全 文 ：生物技术 9 ( 1 ) : 8一 10 , 19 9 9
B i o t e e h n o l o g y
香荚兰细胞悬浮培养产生香兰素条件的研究
曹孟德 ’ 李家儒 2 王君健 ,
( 1
. 河南医科大学博士后流动站 ,郑州 , 4 5 0 0 5 2)
( 2
. 中国科学院武汉水生生物研究所 ,武汉 , 43 0 0 7 2)
(3
. 华中理工大学生物工程系 .武汉 , 4 3 0 0 7的
该文报道 了碳源 、 氮源及吸附剂对香 芙兰细胞急浮培养产生香兰 素的影响 ,结果
表明 ,蔗糖比蔺萄糖及果据更适合作香芙兰细胞 生长及产生香兰 素的碳源 , 最佳蔗糖
浓度为 5 % ; 当培养基 中仅含 K N 0 3 , 则有利于细胞的生长和 香兰素的 形成 , 培养液 中
去掉 K N o : 仅含 N H ; N 0 3 时 , 细胞生长和香 兰 素形 成均被 抑制 ; 培养基添加吸附剂
后 ,香 芙兰 细胞产生的香兰素含量明显增加 , 活性 炭的效果优于 x A D一 2 , 而且活性
炭用童增加 ,香兰 素的产圣亦嗜加 .
关链词 : 香芙兰 ,香兰素 , 急浮培养
香荚兰是世界上用得最广的香料 ,其主
香成分香兰素又名香草醛 ( 3一甲氧基一 4一
经基一苯 甲醛 )含量较低 , 仅占香英兰豆干重
的 2一 3洲 。 由于香英兰生长发育及其后期生
香处理的特殊性与复杂性加之其香兰素含量
不高 , 因此 ,仅靠从天然香荚兰制备浸提物或
天然香兰素是难以满足市场需要的 , 而且价
格昂贵 , 为一般消费者难以接受 。 为此 , 借助
植物组织培养技术来生产天然香兰素或许可
以解决上述间题 。 国外已在此方面作了一些
尝试 l[ 一月 , 国内则未见报道 。 本文在前述工作
的基础上进一步探讨了香荚兰细胞悬浮培养
产生香兰素的条件 5[, 幻 。
1
·材料与方法
1
.
1 实验试剂
香兰素标谁 品 : is g m a 化学试剂公 司出
品 ,其他试剂均为国产分析纯 。
1
.
2 方法
香荚兰细胞的惫浮培养 、可溶性糖的测
定 、 香 兰素的提取 及检测 均参照文献 5[, s] 进
行 。
2 结果
2: l 碳源 对香荚兰细胞生长和香兰素含量
变化的影响
2
.
1
.
1 不 同碳源对香荚兰细胞生长及香兰
素产生的影响
在含 N A A ( 1 . 0m 8 / L ) 、 6一 B A ( 0 . 1爪 g /
L )的 M S 培养基分别补 加 3写的蔗糖 、 葡萄
糖及果糖 , 培养 14 天后 ,测 定培养液中可溶
性糖 、 香兰素及细胞生长量 , 结果见图 1 。
2
.
1
.
2 蔗糖浓度对香荚兰细胞生长及香兰
素产生的影响
将 香 荚 兰细 胞 接 种 到 含 有 l 肠 , 3% ,
5%
,
7 %蔗糠的 M s 培养基 ( N A A I . o m g / L ,
6一 B A O· Zm g / L ), 在 14 天的培养周期中分
别测定细胞生长量及香 兰素含量 ,结果见图
收稿 日期 : 19 9 8一 0 5认 2 5
DOI : 10. 16519 /j . cnki . 1004 -311x . 1999. 01. 003
曹孟德等 : 香荚兰细胞惫浮培养产生香兰素条件的研究
…圆 表 1 氮浓对香英兰细胞是浮培并产生香兰案的影响K N O 3( m 吕/ L ) N H 减N 0 3( m g / L ) 培养物干重( m g / L ) 香兰素含量( m g / L )
1 0
.
2 1
1 1
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3 0
4
。
2 1
8
。
3 5
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1 0
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.
3 6
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.
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2
,
3 吸附剂对香兰素产生的影响
香荚兰细胞在附加 吸附 剂 X A D一 2 或
活性炭 各 3 9 / L 、 N A A .I Om g / L 、 6 一 B A .O
1 9压 、 3%蔗糖的 M S 培养基 中培养 n 天时
香兰素含量见表 2 、 表 3 。
表 2 吸附荆对香英兰细胞培养产生香兰素的影响
0876一s礴32
产é、公日)丢一u.A
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1
。
5
1
。
0
组别 对照组
香兰素 ( m g / L ) 7 . 2 9
对照组 ^ e ( 3 9 / L )
1 2
.
