全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 2 期 2011 年 2 月 • 376 •
Ca2+对悬浮培养半夏类原球茎生长及次生代谢物累积的影响
邢建永，王康才*，汤兴利，刘海琴
南京农业大学中药材研究所，江苏 南京 210095
摘 要：目的 研究 Ca2+对半夏类原球茎生长、高温胁迫及次生代谢产物量的影响。方法 以半夏叶柄为外植体，固体培
养基培养获得类原球茎，悬浮培养，采用不同质量浓度 Ca2+处理，测定类原球茎生长速率、抗逆性指标，以及生物碱、鸟
苷、有机酸的量。结果 在（25±2）℃条件下培养，随 Ca2+质量浓度增加，半夏类原球茎生长呈慢-快-慢变化趋势，质量
浓度为 440 mg/L 时，生长速率达到最大值；不同处理半夏类原球茎中生物碱、鸟苷、有机酸量差异显著，Ca2+质量浓度为
440 mg/L 时，生物碱量最高（0.158%），Ca2+质量浓度为 660 mg/L 时，鸟苷、有机酸累积量最高（分别为 0.017 3%、0.608%）。
在（35±2）℃条件下，质量浓度为 0～660 mg/L，随 Ca2+质量浓度升高，SOD、POD 活性逐渐增强，Ca2+质量浓度为 660 mg/L
时，活性最高，但 Ca2+质量浓度为 880 mg/L 时，SOD、POD 活性均降低；不同质量浓度 Ca2+处理 MDA 量变化不显著。结
论 一定质量浓度的 Ca2+能促进半夏类原球茎生长，增强抗逆性，提高有用次生代谢产物的量。
关键词：半夏；悬浮培养；抗氧化酶；鸟苷；总生物碱；总有机酸
中图分类号：R282.21 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)02 - 0376 - 04
Effect of Ca2+ on growth in protocorm-like bodies of Pinellia ternata and
accumulation of secondary metabolites during suspension culture
XING Jian-yong, WANG Kang-cai, TANG Xing-li, LIU Hai-qin
College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Key words: Pinellia ternata (Thunb.) Breit.; suspension culture; antioxidant enzymes; guanosine; total alkaloids; total free organic acid

半夏为天南星科植物半夏 Pinellia ternata
(Thunb.) Breit.的干燥块茎，是一种重要的传统药
材，主要含有生物碱、游离有机酸、甾醇、蛋白、
氨基酸、挥发油、无机元素等多种成分[1]。现代药
理研究表明，半夏中的生物碱具有镇痛、抗心律失
常、抗血栓、抗肿瘤和提高记忆的功效[2]；游离有
机酸具有止咳、祛痰、体外抑制肿瘤细胞的作用[3]；
鸟苷参与 DNA 代谢过程，具有抗肿瘤、抗病毒、
基因治疗等多种生物活性。目前关于半夏愈伤组织
和丛生芽诱导与增殖的研究报道较多[4]，但关于半
夏类原球茎悬浮培养和次生代谢产物形成的培养条
件的研究较少。在生产中，半夏遇高温胁迫，引起
倒苗，在组织培养过程中，半夏再生组织是否也有
此生理现象，未见报道。钙作为植物生长不可缺少
的矿质元素，对药用植物的生长和次生代谢物的积
累具有很大影响[5]，钙作为偶联胞外信号与胞内生
理生化的第二信使，能提高植物的抗逆性。为此，
本实验研究悬浮培养过程中，Ca2+对半夏类原球茎
生长、总生物碱、鸟苷和总游离有机酸的量及相关
抗性指标的影响，以期为半夏快繁及田间生产提供
技术依据。
1 材料与方法
1.1 材料
半夏栽培于南京农业大学实验大棚内，经南京
农业大学中药材研究所王康才教授鉴定为天南星科
植物半夏 Pinellia ternata（Thunb.）Breit.。将半夏
幼嫩叶柄在 MS＋6-BA 1.0 mg/L＋2,4-D 0.5 mg/L ＋
