全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 21 期 2013 年 11 月

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基于 ITS2 序列的杜仲及其主要混伪品的鉴定
彭 梓 1, 2，朱金国 2，谭建锡 2，王利兵 1, 2*
1. 湖南农业大学，湖南 长沙 410128
2. 湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，湖南 长沙 410004
摘 要：目的 分析杜仲及其混伪品的 ITS2 条形码序列，探讨杜仲及其混伪品鉴定的新方法，为杜绝市售商品药材混乱现
象提供技术支撑。方法 提取样品 DNA，利用 PCR 方法对样品进行核基因 ITS2 片段扩增，采用 DNA 克隆测序技术对 ITS2
基因进行双向测序，所得序列经 Seqman 程序拼接后，用软件 MEGA 4.1 进行相关数据分析，并构建邻接（Nighbor-joining, NJ）
树。利用网站已建立的 ITS2 数据库预测 ITS2 二级结构。结果 杜仲种内最大 K2P 遗传距离远远小于其与混伪品的种间最
小 K2P 遗传距离；由构建的系统聚类树图可以看出，不同来源的杜仲样品聚成一支，表现为单性系，并与其他混伪品明显
分开；比较 ITS2 二级结构发现，杜仲与其混伪品在 4 个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差
异。结论 ITS2 序列作为 DNA 条形码可以有效地鉴别杜仲及其混伪品，为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子
依据。
关键词：杜仲；混伪品；ITS2；DNA 克隆；二级结构
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)21 - 3042 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.21.019
Identification of Eucommia ulmoides and its adulterants based on ITS2 sequences
PENG Zi1, 2, ZHU Jin-guo2, TAN Jian-xi2, WANG Li-bing1, 2
1. Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
2. Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changsha 410004, China
Abstract: Objective To identify Eucommia ulmoides and its adulterants using ITS2 barcode, to discuss the feasibility of this new
method, and to provide the technical support for the prevention against the confusion of commercial medicinal materials. Methods
DNA was extracted from each sample as template, the ITS2 region was amplified by PCR technology and sequenced bidirectionally
using DNA cloning sequencing method. The sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the Seqman
program. Phylogenetic study was performed by MEGA 4.1, and the Nighbor-joining (NJ) dendrogram was constructed. The ITS2
secondary structure was predicted using the ITS2 website. Results The maximum Kimura-2-parameter (K2P) genetic distance of E.
ulmoides was far lower than the minimum K2P genetic distance of the adulterants. In the cluster dendrogram, E. ulmoides samples from
various sources showed the monophyletic and simultaneously distinguished from the adulterants. To compare the ITS2 secondary
structure, it could be noticed that ITS2 secondary structure could distinguish E. ulmoides from its adulterants in terms of numbers,
sizes, positions of loop, and the angles of helix exsertion in four helix regions. Conclusion ITS2 barcode could be used to distinguish
E. ulmoides from its adulterants effectively, and provide the important molecular evidence for the identification of germplasm
rescouces and clinic safety in medicinal use.
Key words: Eucommia ulmoides Oliv.; adulterants; ITS2; DNA cloning; secondary structure

杜仲为杜仲科杜仲属杜仲 Eucommia ulmoides
Oliv. 的干燥树皮，是名贵的中药材和提取天然橡胶
的工业原料[1-2]，为我国特有的珍稀濒危第二类保护
植物。因国内外对杜仲的需求急剧增加，原有的“道
地药材”货源不足，各地曾一度出现混淆品，少数
不法分子掺伪作假、以伪乱真，兜售假药以牟取暴