7 4 1 4
.
3 3
0
。
5
0
八谈óó.怕n的
2 3 4 5 6 7 吕 9 10 1 1 12 13 1 4 表 3 活性炭用盘对香兰素产生的影响
D a产
图 1 碳源对香英兰细胞生长及香兰素产生的影响
1 5 厂
活性炭浓度 ( g / L ) 香兰素产量 ( m s / L )
0 7
.
2 9
一勺 1 1
.
2 4
14
,
3 3
1 8
.
3 6
S u c r o s e ( % )
图 2 蔗糖浓度对细胞生长及香兰素产生的影响
注 : 1 、 e e 一z ( d w . g / L ) ; 2 、 v a n 沮sn ( m g / L )
2
.
2 氮源对香兰素产生的影响
在添加了不同浓度的 K N o 3 和 N H 。N o 3
的 M s 培养基 中 ,香荚兰细胞悬浮培养的结
果见表 l 。
40 3 0
.
7 8
3 讨论
3
.
1 碳源对香荚兰细胞 生长和香兰素含量
变化的影响
3
.
1
.
1 不同碳源对香荚兰细胞生 长及香兰
素产生的影响
如图 1可知 ,碳源种类不同 ,香荚兰细胞
生长及香兰素产生亦不同 , 比较而言 ,蔗糖比
有萄糖和果糖对细胞生长及香兰素的产生更
有利 ,在含有果糖的培养基 中细胞生 长量 比
生 物 ’ 技 术 9 卷 l 期
含葡萄糖培养基 中的细胞生长少 ( A ) 。 这种
生长减少 与延迟的现 象伴 随着对糖的 吸收
(如 c ) , 在含蔗糖和葡萄糖的培养基中 , 香兰
素积累产 生的时 间几乎相同 , 而在含果糖 的
培养基中香兰素的合成时间推迟并减少 了约
5 0% (如 B ) 。
3
.
1
.
2 蔗糖浓度对香荚兰细胞生长及香兰
素的影响
结果表明 , 随着蔗糖浓度的提高 , 细胞生
长量及香 兰素累积产生亦增高 , 香兰素在培
养周期 4一 5 天即开始积累产生 , 并不依赖于
培养基中蔗糖浓度的高低 ,但是香兰素最终
含量及其合成速率则与培养基中补加的蔗糖
浓度不同而显示差异 , 最终培养基 中的可溶
性糖几乎耗尽 ,与培养基中初始糖量无关 。 碳
源对细胞的生长与代谢影响极大 ,从实验结
果可 以看出 , 蔗糖比葡萄糖及果糖更适合用
做香英兰细胞生长及产生香兰素的碳源 , 最
佳蔗搪浓度为 5% 。 类似的现象在茄属植物
( s o za , : 二 。 z e a 夕: 汀0 1 :` 二 一 c a o . ) 烟 草
( N i e o t i a : a t o 吞a 。二二 ) 及 鸡 纳树 ( c `。 。无。。 a
韶 e c ,` : b , 二二 )的细胞培养中都存在 [7 , 8〕 。
3
.
2 氮源对香兰素产生的影响
从 表 1 不 难 看 出 , 当 培 养 基 中 仅 含
K N o 3
, 则有利于细胞的生长和香 兰素的形
成 , 培养液 中去掉 K N o : 仅含 N H 。N o : 时 ,
细 胞 生 长 和 香 兰 素 含 量 均 有 抑 制 作 用 。
Y a m ak a w a 等 s[] 报道 ,培 养基中硝态氮与按
态氮的关系对葡萄细胞悬浮培养产生花青素
有影响 , 在烟草 .细胞培养中 , 仅用按态氮作为
唯一氮源时 , 则辅酶 Q 产量增高 l0[ 〕 , 但两种
氮源的 同时存在 则对分 批培养 。 D切 sc , ae
d。 lot id
e。 细 胞 产 生 薯 裁 皂 昔 配 基
( d i
o s g e n迈 )是至关重要的 [, , ] 。 因此 ,不 同的
氮源种类与浓度 ,尤 其是硝态氮与按态氮在
培养基组成中的 比例关系对不同种类植物细
胞的生长与目的次生代谢产物的产生的影响
是各异的 。
3
.
