全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 1 期 2011 年 1 月 • 56 •
青黛炮制过程中靛蓝定向生成的工艺设计与优化
刘泽玉 1，苏柘僮 1，杨 明 1, 2*，邹文铨 3
1. 成都中医药大学，四川 成都 610075
2. 江西中医学院 中药现代制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004
3. 四川大学，四川 成都 610065
摘 要：目的 筛选出青黛炮制过程中显著影响靛蓝生成的因素，优化最佳水平组合，确定生成靛蓝的最佳工艺。方法 应
用 HPLC 法测定粗靛中靛蓝；并以鲜叶产靛蓝的量（即靛蓝的转移率）为指标，采用 Plackett-Burman 设计，Box-Behnken
设计效应面分析等统计学方法，筛选出显著影响因素及最佳水平组合。结果 青黛的浸泡、打靛工艺确定为浸泡前不除蜡，
浸泡液 pH 3.5，溶剂用量与鲜叶质量比例为 13，避光、浸泡 24 h，温度 25 ℃，通气时间 30 min，加氨水调节打靛前 pH 值
至 9。结论 系统地优化了青黛浸泡、打靛环节的工艺，阐明了青黛炮制过程中各个影响因素对有效成分靛蓝的影响，为炮
制原理的研究奠定了基础。
关键词：青黛；靛蓝；Plackett-Burman 设计；Box-Behnken 设计；最佳工艺
中图分类号：R284.2; R286.02 文献标识码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)01 - 0056 - 05
Design and optimization of technology for orientation generated indigo
in processing of Indigo Naturalis
LIU Ze-yu1, SU Zhe-tong1, YANG Ming1, 2, ZOU Wen-quan3
1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China
2. Key Laboratory of Modern Preparation of Chinese Materia Medica, Ministry of Education, Jiangxi University of Traditional
Chinese Medicine, Nanchang 330004, China
3. Sichuan University, Chengdu 610065, China
Abstracts: Objective Screening the influencing factors that affect the indigo-generated significantly in processing of Indigo
Naturalis, the levels were optimized and combined to obtain the optimum technology for the indigo-generated. Methods Using an
HPLC method for determining indigo in crude Indigo Naturalis and taking indigo content generated from fresh leaf as an index, the
significantly influencing factors and the optimal level combination were screened by the statistical methods of Plackett-Burman design
and Box-Behnken design response surface analysis. Results The soaking and making indigo process of Indigo Naturalis was
identified as the wax was not removed before soaking, soaking pH value was 3.5, and solvent volume (mL) : leaf mass (g) was 13.
Soaked in dark at 25 ℃ for 24 h, and ventilation time of 30 min, then ammonia water was added to adjust pH value to 9. Conclusion
The soaking and making indigo process of Indigo Naturalis could be optimized systematically, it could be used to clarify the various
factors on the impact of the active indigo in the process of Indigo Naturalis. At the same time, it could lay the foundation for the study
on processing principle of Indigo Naturalis.
Key words: Indigo Naturalis; indigo; Plackett-Burman design; Box-Behnken design; optimum technology

青黛为爵床科植物马蓝 Baphicacanthus cusia
(Nees) Bremek.、蓼科植物蓼蓝 Polygonum tinctorium
Ait.或十字花科植物菘蓝 Isatis indigotica Fort.的叶
或茎叶经加工制得的干燥粉末或团块[1]。其炮制过
程是马蓝茎叶中的前体物质向靛蓝、靛玉红转化的
过程，主要包括浸泡、打靛、水飞精制等环节[2-5]。
笔者将传统浸泡工艺与文献报道[6]的在染布的
过程中菘蓝叶浸泡前处理对制靛的影响相结合，明
确了马蓝叶在浸泡过程中受除蜡、浸泡液 pH 值、
溶剂用量、温度、时间等多种因素影响。打靛时长
期依据经验，没有固定的参数控制，致使青黛的质
量参差不齐。前期研究[7-9]已明确青黛中有效成分靛

