全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 1 期 2012 年 1 月
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黄花蒿 HDS 基因的克隆与功能分析
张祖荣 1, 2，廖志华 2，彭梅芳 2
1. 重庆文理学院 生命科学系，重庆 402168
2. 西南大学生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715
摘 要：目的 克隆获得黄花蒿 MEP 途径中必需关键酶——羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶基因（HDS），并进行生物信息
学分析和功能互补分析研究。方法 对已知的其他种子植物 HDS 基因的核苷酸序列进行多重序列比对，选取保守区域设
计简并引物，利用同源扩增和 cDNA 末端快速扩增技术从黄花蒿中获得目的基因；利用 BLAST 进行序列比对，ORF Finder
寻找开放阅读框，并用 MEGA3.0 中的临位相联法构建进化树。结果 得到 1 条长 2 324 bp 的 HDS cDNA 序列，其 ORF
框长 1 854 bp，编码 617 个氨基酸残基的蛋白；生物信息学分析显示，黄花蒿 HDS 基因 AaHDS 与其他种子植物来源的
HDS 高度同源；功能互补分析表明，AaHDS 能互补突变菌株 Escherichia coli MG1655 ara＜＞HDS 中缺失的 HDS 功能，
使突变菌株恢复生长，证明 AaHDS 具有典型的 HDS 基因功能。结论 首次克隆获得黄花蒿 HDS 基因，为青蒿素的代谢
工程研究提供相应的基础。
关键词：黄花蒿；羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶基因；基因克隆；生物信息学分析；青蒿素
中图分类号：R282.21 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)01 - 0148 - 07
Cloning and function analyses of HDS gene from Artemisia annua
ZHANG Zu-rong1, 2, LIAO Zhi-hua2, PENG Mei-fang2
1. Department of Life Science, Chongqing University of Arts and Sciences, Chongqing 402168, China
2. Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, School of Life Sciences,
Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: Objective To obtain the indispensable key enzyme—hydroxide methyl enylamino 4-cyclodiphosphate synthase (HDS)
gene involved in the MEP pathway cloned from Artemisia annua and conduct bioinformatic and functional complementation analysis.
Methods To perform multiple sequence alignment for the nucleotide acid sequence of the other reported seed plants’ HDS gene, to
select conservative areas for designing degenerate primers, and to gain the aim gene from A. annua through homologous expanding and
cDNA bottom speedily expanding technique. To perform sequence alignment using BLAST, to identify open reading frame (ORF)
using ORF Finder, and to construct phylogenetic tree using neighbor joining (NJ) ways in MEGA3.0. Results The obtained HDS
cDNA sequence was 2 324 bp containing a 1 854 bp ORF and encoding a 617-amino acid protein. Bioinformatic analysis showed that
AaHDS was homologous with HDS derived from other seed plant species. Functional complementation analysis indicated that AaHDS
could make up the short HDS function of mutant Escherichia coli MG1655 ara＜＞HDS. It could make the mutant get back to
upgrowth, which showed AaHDS had typical HDS gene function. Conclusion The cloning HDS gene from A. annua for the first time
provides a good basis for further study on the metabolization project of artemisinin.