3 吸附剂对香兰素产生的影响
由表 2 可知培养基添加 吸附剂后 , 香荚
兰细胞产生的香兰素含量明显增加 , 活性炭
的效果优于 x A D一 2 ,在操作过程中 X A D一
2 使用时不大方便 , 主要是摇瓶过程中 , 由于
其漂浮在培养基表面 , 易于附着在瓶壁上 ,而
且活性炭的使用使培养基呈黑色造成了一定
程度的暗培养环境 , 或许对香培土 表演的产
生更 为有利 。 另外 , 活性炭的用量对香兰素的
产生亦有不同的影响 , 从表 3 可知 , 随着活性
炭用量的增加 ,香兰素的产量亦在增加 。这或
许是 由于活性炭等 吸附剂吸附 了香兰素 ,缓
解或解除了 香荚兰细胞 因香兰素等产物的积
累达到平衡后所产生的反馈抑制作用 , 进而
有利于 向形成产物方向的生化反应进行 。 由
此可见通过向培养基中加人吸附剂可刺激培
养细胞对产物的合成 ,进而达到提高产物产
量的 目的 , 类似的现象在用 x A D一 2 树脂回
收九 连小璧妞 。 ,吞e , 。` 扣 21。 。 。 。 ) 细胞培养液
回收药根碱试验中亦存在 lz[ 〕。
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一tL工es胜
(下转第 32 页 )
32生 物 技 术 9卷 l期
领域 , 使得鉴别 、 分离新基 因不再是一 个难
题 。如何进一步改进该技术 ,增加筛选出的基
因数 、 明确这些基因的生物学功能使其有利
于人类健康 , 这将是对信使 R N A 差 异显示
技术的新挑战 。
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一 17 4
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1 10 3
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13 8 5一 13 8 6
[ 2 0〕L i F , 。 t a 一 N u e l e ic ^ e沮 : R e : , 19 9峨, 2 2 : 17 6砚一 17 6 5
[ 2 1〕e o n s at e z G o , e t 己 . T r e n d s 伽 n o t , 19 9 6 , 1 2 ( 1 1 ) : 礴5 5
一 4 5 6
[ 2 2〕P o 五e r o M e , e t a l . N u e一e ic ^ e id : R es , 29 9 7 , 2 5 ( 4 ) :
9 13一 9 14
[ 2 3〕M o u L , 。 t a 一 B i o e h h e m s i o p h y R e s e o m m u n , 19 9峨,
19 9 ( 2 )
:
5 4 6一 5 6 9
〔2绝]众 a n g H . e t a 一 N u 。一e i e ^ icu s R o s , 29 0 6 , 2峨( 12 ) :
2 4 5 4一 2 4 5 5
[2 5 ]劝 a o s e , e r a一 B i o t e e h n iq u u e : , 19躺 , 20 ( 3 ) : 4 0 0一
40 4
[ 2 6 ] W an g x K
, e t a l
.
B i o t e e h n iq u e s , 19 9 5
,
18 ( 3)
:
4 48一
45 3
[ 2 7〕w e ls h J , e t 。 一 N u cl o ic A e记5 R e s , 19 9 2 , 2 0 :滩9 6 5一
49 7 0
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2 4 5
, :
4 8一 5 4
〔29 ] F胜 e h e r ^ . e t a一 P r o 。 N 。 t l ^ e a d s e i u s^ , 19 9 5 , 9 2 :
5 3 3 1一 5 3 3 5
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9 2
:
5 8一 6 5
(接第 1 0 页 )
S T U D Y O N T H E C O N D I T I O N S O F
V A N I L L I N P R O D U C A T I O N B Y B A T C H C E L L
S U S P E N S I O N C U L T U R E O F V乃乃汀 L L A P L 月乃江F O L I A
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( 1
.
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( 2
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T h is a r t i e le r e P o r t e d t h e e f f七e t s o f t h e k i n d s a n d c o n c e n t r a t io n o f c ar b o n s o u r c e s
,
n i t r o s e n s o u r e e s
’
a n d a b s o r b e n t s o n t h e e e l l g r o w t h a n d P r o d u e a t i o n o f v a n 沮 in o f V a 几`l l a
产乙a 龙汀。 忍她 e e l l s in b a t e h s u s P e n s i o n e u l t u r e · I t w as s h o w n t h a t s u c r o s e W a s t h e b e t t e r c a r b o n
s o u r e e t h an g l
u e o s e a n d fr u e t o s e fo r t h
e e e l l g r o w t h a n d va
n i l l in f o r m a t i o n : an d w h
e n i t s
e o n e e n t r i o n in M S m e d i u m w a s o f s P e r e e n t a g e
.
r h e b i o s y n t h e s is o f va
n il l i n h a d t h e l a r g e s t
n u m e r i e ia va l
u e ; n i t r a t e 一 n i t r o g e n im P r o ve d e e l l g r o w t h a n d va n i l l i n P r o d u e a t i o n , b u t
a m m o n ia 一 币 t r o g e n in h i b it e d v a n il l in f o r m a t i o n ; t h e u 吕a g e o f a b s o r b e n t s ( e · 9 . X A D 一 2 ,
a e t iva t
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a r e o a l ) h a d a m a r !: e d in
e r e a s in g e f fe e t o n t h e a e e u m u l a t i o n o f v a n i ll i n
.
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