收稿日期：2010-04-07
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30772784）；《中国药典》2010 年版一部标准研究
作者简介：刘泽玉（1986—），女，河北省石家庄市人，硕士研究生，从事中药生产新技术和新剂型研究。
Tel: (028)61800127 E-mail: 409192399@qq.com
*通讯作者 杨 明 Tel: (028)87825696 E-mail: yangming16@126.com
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蓝和靛玉红的生成机制不同，故分别以靛蓝、靛玉
红的产量为指标，确定两条炮制工艺路线。本实验
通过采用 Plackett-Burman 设计、Box-Behnken 设计
效应面分析等统计学方法，筛选出显著影响因素并
确定最佳水平组合，优化了产生靛蓝的青黛炮制工
艺，阐明了炮制过程中各影响因素对有效成分靛蓝
的影响，为炮制原理的研究奠定了基础。
1 仪器与试药
岛津 LC－10ATvp 高效液相色谱仪（浙江智达
N2000 色谱工作站）；BP211D 型电子分析天平（德
国 Sartorius）；KQ—400DB 型数控超声波清洗器（昆
山市超声仪器有限公司）；SZ—93 型自动双重纯水
蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；LZB—FB 型转子
流量计（苏州化工仪表有限公司）；ACO 系列电磁式
空气压缩机（浙江森森实业有限公司）；SHB—ⅢS
循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。
马蓝茎叶由四川江油恒源药业集团有限公司提
供；靛蓝（批号 110716-200509）、靛玉红（批号
110717-200204）对照品由中国药品生物制品检定所
提供；甲醇（色谱纯，Fisher 公司）；水（重蒸水，
自制）；微孔滤头（0.2 μm，Millipore 公司）；其他
试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 青黛的制备工艺
以靛蓝的转移率为评价指标，制备青黛。将鲜
叶置于 pH 值约为 3.5 的 25 ℃自来水中，要求水与
鲜叶质量的比例为 13，避光，浸泡 24 h 后，滤过除
去叶渣，加氨水调节滤液 pH 9，再通空气 30 min
后，加入 10%新制的石灰乳（取鲜叶质量 10%的
CaO，加入 10 倍量的沸水中，不断搅拌，形成混悬
液，即可），搅拌均匀后静置 24 h，滤过取沉淀，干
燥即得粗靛。
2.2 粗靛中靛蓝的 HPLC 法测定[9]
2.2.1 色谱条件 色谱柱为安捷伦 Zorbax Extend
C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水
（70∶30）；检测波长为 289 nm；体积流量为 1.0
mL/min；柱温为室温。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取靛蓝对照品
4.28 mg，分别加入 N, N-二甲基甲酰胺 100 mL，超
声处理 30 min，冷却至室温，作为贮备液。
2.2.3 供试品溶液的制备 取适量的粗靛置研钵中
研匀，称取粗靛 0.05 g，加入 N, N-二甲基甲酰胺 100
mL，超声 30 min，冷却至室温，过 0.2 μm 微孔滤
膜，取续滤液，即得。
2.3 Plackett-Burman 试验方法
选用 Plackett-Burman 设计对影响浸泡、打靛环
节的 8 个因素的重要性进行考察。共 8 个因素做 12
个试验，每个因素取高、低两种水平。Design Expert
7.1 软件设计试验并进行数据处理。比较各因素 P
值，P＜0.05 的因素作为显著影响因素，为下一步
Box-Behnken 设计效应面分析提供指导。
2.3.1 试验因素范围及水平的规定 以叶子前处理
是否除蜡（A）、浸泡液 pH 值（B）、浸泡是否避光
（C）、溶剂体积与鲜叶质量比例（D）、浸泡时间（E）、
温度（F）、加碱种类（G）、通空气时间（H）8 个因
素作为考察对象。每个因素选择了高（＋1）、低
（－1）两个水平，试验次数为 12。试验因素水平
见表 1。
表 1 Plackett-Burman 设计因子的水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design
因 素 水
平 A B C D/(mL : g) E/h F/℃ G H/min
−1 除蜡 3.5 避光 8 12 30 石灰乳 30
1 不除蜡 7 不避光 15 36 60 氨水 240

2.3.2 Plackett-Burman 试验结果及分析 8 个因素
12 个试验，按 Plackett-Burman 设计表进行试验，
每个试验号重复做 3 次，粗靛测定结果取 3 次的均
值，再转化为鲜叶中的产靛量。Plackett-Burman 试
验设计及响应值（靛蓝的转化率）见表 2。
可以看出，各个因素对产靛有比较显著的影响。
运用 Design Expert 7.1 软件对表 2 进行回归分析，
各因素的显著性见表 3。
对各因素的显著性分析看出，各因素对响应值
（靛蓝转移率）影响的显著性顺序为：溶剂体积、浸
泡温度、通气时间、是否除蜡、浸泡 pH 值、浸泡
时间、是否避光、加碱种类。其中溶剂体积、浸泡
温度、通气时间、是否除蜡 4 个因素对生产靛蓝有
显著性影响。此结果为下一步 Box-Behnken 设计效
应面分析试验提供了依据。
2.4 Box-Behnken 效应面试验
2.4.1 Box-Behnken 试验方法 此法既能考察各个
因素对效应值（靛蓝转化率）的影响及各影响因素
间交互作用，也能进行各个因素的最优化，建立数
学模型并作出相应的三维应变量曲面图，对因素与
指标的关系进行直观的量化分析。
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表 2 Plackett-Burman 试验设计及响应值
Table 2 Design and response value of Plackett-Burman test
试验号 A B C D E F G H 靛蓝转化率/(mg·g−1)
1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 1.18
2 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 0.27
3 1 −1 1 1 −1 1 1 1 1.21
4 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 1.51
5 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 0.32
6 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 0.12
7 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 0.81
8 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 0.25
9 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 0.75
10 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 1.52
11 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1.35
12 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 0.00