收稿日期：2013-07-05
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划课题（2012BAK01B07）
作者简介：彭 梓（1981—），女，博士研究生，研究方向为功能产品研究与评价。E-mail: pz_penny81@aliyun.com
*通信作者 王利兵 E-mail: Wanglb@126.com
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利，有些参与中药流通的人员缺乏必要的鉴别知识
或经验不足，使一些杜仲混用品、代用品及伪品，
进入商品流通渠道，严重影响了药材质量和临床疗
效。目前市场上常见杜仲伪品主要涉及 4 科，其中
以卫矛科最多，如冬青卫矛 Euonymus japonicus
Thunb.、扶芳藤 E. fortunei (Turcz.) Hand.-Mazz.、白
杜 E. maackii Rupr. 等；夹竹桃科次之，包括紫花络
石 Trachelospemum axillare Hook.f. 、毛杜仲藤
Parabarium huaitingii Chun et Tsiang 等，另有大风
子科栀子皮 Itoa orienthalis Hemsl.及紫草科粗糠树
Ehretia dicksonii Wall.[3-5]。
对于杜仲，以往研究大都以树皮、叶片等形态
差异和解剖学特征，有时结合理化分析来鉴别[3-6]，
非长期从事该工作的专家不能胜任原植物和药品的
鉴定工作，不仅费时费力，且准确鉴定存在一定难
度。近年来，随着分子生物学技术的发展，体现物
种遗传本质的 DNA 分子已成为物种鉴定的有效分
析手段。虽然目前已有通过 DNA 分子特征对杜仲
进行分类学鉴定的研究报道[7-9]，但皆只单独以杜仲
为研究对象，未对杜仲伪品进行 DNA 分子研究，
缺少真伪品的核苷酸差异比较信息，不能提供可靠
的分子鉴别数据。
DNA 条形码是利用基因组中一段公认标准的
DNA 片段来对物种进行准确鉴定的新技术[10-13]。
DNA 条形码技术具有操作简便、准确、快速的优
势，不受样品发育阶段（叶片、种子、花等）、药
材形态（原药材或粉末）以及研究者的专业水平
限制，具有较强的通用性[14]。目前，对于植物来
说，通用的 DNA 条形码序列仍未最终确定，但作
为 DNA 候选序列的 ITS2 片段因其具有较强引物
通用性、扩增高效性以及足够的序列变异性，而
被大家广泛关注[15-19]。本研究利用 ITS2 序列对杜
仲源植物及其多种混伪品进行 DNA 条形码鉴别
研究，旨在为该药材的准确鉴定提供分子依据，
同时为研究和建立满足生物资源查验的技术体系
打下基础。
1 材料
杜仲及其主要混伪品采集自湖南农业大学、广
西、浙江、云南等地，并经笔者鉴定确认。实验材
料及 GenBank 登录号见表 1。
表 1 样品来源
Table 1 Sources of samples
材料 拉丁学名 采集地 GenBank 号
杜仲 Eucommia ulmoides 湖南农业大学耘园 KC999842
杜仲 广西南宁 KC904097
杜仲 未知 JF755927
杜仲 未知 JF755926
杜仲 未知 AY650005
杜仲 未知 AY649997
扶芳藤 Euonymus fortunei 广西南宁 KC999833
扶芳藤 广东广州 KC999834
扶芳藤 江苏南京 KC999835
冬青卫矛 E. japonicus 广东广州 KC999836
冬青卫矛 江苏宿迁 KC999837
白杜 E. maackii 云南昆明 KC999830
大果卫矛 E. myrianthus 浙江九龙山 KC999832
紫花络石 Trachelospermum axillare 浙江九龙山 KC999841
毛杜仲藤药材 Parabarium huaitingii 广西玉宁 KC999838
粗糠树 Ehretia dicksonii 广西南宁 KC999831
栀子皮 Itoa orientalis 广西南宁 KC999839
栀子皮 云南昆明 KC999840
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2 方法
2.1 DNA 提取
取 0.5 g 新鲜叶片，用液氮研磨后，利用 DNA
提取试剂（Promega A7943），参照其产品说明提取
总 DNA。对于干燥药材，挑取无霉变和虫蛀的材料，
使用 70%乙醇擦洗表面，并用无水乙醇浸泡 5 min，
提取缓冲液采用 3% CTAB，并添加 6% PVP-40 以
及 0.3%的 β-巯基乙醇，提取 DNA 参照文献方法[20]。