Key words: Artemisia annua L.; HDS; gene cloning; bioinformatic analysis; artemisinin
青蒿素是从黄花蒿 Artemisia annua L.中提取的
一种治疗疟疾的特效药物[1-3]，近年来的研究还发现
青蒿素具有免疫抑制、抗血吸虫、抗病毒及抗肿瘤
等多方面的药理作用[4]。但天然药源黄花蒿中青蒿
素量很低（0.01%～0.6%）[5]，大大限制了商业化的
生产，青蒿素的生产远远不能满足国际市场的需
求[6]。因此寻找和扩大青蒿素药源是目前亟待解决
的问题。化学合成青蒿素，成本高、难度大；组织
培养方法也不能有效提高青蒿素的产量，目前青蒿
素来源仍是依赖从栽培黄花蒿中提取[7-9]。
收稿日期：2011-03-31
基金项目：重庆市教委自然科学研究资助项目（kj071204）
作者简介：张祖荣（1966—），男，重庆江津人，重庆文理学院副教授，长期从事药用植物的教学与科研工作，现为西南大学访问学者。
Tel: 13658304114 E-mail: 412587791@qq.com
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近年来，随着青蒿素生物合成途径相关酶基因
的克隆，基因工程成为提高青蒿素产量的有效途径
之一[10]。为研究青蒿素生物合成的分子机制，以及
为青蒿素代谢工程提供候选基因和作用靶点，本研
究采用 RACE 技术[11]从黄花蒿中克隆获得了青蒿素
代谢途径中的一个关键酶基因——羟甲基丁烯基-4-
磷酸合成酶基因（HDS），并进行了相应的生物信息
学分析和功能验证。
1 材料与方法
1.1 材料
黄花蒿全株采集于西南大学生命科学学院的重
庆酉阳科研教学基地，用液氮速冻后在−70 ℃保存
备用。大肠杆菌 Escherichia coli T. Escherich 菌株
DH5 和 M15、质粒 pQE30、突变菌株 E. coli MG1655
ara＜＞HDS 以及其他实验材料均由该实验室廖志华
教授鉴定，由西南大学生命科学学院天然产物与代
谢工程实验室保存和提供。
1.2 方法
1.2.1 黄花蒿总 RNA 的提取 取−70 ℃冰箱中保
存的黄花蒿叶、茎混合材料 0.1 g，用 RNAplant 试
剂盒（天根生物，北京）提取总 RNA，保存于−70 ℃
冰箱备用。
1.2.2 黄花蒿 HDS 基因（AaHDS）核心片段的获得
在美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站上分别
下载已报道的 HDS 基因的核苷酸序列[如甜菊
Stevia rebaudiana (Bert.) Hemsl.、拟南芥 Arabidopsis
thaliana (L.) Heynh.、细长聚球藻 Synechococcus
elongates Nag. 等]，使用 Vector NTI 8.0 进行多重序
列比对，选取最保守核苷酸序列设计简并引物[12]，
正向引物为dfAaHDS：5’-TATGG(A/G)(A/C)G(A/G/-
T/C)GCAATGCG(C/A/T)ATTG-3’ ， 反 向 引 物 为
drAaHDS：5’-CAATCTTTCC(A/G)GG(A/T)G(C/A)-
ACCACC-3’。cDNA 第一链合成使用 TaKaRa RNA
PCR Kit(AMV)，按照试剂盒操作手册合成 cDNA
链。以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应条件为：
94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 45 s，50～60 ℃温
度梯度退火 45 s（每个循环降低 0.5 ℃)，72 ℃延
伸 1 min，共 30 个循环；最后 72 ℃总延伸 10 min。
PCR 产物纯化按照上海赛百盛基因技术有限公司
的 PCR 产物纯化试剂盒说明操作，将回收产物与
pMD18-T 连接后转化 DH5α，进行蓝白斑筛选，挑
取白斑进行菌落 PCR 检测，阳性克隆送至上海英骏
生物技术有限公司测序，测序结果进行 BLAST 分
析以获得 AaHDS 核心片段。
1.2.3 AaHDS 全长 cDNA 的获得 根据 AaHDS
核心片段序列设计 RACE 引物。AaHDS3-1：
5’-TGCGGGTGCCAATACTGGTG-3’；AaHDS3-2：
5’-CTGCTACAAGGATGCAGGATG-3’；AaHDS5-1：
5’-GAGCCATCACGGTGGAGTACACC-3’；AaHDS5-2：
5’-CCTCTTCACCCTCCTTCTGCAC-3’。RACE-PCR
扩增按照 SMART RACE cDNA（Clontech，美国）
扩增试剂盒的说明书进行。RACE 产物的纯化、克
隆及测序与“1.2.2”相关操作相同。将 3’RACE、
5’RACE和核心片段进行电子拼接（Vector NTI Suite
8.0），获得全长 cDNA 序列，根据拼接序列设计全
长 特 异 性 引 物 ， 正 向 引 物 fiAaHDS ： 5’-
TTCTGAAGGGAGTCCTCTGTT-3’ ； 反 向 引 物
riAaHDS：5’-CCATCACCTTTAACTAGACGGT-3’，
克隆获得物理全长 cDNA 序列。
1.2.4 AaHDS序列分析 序列比对均使用Vector NTI
Suite 8.0 软件和 BlastP2.2.3（http: //www.ncbi. nlm. nih.