表 3 各因素显著性分析
Table 3 Significance analysis of factors
影响因素 P 值 显著性
是否除蜡 0.045 9 P＜0.05
浸泡液 pH 值 0.055 0
是否避光 0.066 8
溶剂体积与鲜叶质量比例 0.003 8 P＜0.05
浸泡时间 0.062 3
浸泡温度 0.018 2
加碱种类 0.933 0
通气时间 0.037 3
2.4.2 Box-Behnken 设计因子的水平范围的规定 溶
剂体积、浸泡温度、通气时间、除蜡否对靛蓝转移
率均有显著性影响。故选用对浸泡和打靛环节影响
显著的 3 个因素即溶剂体积与鲜叶质量比例（X1）、
通气时间（X2）、浸泡温度（X3）为因素（设计因素
水平见表 4），以粗靛中靛蓝转移率为效应进行
Box-Behnken 设计-效应面优化实验，并采用 Design
Expert 7.1 软件对实验数据（表 4）进行拟合分析。
每一自变量的低、中、高实验水平分别以−1、0、1
进行编码，各自变量的编码见表 4。
按照 Box-Behnken 试验设计的统计学要求，实
验模型通过最小二乘法拟合二次多项式方程可以表
数，Xi、Xj（i＝1、2、3；i≠j）为自变量真实值。
多项式模型方程拟合的性质由确定系数 R2 表达，其
统计学上的显著性由 F 值检验；采用 Design Expert
7.1 软件分析。
2.4.3 Box-Behnken 试验设计及结果 3 个因素 17
个试验，按 Box-Behnken 设计表进行试验，每个试
表 4 Box-Behnken 设计因素水平及编码
Table 4 Factors, levels, and codes of Box-Behnken design
因 素
编码水平
X1 X2 X3
−1 8 30 25
0 11.5 135 42.5
1 15 240 60
验号做 3 次重复，粗靛测定结果取 3 次的均值，再
转化为鲜叶中的产靛量。Box-Behnken 试验设计及
响应值（靛蓝转移率）见表 5（第 13～17 次实验为
5 次重复的中心点实验，用于考察模型的误差）。
经F值检验显示总模型方程显著（P＝0.006 2），
R2＝0.910 4，失拟性检验不显著（P＝0.903 1），表
明该回归模型的拟合情况良好，回归方程的代表性
较好，能准确的预测实际情况。其校正决定系数
R2adj＝0.795 1，表明 79.51%的试验数据的变异性可
用此回归模型来解释，实验过程中存在一定的误差，
大约有 20%不能由此模型进行解释，回归方程为
Y＝2.04 X1－0.01 X2－0.09 X3＋4.69×10-4 X1X2－
0.01 X1X3＋ 2.51×10-4 X2X3－0.07 X12－1.34×10-5
X22＋1.98×10-3 X32－7.99。
根据回归分析结果，作出相应曲面图，见图 1。
溶剂体积和浸泡温度较通气时间对靛蓝转移率影响
更大，溶剂体积和浸泡温度间的交互作用非常显著，
两者均明显地影响靛蓝转移率；通气时间和浸泡温
度间有一定交互作用，而溶剂体积和通气时间交互
作用微弱。可以看出，靛蓝转移率与不断增加的溶
剂量间呈现出先升后降的趋势，当溶剂量为 12～14
倍时，靛蓝转移率相对最高，随着溶剂量的继续增
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表 5 Box-Behnken 试验设计及响应值
Table 5 Design and response value of Box-Behnken test
试验号 X1 X2/min X3/℃ 靛蓝转移率/(mg·g−1)
1 −1 −1 0 0.220 6
2 1 −1 0 0.067 3
3 −1 1 0 0.057 8
4 1 1 0 0.593 6
5 −1 0 −1 0.191 0
6 1 0 −1 1.809 9
7 −1 0 1 1.474 1
8 1 0 1 0.485 7
9 0 −1 −1 2.347 7
10 0 1 −1 1.455 5
11 0 −1 1 1.030 3
12 0 1 1 1.985 1
13 0 0 0 0.904 8
14 0 0 0 1.050 0
15 0 0 0 1.924 2
16 0 0 0 1.280 9
17 0 0 0 1.066 4