2.2 PCR 扩增
扩增引物正向为 5’-ATGCGATACTTGGTGTG-
AAT-3’，反向为 5’-GACGCTTCTCCAGACTACA-
AT-3’。PCR 反应体积 25 μL，反应体系及扩增程序
参照文献方法[21]。
2.3 DNA 测序
采用克隆测序，PCR 产物经 Gel Extraction Mini
Kit（OMEGA 公司）纯化后，与 pMD18-T 载体连
接，转化感受态细胞 JM107，通过蓝白斑筛选和特
异 PCR 鉴定重组质粒。阳性重组质粒交由上海生工
公司进行测序，每个样本检测 3 个以上克隆。各样
本采用正、反双向测序，以确保测序结果的准确性。
2.4 数据处理
使用DNAStar 7.1软件包中的Seqman程序对测
序峰图进行序列拼接，去除载体及引物区，获得严
格一致性序列。实验数据与 GenBank 上下载的 ITS2
序列采用基于隐马尔可夫模型的 HMMer 注释方法
去除两端 5.8 S 和 26 S，获得 ITS2 间隔区序列。通
过 MEGA4.1 软件查看序列的碱基组成，基于
Kimura-2-parameter（K2P）双参数模型计算序列间
的遗传距离，并用邻接（Neighbour-joining，NJ）
法构建系统聚类树。利用 bootstrap（1 000 次重复）
检验各分支的支持率。根据 Koetschan 等建立的
ITS2 数据库及其网站预测杜仲及其混伪品 ITS2 茎
环二级结构[22]。
3 结果与分析
3.1 杜仲及其混伪品 ITS2 序列种内种间比较
实验共获得杜仲及其混伪品 ITS2序列共14条，
从 Genbank 下载序列 4 条。杜仲 ITS2 间隔区 6 条
序列之间有 1 个碱基长度差异，其中 4 条序列长度
为 210 bp，2 条为 211 bp，GC 量为 66.0%，具有 1
个 polyG 结构，种内不同来源样品序列比对后，参
照其 consensus 序列，有七个变异位点，其中 1 个
为碱基缺失/插入，其他均为单碱基变异（图 1）。
基于 K2P 双参数模型计算遗传距离，杜仲种内平均
K2P 为 0.013，种内最大 K2P 为 0.033。
杜仲各混伪品的 ITS2 序列长度为 214～235
bp，以粗糠树序列为最长。杜仲与其各混伪品种间
序列进行比对后，长度为 259 bp，ITS2 序列间存在
较多的变异位点（图 1）。杜仲与各混伪品种间平均
K2P 距离为 0.651，种间最小 K2P 距离为 0.408。其
中杜仲与粗糠树遗传距离较近，为 0.431，而与紫花
络石距离较远，为 0.787。
3.2 聚类分析
基于 ITS2 序列，利用 MEGA4.0 构建的 NJ 系
统聚类树（图 2）显示，不同来源的杜仲样品聚在
一支，自展支持率达到 100%，表现出单系性。同
时，混伪品扶芳藤、冬青卫矛的不同样品各自聚为
一支，分属同一科的不同物种又分别聚集为一支，
且自展支持率均较高，通过 NJ 树图可以明显看出，
杜仲能够与其混伪品区分开。
3.3 杜仲及其混伪品 ITS2 序列的二级结构
杜仲及其混伪品的 ITS2 二级结构预测见图 3。
由图 3 可见，所有样品的二级结构均为一个中心环
（主环）及 4 个螺旋区（Helix）构成，每个螺旋上
有大小不一，数量不等的茎环（Loop）结构。通过
比较杜仲与其混伪品的 ITS2 二级结构发现，它们之
间结构差异较大，其茎环数目、大小、位置以及螺
旋发出时的角度均各有不同。因此，依据 ITS2 二级
结构，可以直观地鉴别杜仲及其混伪品。
4 讨论
杜仲是杜仲科杜仲属仅存的第三纪孑遗植
物，其自古以来以皮入药而著称，具有强筋骨、
补肝肾、久服轻身耐老等作用，为中药上品。而
市面上出现的杜仲混伪品其功效与正品相差很
大，甚至功效相反或具有毒副作用，极大危害患
者健康。为了准确鉴定杜仲，确保其用药安全、
有效，本研究于各地采集了杜仲以及不同科属的
混伪品，并从 GenBank 上下载该物种的相关序列，
利用 DNA 条形码 ITS2 序列片段，对杜仲及其混
伪品进行鉴别研究。结果发现杜仲的 ITS2 条形码
序列长度较短，其种内平均 K2P 距离 0.013 远远
小于其与混伪品的种间平均 K2P 距离 0.408，在
基于 NJ 法构建的系统聚类树中，各物种均表现出
了单系性，而与其他物种明显区分开，ITS2 二级
结构所揭示的分子形态学特征又进一步直观显示
出杜仲与其混伪品的明显差异。因此，基于 ITS2
条形码可有效鉴别杜仲及其主要混伪品。该研究
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 21 期 2013 年 11 月