gov）进行分析；开放性阅读框（open reading frame，
ORF）的查找和核苷酸的翻译在 http: // www. ncbi.
nlm.nih.gov 网 站 的 ORF Finder 上 完 成 ； 用
CLUXTALX[13]进行多重序列比对，用 MEGA3.0 中的
临位相联法（neighbor-joining，NJ）[14]构建进化树，
重复次数为 1 000 次；蛋白质基本性质及转运肽的分
析使用 http://www.expasy.org 网站提供的相关生物信
息学分析软件进行[15]。
1.2.5 AaHDS 基因的功能验证 大肠杆菌突变菌株
MG1655 ara＜＞HDS 中，内源 HDS 基因被一个卡那
霉素抗性基因所替代，染色体中仅含有一个单拷贝
的受到 PBAD启动子控制的 HDS 基因[16]。MEP 途径
存在于大肠杆菌中，HDS 基因是大肠杆菌生存所必
须的[17]，MG1655 突变菌株只能在含有阿拉伯糖
（Ara）的培养基上生长，而不能在含有葡萄糖（Glc）
的培养基上生长[16]。为了验证 AaHDS 的催化活性，
在大肠杆菌突变体 MG1655 中进行互补试验[18]：
AaHDS 的编码区被构建到原核表达载体 pQE30 上，
并转化至大肠杆菌突变体 MG1655 中，获得 AaHDS
功能表达的工程菌，同时以空质粒 pQE30 转化大肠
杆菌突变菌株MG1655 ara＜＞HDS感受态作为阴性
对照，采用划线培养的方式将 MG1655 ara＜＞HDS
分别接种于 LB＋Kan＋0.2% Ara 与 LB＋Kan＋
0.2%Glc 平板上，将携带 pQE30-AaHDS 质粒和空质
粒的 MG1655 ara＜＞HDS 分别接种于 LB＋Kan＋
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Amp＋0.5 mmol/L IPTG＋0.2% Glc 平板上，过夜培
养后，观察生长情况以验证 AaHDS 的功能。
2 结果与分析
2.1 总 RNA 的提取
以黄花蒿茎、叶混合取样为材料，按照 RNAplant
buffer 试剂盒操作说明提取黄花蒿总 RNA，将抽提的
RNA 取 5 μL 进行电泳检测，RNA 明显呈 3 个条带，
无降解现象，无蛋白杂质，28S 条带明亮（图 1），说
明获得了高质量的 RNA；再用紫外法进行定量测
定，A260/A280值均在 1.8～2.0，表明所得 RNA 的纯
度达到了相应实验的要求。
2.2 基因 AaHDS 的克隆
黄花蒿总 RNA 反转录为 cDNA 后，以
dfAaHDS 和 drAaHDS 为引物，cDNA 为模板进行
PCR 扩增。将获得的扩增条带进行目的片段回收，
亚克隆后的测序结果表明该片段长 1 420 bp。经
BLAST 分析初步鉴定为黄花蒿 HDS 基因核心片
段，并命名为 AaHDS。根据所得片段设计基因特
异性引物用于扩增 AaHDS 的 cDNA 末端，通过
3’-RACE 和 5’-RACE 分别获得 602 bp 的 3’-末端
和 1 045 bp 5’-末端。将 AaHDS 基因 3 个片段拼
接后获得其全长 cDNA，并最终扩增获得其物理
全长，测序结果表明 AaHDS 基因全长为 2 324 bp
（图 2）。
2.3 基因 AaHDS 的生物信息学分析
AaHDS 的 cDNA 全长 2 324 bp，包含一段长
图 1 黄花蒿总 RNA 电泳图
Fig. 1 Electrophoresis of total RNA from A. annua
编码区和翻译的氨基酸用大写字母表示，非编码区（UTR）用小写字母表示, 终止密码子用*表示
Coding and its deduced amino acid sequences are shown by capital letters, UTR is shown by lowercase letters; * indicates stop codon
图 2 AaHDS cDNA 全长序列和由此推测的氨基酸序列