Suc 3.0%＋Agar 0.6%的固体培养基上诱导出类原
球茎，继代培养 3～4 代，获得生长均一、颜色质地
一致的类原球茎，作为供试样品。
1.2 仪器与试剂
安捷伦高效液相色谱仪（LC1120），PHS—3C
型酸度计（上海康仪仪器有限公司），RE—52A 型旋
转蒸发仪。KQ—250B 型超声仪（昆山市超声仪器

收稿日期：2010-04-14
基金项目：江苏省科技厅农业高技术研究（Q200754）
作者简介：邢建永（1985—），男，河北衡水人，在读硕士研究生，研究方向为药用植物栽培与生理。E-mail: 2008104135@njau.edu.cn
*通讯作者 王康才 E-mail: wangkc@njau.edu.cn
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有限公司），Centrifuge5810R 型离心机（Eppendorf）。
邻苯二甲酸氢钾、碳酸钠、氯仿、浓氨水、柠
檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 5.4），乙腈为色谱纯，
水为双蒸水。
对照品：琥珀酸（国药集团化学试剂公司，质
量分数＞99.5%）；鸟嘌呤核苷（Sigma，质量分数＞
99%）；盐酸麻黄碱（批号 0714-9903）由中国生物
制品检定所提供。
1.3 方法
1.3.1 半夏类原球茎悬浮培养条件与处理 采用
MS＋6-BA 1.0 mg/L＋2，4-D 0.5 mg/L＋Suc 3.0%液
体培养基，pH 5.8，装于 50 mL 三角瓶中。采用 0、
220、440、660、880 mg/L Ca2+培养液处理。每瓶接
种 0.5 g 原球茎，在摇床转速 100 r/min，（25±2）℃，
1 500～2 000 lx，12 h/d 光照条件下，培养 30 d 后，
取样测定类原球茎生长速率、总生物碱、鸟苷、总
游离有机酸量。每个处理重复 3 次。
1.3.2 不同质量浓度Ca2+培养半夏类原球茎高温胁
迫试验 处理温度为（35±2）℃，其他培养条件同
上。悬浮培养 30 d 后，参照文献方法[6]，测定类原
球茎鲜品 SOD、POD、MDA 及脯氨酸量。
1.3.3 半夏类原球茎生长速率测定 悬浮培养 30 d
后，取出类原球茎，称其质量，计算类原球茎的生
长速率（GR）：GR＝（W－W0）/（W0×D）[7]。式
中 W 为收获的小块茎鲜质量，W0 为接种的类原球
茎鲜质量，D 为培养时间。
1.3.4 半夏类原球茎化学成分指标测定 半夏类原
球茎悬浮培养 30 d 后，105 ℃杀青 10 min，60 ℃
烘干至质量无变化，打粉过 60 目筛，测定总生物碱、
鸟苷、总游离有机酸量。
（1）总生物碱量测定：参照于超等[8]的可见紫
外分光光度法。以盐酸麻黄碱质量浓度为横坐标，
吸光值为纵坐标，进行线性回归，方程为 Y＝0.057 7
X－0.005 7，r＝0.999 8。表明盐酸麻黄碱溶液在
2.60～13.00 μg/mL 呈良好的线性关系。
（2）鸟苷的测定：采用超声提取法。水提取 3
次，每次 10 mL，提取 30 min，3 500 r/min 离心 15
min，合并上清液，浓缩后定容到 10 mL 量瓶待测。
采用 RP-HPLC 法测定，安捷伦高效液相色谱仪
（LC1120），色谱条件：C18 柱（250 mm×4.6 mm，
5 μm），流动相为乙腈-水（3︰97），检测波长为 254
nm。色谱图见图 1。
（3）有机酸测定：参考 2010 年版《中国药典》[9]
半夏总游离有机酸测定方法。
2 结果与分析
2.1 Ca2+对半夏类原球茎生长速率的影响
由表 1 可看出，半夏类原球茎悬浮培养生长速
率随 Ca2+质量浓度的升高呈先升后降趋势，Ca2+质
量浓度过高或过低均不利于半夏类原球茎的生长。
Ca2+质量浓度为 440 mg/L 时，半夏类原球茎收获鲜
质量最大，生长速率达到最大值。



t/min
图 1 鸟苷对照品（A）与样品（B）的色谱图
Fig. 1 Chromatograms of guanosine reference
