀少的濒危植
物，被国家列为重点保护的药材品种。石斛多糖具
有抗肿瘤、增强人体免疫等功效[1]。利用石斛单细
胞悬浮培养生产活性多糖是解决石斛资源短缺问题
的有效途径之一[2-3]。
利用石斛细胞悬浮培养生产次生代谢产物不仅
避免了化学合成的缺点，而且也克服了人工栽培中
的不足。通过对石斛细胞进行悬浮培养，可以改进
繁殖方法，从而满足人们食用、药用及保健作用等
的需求[3-4]。对霍山石斛的繁殖培养研究以往多以诱
导茎尖、茎段分生组织直接成苗的培养方式为其主
要途径。近年来，应用种子离体萌发诱导原球茎或
原球茎悬浮培养方式培养霍山石斛[5-6]已有报道。本
实验应用霍山石斛为起始培养材料，以其茎尖和茎
段为外植体，通过酶法和机械法获取单细胞，并进
行大量培养。该培养方法可明显缩短霍山石斛生长
繁殖周期，更宜于后期的有效成分提取等工业生产
步骤，对解决石斛资源短缺问题具有重大意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
霍山石斛幼苗由安徽华艺兰业兰科植物生产
基地提供，经合肥学院陈群教授鉴定为霍山石斛

收稿日期：2010-04-14
基金项目：安徽省高校自然科学基金研究项目(KJ2009B244Z)
作者简介：李 蕤（1959—），女，安徽省合肥人，副教授，研究方向为细胞工程。 E-mail: lirui@hfuu.edu.cn
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Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J Che，液体
培养基为改良的 MS；碳源：蔗糖、葡萄糖；氮源：
NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、脲，均由天津化学试剂
厂生产；植物生长调节剂：IAA、6-BA，均由上海
化学试剂有限公司生产。所有试剂均为分析级。
1.2 实验方法
1.2.1 外植体灭菌[7] 取霍山石斛幼茎段冲洗干净，
70%酒精浸 1 min 后无菌水冲洗 5 次，转入 0.1%
HgCl2加 1 滴聚山梨酯 80 消毒 10 min 后，无菌水冲
洗 5 次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水后待用。
1.2.2 霍山石斛单细胞的制备[8] 取霍山石斛灭菌后
的外植体，采用组织匀浆机匀浆（或酶解法或玻璃珠
捣碎法），滤过，离心，获得霍山石斛单细胞悬浮液。
1.2.3 培养基的选择 以 MS 为基本培养基，pH
5.0～6.0；6-BA/IAA 的配比分别为 2.0︰0.4、1.0︰
0.4、0.5︰0.4、1.0︰0.2 和 1.0︰0.1（mg/L）；添加
物为香蕉泥。
1.2.4 接种与培养 用移液器移取 3 mL 霍山石斛
单细胞悬浮液注入各个培养瓶内，同时用超滤器向
每瓶内各滴入不同质量浓度的 IAA 和 6-BA 组合，
将已接种的三角瓶置于（25±2）℃，180 r/min 的
恒温摇床中进行黑暗培养[9]。
2 结果
2.1 不同提取方法对获取霍山石斛单细胞的影响
本实验获取霍山石斛单细胞主要用了 3 种方
法：机械匀浆组织破碎提取法、酶解法和玻璃珠捣
碎法。3 种方法得到的细胞数分别为：7.73×105、
1.19×106、1.54×106个/mL，说明玻璃珠捣碎法效
果最好，本实验的操作均采用玻璃珠捣碎法。
2.2 碳源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响
分别选用蔗糖和葡萄糖作为碳源对霍山石斛细
胞进行悬浮培养，实验结果表明，蔗糖培养的石斛
细胞数目为 1.13×106 个/mL，葡萄糖培养的石斛细
胞数目为 6.93×105 个/mL。蔗糖比葡萄糖更适宜石
斛细胞的培养，故用蔗糖作为碳源；同时又用不同
质量浓度蔗糖对霍山石斛细胞培养，结果如图 1 所
示。由图可知随着蔗糖质量浓度的增加，细胞数随
之增加，当蔗糖质量浓度增至 30 g/L 时，细胞数达
到最大；但如果蔗糖质量浓度继续增大，细胞数呈
递减趋势。
2.3 氮源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响
实验选用了 4 种不同氮源对霍山石斛细胞进行
悬浮培养，结果见图 2。由图可知，以 NH4NO3 为
氮源培养的石斛细胞数为 8.15×105 个/mL。故用
NH4NO3 作为氮源，优势最为明显。
2.4 pH 对霍山石斛细胞培养的影响
培养基的 pH 值与细胞的生长繁殖关系密切，
在培养过程中过酸或过碱可导致细胞死亡，这主要
与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关[4]。植物
细胞培养的 pH 一般控制在微酸性的范围内，即 pH
为 5.0～6.0[5]。本实验考察不同 pH 对霍山石斛细胞
数目的影响，结果如图 3 所示。由图可看出在 pH
为 5.6 时，霍山石斛单细胞数最多，为 9.58×105
个/mL。所以最适 pH 为 5.6。
2.5 培养时间对霍山石斛细胞悬浮培养的影响
霍山石斛细胞在营养充足的情况下，开始快速