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图 1 杜仲及其混伪品 ITS2 序列的种内种间变异
Fig. 1 Intraspecific and interspecific variation of ITS2 sequence in E. ulmoides and its adulterants

杜仲 AY649997
杜仲 KC999842
杜仲 JF755926
杜仲 KC904097
杜仲 JF755927
杜仲 AY650005
扶芳藤 KC999833
扶芳藤 KC999834
扶芳藤 KC999835
冬青卫矛 KC999836
冬青卫矛 KC999837
白杜 KC999830
大果卫矛 KC999832
紫花络石 KC999841
毛杜仲藤药材 KC999838
粗糠树 KC999831
栀子皮 KC999839
栀子皮 KC999840




杜仲 AY649997
杜仲 KC999842
杜仲 JF755926
杜仲 KC904097
杜仲 JF755927
杜仲 AY650005
扶芳藤 KC999833
扶芳藤 KC999834
扶芳藤 KC999835
冬青卫矛 KC999836
冬青卫矛 KC999837
白杜 KC999830
大果卫矛 KC999832
紫花络石 KC999841
毛杜仲藤药材 KC999838
粗糠树 KC999831
栀子皮 KC999839
栀子皮 KC999840




杜仲 AY649997
杜仲 KC999842
杜仲 JF755926
杜仲 KC904097
杜仲 JF755927
杜仲 AY650005
扶芳藤 KC999833
扶芳藤 KC999834
扶芳藤 KC999835
冬青卫矛 KC999836
冬青卫矛 KC999837
白杜 KC999830
大果卫矛 KC999832
紫花络石 KC999841
毛杜仲藤药材 KC999838
粗糠树 KC999831
栀子皮 KC999839
栀子皮 KC999840
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图 2 基于 ITS2 序列构建的杜仲及其混伪品的邻接树
Fig. 2 NJ dendrograms of E. ulmoides and its adulterants
based on ITS2 sequences
具有重要的应用价值，可大大推进杜仲药材的快
速准确鉴定。
分子生物学的发展为中药鉴定提供了新的技术
和方法，DNA 条形码技术是近些年国际上新发展起
来的物种鉴定技术。与其他分子鉴定方法相比，
DNA 条形码鉴定具有方法快速、准确、通用性强、
可重复性良好、易于推广和标准化等独特优势，克
服了传统鉴定方法的局限性。当前中药产业迅速发
展，其鉴定需求亦愈来愈大，DNA 条形码技术对于
缓解传统鉴定人才缺乏和药材鉴定困难具有重要意
义。有研究表明 ITS2 序列可以作为植物鉴定的通用
DNA 条形码序列，其二级结构能够为发现新物种和
分类学提供更多的信息[23]，在中药鉴定乃至出入境
物种资源查验方面将显示出巨大的应用潜力。


图 3 杜仲及其混伪品的 ITS2 二级结构比较
Fig. 3 Comparison on ITS2 secondary structure between E. ulmoides and its adulterants
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杜仲 KC999842
杜仲 JF755927
杜仲 JF755926
杜仲 KC999842
杜仲 AY650005
杜仲 KC904097
粗糠树 KC999831
扶芳藤 KC999833
扶芳藤 KC999835
扶芳藤 KC999834
冬青卫矛 KC999837
冬青卫矛 KC999836
白杜 KC999830
大果卫矛 KC999832
栀子皮 KC999839
栀子皮 KC999840
紫花络石 KC999841
毛杜仲藤药材 KC999838
100
96
95
89
98
100 88
97
100
100



150
130
161
120 171
107 181
96 84
59
45
20
1 211
193
137
126 156
111
168
98 18388 63
51
16
34
1 214
194
136
126 156
108 173
97 184
87
62
75
52
42
14
1 215
195
137
127 157
109 174
98 186 197
8878
66
55
22145 1434
24
137
127 157
109
174
98
185 196
88
5576
66
45 11
2234
11 220
119 138
154
105
164
93
176 82
57
70
45
35
16
1 215
204
189
110
138
99
148
158
86
171
181 201
73
43
54
1431
1 225
120
136
110
150
100
160
176
89
187
204
2281
49
79
61
33
13
149
163138
126
178
190 114
200
103 80
92
68 55
18 28
43
1 235
213
杜仲 白杜 大果卫矛 扶芳藤 大叶黄杨
栀子皮 紫花络石 毛杜仲藤 粗糠树
207
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