substance (A) and sample (B)
表 1 不同质量浓度 Ca2+处理对半夏类原球茎生长速率的
影响（n=3）
Table 1 Effect of different Ca2+ concentrations
on growth rate of PLBs (n=3)
Ca2+/
(mg·L−1)
接种鲜质量/g 收获鲜质量/g
生长速率/
(g·d−1)
0 0.50 6.757±0.425 c 0.417±0.028 c
220 0.50 7.220±0.427 c 0.448±0.028 c
440 0.49 13.267±0.493 a 0.869±0.034 a
660 0.49 10.167±0.370 b 0.658±0.025 b
880 0.51 7.110±0.133 c 0.431±0.008 c
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），下同
Figures followed by different low case letters in each column are
significantly different (P<0.05), same as follow
0 5 10 15
B
A
0 5 10 15
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2.2 不同质量浓度 Ca2+处理与高温胁迫相关生理
指标的关系
由表 2 可看出，Ca2+对半夏类原球茎 SOD、POD
酶活性影响显著。Ca2+质量浓度为660 mg/L的处理，
SOD、POD 酶活性最大，分别为 82.375 U/g、57.311
ΔA470/（g·min−1），Ca2+质量浓度为 0 mg/L 时，POD
活性最低，在 0～660 mg/L 时，POD 活性随 Ca2+
质量浓度升高而增大；当质量浓度超过 660 mg/L
时，POD 活性降低。Ca2+为 220～880 mg/L 的处理
MDA量均低于Ca2+质量浓度为 0 mg/L的处理，Ca2+
质量浓度为 440～880 mg/L 时，脯氨酸量显著高于
低质量浓度的处理，说明一定质量浓度的 Ca2+能提
高半夏抗逆性。
2.3 不同质量浓度 Ca2+处理对半夏类原球茎次生
代谢产物的影响
不同质量浓度 Ca2+处理，对半夏类原球茎中鸟
苷、有机酸及生物碱量的影响效果显著。当 Ca2+质
量浓度为 440 mg/L时，总生物碱量高，达到 0.158%。
Ca2+质量浓度过高或过低，均不利于总生物碱的积
累。不同质量浓度 Ca2+处理，对半夏类原球茎鸟苷、
有机酸的积累也有显著影响，Ca2+质量浓度为 660
mg/L 时，鸟苷、有机酸累积量最高，分别为 0.017 3%、
0.608%（表 3）。
3 讨论
3.1 Ca2+与半夏类原球茎生物量累积的关系
钙是生物体不可或缺的重要元素，本研究结果
表 2 Ca2+对半夏类原球茎 SOD、POD、MDA 及脯氨酸的影响（n=3）
Table 2 Effects of different Ca2+ concentrations on SOD, POD, MDA, and proline of PLBs (n=3)
Ca2+质量浓度/(mg·L−1) SOD 活性/(U·g−1) POD 活性/(ΔA470/(g·min−1)) MDA/(nmol·g−1) 脯氨酸/%
0 30.575±0.043 c 11.144±0.387 d 4.807±0.223 a 0.001 26±0.000 85 b
220 29.195±0.055 d 20.233±0.971 c 3.396±0.654 a 0.001 60±0.000 83 b
440 75.632±0.638 b 32.389±0.868 b 3.968±0.098 a 0.002 94±0.000 41 a
660 82.375±0.072 a 57.311±5.274 a 3.821±0.431 a 0.003 15±0.000 24 a