Fig. 2 AaHDS cDNA full-length sequence and its deduced amino acid sequence
28 S
18 S
5 S
01
31
21
11
01
91
81
71
61
51
41
31
21
11
01
91
81
71
61
51
41
31
21
11
01
91
*
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度为 1 854 bp 的 ORF，还有长度为 210 bp 的 5’-
端非翻译区（untranslated region，UTR）和 260 bp
的 3’-UTR，终止密码子为 TAG（图 2）。AaHDS
编码含 617 个氨基酸残基的蛋白，其相对分子质量
预测为 6.87×104，等电点预测为 5.3。在 Expasy
中进一步预测 AaHDS 的二级结构[19]，显示其中
的随机卷曲占 45.38%，α-螺旋占 40.19%，延伸链
占 14.42%（图 3）。将 AaHDS 与来源于其他植物
以及藻类、细菌的 HDS 进行多重序列比对。
结果图 4 表明，来源于植物与来源于藻类和细菌
的 HDS 差异较大，尤其是在 N 端，植物中 HDS 的 N
端比细菌和藻类多出一段大约含 80 个氨基酸残基
的区域，这段序列的功能已经在拟南芥 A. thaliana
中得到了证实[20]，是引导 HDS 定位于质体的植物
特有的转运肽，这与在植物中 MEP 途径定位于质
体中的观点一致[21]；同是来源于植物的 HDS 在 N
端的氨基酸序列差异也较大，主要因为这部分序列
是非催化区域，而催化区域的 HDS 氨基酸序列非常
保守，其保守一致性高达 80%～95%。
用 Clustalx 和 MEGA3.0 软件对 AaHDS 进行分
h-α-螺旋，e-延伸链，c-随意卷曲
h-alpha helix e-extended strand c-random coil
图 3 AaHDS 的二级结构预测
Fig. 3 Secondary structure prediction of AaHDS
拟南芥
大肠杆菌
细长聚球藻
黄花蒿
甜菊
保守区
拟南芥
大肠杆菌
细长聚球藻
黄花蒿
甜菊
保守区
拟南芥
大肠杆菌
细长聚球藻
黄花蒿
甜菊
保守区
拟南芥
大肠杆菌
细长聚球藻
黄花蒿
甜菊
保守区
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一致氨基酸残基采用白色字体黑色背景表示，保守氨基酸残基采用黑色字体灰色背景表示，其他氨基酸残基均用黑色字体白色背景表示；★
表示半胱氨酸残基保守位点
Identical amino acid residues were shown in white with black background and conserved amino acid residues were shown in black with gray
background, other amino acid residues were shown in black with white background; ★ indicates position of conserved cysteine residues
图 4 来自不同物种的 HDS 氨基酸序列多重比对
Fig. 4 Multi-alignment of HDS amino acid sequences from various plant species
子系统发育树分析，结果显示，来源于植物、藻类、细
菌的 HDS 在发育进化树上明显各聚为一支（图 5），并
且在进化树上的距离也与其所属类别的亲缘关系相符。
其中AaHDS与甜菊S. rebaudiana的HDS亲缘关系最接
近，这与黄花蒿和甜菊同属菊科植物的事实相符。
2.4 基因 AaHDS 的遗传功能互补分析
由于 MEP 途径对细菌的生长是必需的，所以
HDS 基因对大肠杆菌的生长是必需的。而 E. coli