加，靛蓝转移率反而轻微降低；随着通气时间的延
长靛蓝转移率逐渐降低。随着温度的提高，靛蓝转
移率呈现先降后升的趋势，当浸泡温度为 25～30
℃时，靛蓝转移率相对最高。靛蓝转移率随着通气
时间的延长而降低，当通气时间在 30～90 min 时，
靛蓝转移率相对最高。综上所述，当温度在 25～30
℃，通气时间在 30～90 min，溶剂量为 12～14 倍
变动时，靛蓝转移率相对较高。
2.4.4 验证试验 为了确定建立模型与试验结果是
否相符，通过进一步试验对模型的可靠性进行验证，
在验证试验中，各因素取值在温度为 25～30 ℃，
通气时间 30～90 min，溶剂量 12～14 倍（取整数
进行组合，其中时间间隔为 10 min），根据模型的
计算结果筛选出靛蓝转移率＞2 mg/g 的组合共进行
9 组试验，靛蓝转移率见表 6，实测值与模型计算值
间的相对标准偏差均小于 3%，说明该模型比较可
靠。其中第 5 组的 RSD 最小，说明此组合生成的靛

图 1 各因素对靛蓝转移率影响的效应面图
Fig. 1 Response surface of factors effect on indigo transfer rate
表 6 验证试验较优组合及试验结果
Table 6 Optimized group and results of verification test
靛蓝转移率/(mg·g−1)
试验号 预测值 实测值 RSD/%
1 2.13 2.09 1.91
2 2.07 2.11 1.89
3 2.01 1.96 2.55
4 2.03 1.98 2.53
5 2.15 2.13 0.94
6 2.09 2.03 2.96
7 2.02 2.07 2.42
8 2.03 2.00 1.50
9 2.03 1.98 2.53
蓝量与预测值最接近，故在较优组合中青黛炮制工
艺产生靛蓝的相对最优工艺条件为溶剂用量 13 倍，
浸泡温度 25 ℃，通气时间 30 min。
综上所述，以靛蓝为评价指标的青黛的浸泡、
打靛工艺确定为浸泡前不除蜡、浸泡液 pH 3.5、溶
剂用量与鲜叶质量比例为 13、避光、浸泡时间 24 h、
浸泡温度 25 ℃、通气时间 30 min、加氨水调节打
靛前 pH 值至 9。
3 讨论
国内文献尚无关于青黛炮制工艺的研究资料，
一般工艺研究常采用均匀设计和正交设计的方法选
择较佳工艺，由于其试验次数少，数据处理和操作
都较方便，其应用已达到了普及的程度，然而在这
两种方法的应用过程存在误区，它们是基于线性模
型设计的方法，然而事实上影响因素与效应间有时
可能不是线性关系，若忽略这种情况简单进行线性
模型设计，则会很大程度上与真实值偏离，而效应
通气时间
通气时间 溶剂体积︰鲜叶质 13.25 溶剂体积︰鲜叶质 浸泡温度
浸泡温度
靛
蓝
产
量

靛
蓝
产
量

靛
蓝
产
量

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面法运用效应面曲面模型进行分析，基于非线性模
式进行设计和研究比较合理。
本实验采用了 Box-Behnken 设计，其充分考虑
到各因素的交互作用，设计方法简单，试验次数少，
在中心点进行重复试验以提高试验精度，同时采用
非线性模型拟合，可信度较好，预测值更接近真实
值。与正交及均匀设计相比，此方法所得结果更加
直观，便于分析。
传统青黛炮制过程均依赖老药工的经验控制浸
泡时间、浸泡温度、打靛加入石灰量等影响靛蓝生
成的重要因素，没有固定的参数控制，炮制工艺不
规范，最终导致产品质量参差不齐，药效相差甚远。
本实验以靛蓝为评价指标研究了青黛炮制工艺，量
化了各个工艺参数，确定了工艺路线，为青黛炮制
的产业化、自动化奠定基础。
前期文献调研中，参阅国外染料业制靛原理，
阐明了靛蓝和靛玉红不同生成机制，总结出了可能
影响青黛浸泡、打靛环节的 8 个因素，系统地对各
因素进行了研究，建立了炮制原理指导炮制工艺的
研究模式。
参考文献
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