图 1 蔗糖浓度对石斛细胞悬浮培养的影响
Fig. 1 Effect of concentration of sucrose on cell
suspension culture of D. huoshanenes

图 2 氮源对石斛细胞悬浮培养的影响
Fig. 2 Effect of nitrogen-source on cell suspension
culture of D. huoshanenes

图 3 pH 值对石斛单细胞培养的影响
Fig. 3 Effect of pH value on single-cell
culture of D. huoshanenes
NH4Cl 脲 NH4NO3 NaNO3
10
8
6
4
2
0细
胞
数
目
/(×
10
5
个
·m
L−
1 )

5 5.2 5.4 5.6 5.8 6
pH
12
10
8
6
4
2
0
细
胞
数
目
/(×
10
5
个
·m
L−
1 )

10 20 30 40 50
蔗糖质量浓度/(g·L−1)
10
8
6
4
2
0
细
胞
数
目
/（
×
10
5
个
·m
L−
1 ）
氮源
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地有丝分裂，细胞的数目随着时间的变化而变化。
通过培养、观察、计数，得到其数目变化的结果见
图 4。由图可知，在前 12 d，石斛细胞进行迅速的
有丝分裂；到第 14 天有丝分裂开始缓慢，并趋于稳
定达到最大值 1.673×106 个/mL；18 d 以后逐渐呈
下降趋势。因此最佳培养时间为 14～18 d。








图 4 培养时间对石斛细胞培养的影响
Fig. 4 Effect of culture time on cell culture
of D. huoshanenes
2.6 不同激素配比对霍山石斛细胞悬浮培养的影响
在植物细胞培养的过程中激素的种类及其比
例都对植物细胞的生长、繁殖、分化、发育和新
陈代谢起重要调节控制作用。取 6-BA/IAA 分别
为 2.0︰0.4、1.0︰0.4、0.5︰0.4、1.0︰0.2 和 1.0︰
0.1 不同配比（mg/L），进行培养，结果如图 5 所示。
从图中可以看出，当 6-BA-IAA 为 1.0︰0.4 时，获
得了最好的效果，培养所得细胞数最多，为 9.73×
105 个/mL。

图 5 激素配比对霍山石斛细胞悬浮培养的影响
Fig. 5 Effect of growth hormone ratio on cell
suspension culture of D. huoshanenes
2.7 培养温度对石斛细胞悬浮培养的影响
培养温度与细胞的生长繁殖关系密切。不同培
养温度下获得的石斛细胞数目结果如图 6 所示。
在其他条件均相同的情况下，当培养温度调
控在（25±2）℃时，石斛细胞数目为 1.019×106

图 6 培养温度对石斛细胞培养的影响
Fig. 6 Effect of culture temperature on cell
suspension culture of D. huoshanenes
当培养温度调控在（35±2）℃时，培养的石斛细
胞数目为 6.15×105 个/mL。故培养的最适温度是
（25±2）℃。
2.8 正交试验的设计与结果
根据以上单因素优化的结果，选取影响霍山石
斛细胞培养的 4 个主要因素，采用 L9（34）正交
试验，考察 pH 值（A）、碳源（B）、氮源（C）和
激素配比（D），结果见表 1。
表 1 正交试验因素水平表
Table 1 Levels and factors of orthogonal test
因素
水平
A B/(g·L−1) C/(g·L−1) D/(6-BA︰IAA)
1 5.4 25 1.30 2.0
2 5.6 30 1.65 2.5
3 5.8 35 2.00 3.0

个/mL。按正交试验设计，配制不同的培养基，接
种后在温度（25±2）℃，转速 120 r/min 条件下培
养，结果见表 2。对霍山石斛细胞培养条件进行 L9
（34）试验，结果表明：4 个因素对石斛细胞的生长
影响顺序依次是 B＞D＞A＞C，即碳源＞激素配比＞
pH＞氮源。蔗糖 35 g/L，NH4NO3 为 1.3 g/L，pH 为
5.6，激素配比 6-BA/IAA 为 1.0︰0.4 组合的培养细
胞数最多，为 9.42×105个/mL。
2.9 石斛细胞传代培养
本实验在原代悬浮培养霍山石斛细胞 14 d 后，
对石斛细胞进行了第 1 次传代培养，即将原代细胞
从培养箱中取出，静置 10 min，然后在超净工作台
上取 5 mL 原代培养上清液注入到含有香蕉泥的完
全培养基中，继续培养。随后每隔 10 d 传代 1 次，
共传代 4 次，以此来建立细胞系。传代后的细胞长
势较原代不同，最大特点就是细胞较圆，可见细胞
25±2
15
10
5
0
细
胞
浓
度
/(×
10
5
个
·m
L−
1 )