MG1655 ara＜＞HDS 突变菌株经过人工改造后，
其的内源性 HDS 基因由卡拉霉素抗性表达盒取
代，因此其只能在含有 Ara 的培养基上生长，而
不能在含有 Glc 的培养基上生长。将携带 AaHDS
基因的重组表达质粒 pQE30-AaHDS 转化进突变
菌株 E. coli MG1655 ara＜＞HDS 后，该菌株获得
拟南芥
大肠杆菌
细长聚球藻
黄花蒿
甜菊
保守区
拟南芥
大肠杆菌
细长聚球藻
黄花蒿
甜菊
保守区
拟南芥
大肠杆菌
细长聚球藻
黄花蒿
甜菊
保守区
拟南芥
大肠杆菌
细长聚球藻
黄花蒿
甜菊
保守区
拟南芥
大肠杆菌
细长聚球藻
黄花蒿
甜菊
保守区
拟南芥
大肠杆菌
细长聚球藻
黄花蒿
甜菊
保守区
拟南芥
大肠杆菌
细长聚球藻
黄花蒿
甜菊
保守区
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图 5 在 MEGA3.0 平台上用 NJ 方法构建的 HDS 分子进化树
Fig. 5 HDS phylogenetic tree constructed by NJ method
on MEGA 3.0
外源性的 HDS 基因，在含有葡萄糖的培养基上可以
生长，而对照菌株则不能生长，从而证明 AaHDS 互
补了大肠杆菌缺失的 HDS 的功能。
大肠杆菌突变菌株 MG1655 ara＜＞HDS 能在含
有 0.2% Ara 的 LB 培养基上生长，却不能在含有 0.2%
Glc 的培养基上生长（图 6-a，b）；当将携带 AaHDS
编码区的质粒 pQE30-AaHDS 转入 E.edt MG1655
ara＜＞HDS 之后，能使大肠杆菌 HDS 突变菌株恢复
生长，在含有 0.2% Glc 和 0.5 mmol/L IPTG 的培养基
上能生长（图 6-d），而作为对照的空载体 pQE30 则
不能在此培养基上生长（图 6-c）。
3 讨论
青蒿素作为治疗疟疾的特效药，在国际市场上供
不应求。自从青蒿素被发现以来，研究者们不断尝试
各种方法以期提高青蒿素量：采用化学合成青蒿素，
需要经过一系列繁杂的反应，且成本高、得率低、毒
性大；组织培养也不能有效提高青蒿素的产量。近年
来，随着基因转化技术的广泛运用，不少研究者致
图 6 AaHDS 基因的功能验证
Fig. 6 Functional demonstration of AaHDR gene
力于研究利用转基因技术和次生代谢工程手段来
提高黄花蒿中青蒿素的量，但其前提是必需对青
蒿素生物合成代谢途径的分子生物学和生物化学
有深入的了解[22]。
到目前为止，青蒿素生物合成途径的研究已
取得了非常可喜的进展，其代谢途径上多个编码
关键酶的基因已被克隆[7]。HDS 催化 ME-cPP 转
化生成 HMBPP，是青蒿素生物合成上游途径
MEP 途径中必需的一个关键酶[23]。本研究在前人
研究的基础上，采用 RACE 技术，以重庆酉阳的
优质高产黄花蒿为研究材料，克隆获得了编码黄
花蒿 HDS 的 AaHDS 基因。对其编码的氨基酸序
列进行生物信息学分析，结果表明，AaHDS 与来
源于其他植物的 HDS 同源性高达 80%～95%，且
具有典型的 HDS 催化活性位点，在发育进化树
上，AaHDS 与来源于植物甜菊的 HDS 亲缘关系
最接近。所有这些证据都表明，本研究对 AaHDS
基因的克隆是非常成功的。该成果为更加深入地
研究青蒿素生物合成代谢途径奠定了重要的分子
生物学基础，也为研究青蒿素的代谢工程提供了
更多可能的候选基因和调控靶点。
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甜菊
青蒿
橡胶树
玉米
拟南芥
长春花
番茄
细长聚球藻
集胞藻
大肠杆菌
蜡样芽孢杆菌 细菌
藻类
种子植物
+pQE30
empty
+0.2% Ara +0.2% Glc
+0.2% Glc
+0.5mM IPTG
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