880 17.686±0.066 e 37.200±2.137 b 3.718±0.425 a 0.002 81±0.000 64 a
表 3 Ca2+对半夏类原球茎中鸟苷、有机酸及生物碱量的影响（n=3）
Table 3 Effects of different Ca2+ concentrations on guanosine, total free organic acid, and alkaloids of PLBs (n=3)
Ca2+/(mg·L−1) 总生物碱/% 鸟苷/% 总有机酸/%
0 0.123±0.000 4 c 0.015 3±0.000 6 ab 0.528±0.001 c
220 0.116±0.001 7 c 0.015 9±0.000 5 ab 0.555±0.003 b
440 0.158±0.002 7 a 0.013 8±0.001 9 b 0.471±0.001 d
660 0.132±0.003 1 b 0.017 3±0.000 9 a 0.608±0.002 a
880 0.122±0.000 1 c 0.014 4±0.000 5 b 0.391±0.007 e

表明，在一定质量浓度范围内，Ca2+能够促进半夏
类原球茎生物量的累积。过低或过高的 Ca2+均不利
于半夏类原球茎的生长。与范美华等[10]的实验结果
相似。缺钙时，可能影响半夏类原球茎细胞纺锤体
和细胞壁的形成，抑制细胞分裂，其生物量的累积
受到影响；Ca2+质量浓度过高时，对半夏类原球茎
形成盐胁迫，同样不利于细胞的生长。
3.2 Ca2+处理与高温胁迫相关生理指标的关系
高温胁迫时，植物体内会产生大量自由基 O2÷、
H2O2 等，通过 Haber-Weiss 反应和 Feton 反应等途
径最终诱发膜脂过氧化反应，破坏细胞膜系统的结
构，影响细胞的正常代谢，使植物细胞受害，最终
导致植物体受害。在长期进化过程中，植物细胞内
形成防御活性氧、自由基毒害的保护机制[11]，SOD、
CAT 和 POD 等是活性氧清除酶系统的重要保护
酶。脯氨酸是膜保护物质，有利于植物在高温胁迫
下维持细胞的结构与功能。MDA 是植物在逆境条
件下发生膜脂过氧化作用的产物之一，作为膜质过
氧化指标，其大小表示细胞膜过氧化程度和植物对
逆境条件反应的强弱。研究表明，外源钙能减轻环
境胁迫，如干旱、高温、低温等对细胞膜的伤害，
提高植物的抗性[12-13]。Gong 等[14]用 Ca2+处理玉米
种子，可提高玉米的抗热性，认为是 Ca2+通过钙信
使系统增强了 SOD 活性，增强玉米幼苗的抗热性。
De 等[15]认为逆境下钙信使系统提高脯氨酸合成酶
的活性，促进脯氨酸合成。本研究结果表明，在一
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定质量浓度范围内，Ca2+能够提高半夏类原球茎
SOD、POD 的活性以及脯氨酸量并可以降低 MDA
量，表明 Ca2+能够提高半夏类原球茎的抗氧化性，
提高其抗逆性。根据本研究结果，半夏类原球茎悬
浮培养液中 Ca2+质量浓度为 440～660 mg/L 时，效
果较理想。本研究同时也提示，在大田生产中，施
用 Ca2+处理，对解决半夏高温胁迫倒苗问题可能
有益。
3.3 Ca2+对半夏类原球茎次生代谢的影响
本研究结果表明，钙盐对总生物碱的合成具有
显著影响，过高或过低都不利于总生物碱的合成，
这与Ca2+对水母雪莲悬浮培养细胞黄酮积累的结果
相似[16]。可能是钙对细胞代谢的调节机制，影响了
合成生物碱的某些关键酶的活性，从而影响总生物
碱的合成。
植物体中的有机酸是一类重要的金属螯合物，
可与 Ca2+结合为不溶性的钙盐（如草酸钙、柠檬酸
钙），如半夏药材中草酸钙以针晶形式存在。在高质
量浓度 Ca2+处理条件下，半夏类原球茎总游离有机
酸量相对较低，可能与类原球茎体内草酸钙的累积
有关。Ca2+对半夏鸟苷的合成有一定影响，可能与
Ca2+影响了鸟苷合成过程中某些酶的活性有关，其
具体机制有待进一步研究。
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