35±2
0
2
4
6
8
10
2.0︰0.4 1.0︰0.4 0.5︰0.4 1.0︰0.2 1.0︰0.1
激素配比（6-BA︰IAA）
细
胞
浓
度
/(×
10
5
个
·m
L−
1 )

0
5
10
15
20
培养时间/d
细
胞
数
目
/(×
10
5
个
·m
L−
1 )

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
培养温度/℃
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表 2 正交分析试验结果及极差分析
Table 2 Results and range analysis of orthogonal test
实验序号 A B C D
细胞数量/
(×105个·mL−1)
1 1 1 1 1 5.24
2 1 2 2 2 8.05
3 1 3 3 3 7.98
4 2 1 2 3 6.15
5 2 2 3 1 7.53
6 2 3 1 2 9.42
7 3 1 3 2 6.08
8 3 2 1 3 7.29
9 3 3 2 1 5.96
平均值
K1 7.090 5.823 7.317 6.243
K2 7.700 7.623 6.720 7.850
K3 6.443 7.787 7.197 7.140
R 1.257 1.964 0.597 1.607
壁，如图 7 所示。
根据显微摄影图片可以看出，霍山石斛细胞在
培养前后形态发生了很大变化。培养前的霍山石斛
细胞悬浮液较分散均匀，单细胞较少，且多为游离
状，可明显观察到细胞碎片，霍山石斛细胞多呈大
小不一，不规则的多边菱形。培养后的霍山石斛细
胞有的紧挨在一起，形成细胞团，经过 4 次继代培
养后霍山石斛细胞多为圆状或椭圆状，细胞数目明
显增多。

图 7 霍山石斛细胞培养前（A）及培养后（B）的细胞形态
Fig. 7 Cellular morphology of D. huoshanenes
before (A) and after (B) cell culture
3 结论与讨论
3.1 单细胞的制备
植物细胞可以从外植体中直接分离获得，从外
植体中直接分离植物细胞的方法通常有机械法、玻
璃珠捣碎法和酶解法。用机械捣碎法分离的细胞，
由于受到机械作用，细胞结构会受到一定的伤害，
获得的细胞数量少[9]。在实验中，对不同转速和不
同匀浆时间进行了研究。最后获取霍山石斛单细胞
的最佳条件是 1 000 r/min 匀浆 2 min。玻璃珠捣碎
法可直接在超净工作台内操作，操作简单，组织培
养的小幼苗非常稚嫩，只需玻璃棒和玻璃珠搅拌，
将细胞打开即可。酶解法则是以质量浓度为 0.2
g/mL 的酶液酶解幼苗 2 h，温度保持在 37 ℃。通
过酶解法获取的单细胞数目多于机械组织匀浆捣碎
法，但少于玻璃珠捣碎法。所以本实验主要采用玻
璃珠捣碎法制备单细胞。
3.2 激素配比
植物激素是植物细胞培养中不可缺少的成分，
其种类及比例都对植物细胞的生长、繁殖、分化、
发育和新陈代谢起调节控制作用。适时适量地加入
适宜种类和浓度的植物激素，是诱导植物细胞生理
和形态变化的重要因素。在悬浮培养霍山石斛细胞
时，加入适当比例的植物生长调节剂是很关键的。
经过实验得出当 6-BA/IAA 为 1.0︰0.4 时是石斛细
胞悬浮培养的最适激素配比，即 6-BA 为 1.0 mg/L
和 IAA 为 0.4 mg/L。
3.3 添加物
添加香蕉泥对霍山石斛悬浮培养细胞影响显
著，香蕉提取物除了提供植物细胞生长发育所需的
养分外，还对维持培养基的 pH 值在 5.0～5.5 有缓
冲作用[10]。因此控制添加物的质量分数就显得很重
要，如果过高，就会使培养基的渗透压过高，抑制
了植株对水分和养分的吸收，进而抑制细胞正常的
生长发育。实验结果显示，石斛细胞培养的最适香
蕉泥质量分数是 15%。
本实验在无菌操作条件下，对霍山石斛细胞悬
浮培养的条件进行了单因素研究，得出了最佳碳源
为蔗糖，且最适质量浓度为 30 g/L；最佳的氮源为
NH4NO3，最适 pH 为 5.6，培养基中需要添加香蕉
泥，在 28 ℃，120 r/min 的转速下摇床培养，最佳
培养时间为 14～20 d，其中最适的激素配比
6-BA-IAA 为 1.0︰0.4。优化出最佳单因素后又对石
斛细胞培养进行了正交试验，得出了最适合石斛细
胞悬浮培养的条件。当蔗糖质量浓度为 35 g/L，
NH4NO3 质量浓度为 1.3 g/L，pH 为 5.6，激素配比
6-BA/IAA 为 1.0︰0.4 时，培养所得的霍山石斛细胞
浓度可达 9.42×105个/mL。结果表明：应用细胞悬浮
培养技术，培养霍山石斛细胞将具有较好应用前景。
A B
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