全 文 ：灯盏花种质资源遗传关系的 ISSR分析
杨生超1, 2 , 文国松1 ,刘雪玲1 ,杨永建1 ,李 元1 ,孟珍贵1 ,杨建文2*
( 1 云南农业大学 中药材研究所/云南省中药材规范化种植技术指导中心, 云南 昆明 650201;
2 红河州灯盏花研究所,云南 泸西 652400)
摘 要:目的 研究灯盏花种质资源间的遗传关系。方法 对采自云南、贵州和四川等地的 36 份灯盏花种质资源
进行 ISSR遗传多样性分析和 NT SYS2 聚类分析。结果 筛选出的 13 个引物在 36 份种质资源中共产生 125 条
DNA片段,其中 103 条带具有遗传多态性, 约占 82. 40%。当遗传相似性系数为 0. 54 时, 可以把灯盏花分为 5 大
类,第大类包括采自楚雄、昭通、迪庆等地的 7份种质资源; 第大类可分为 2 个亚类, A 包括采自滇中及滇西
北的 5 份种质资源, B 包括采自滇东北、贵州、四川的 20份种质资源;第大类包括采自文山的 1 份种质资源; 第
大类包括采自曲靖的 1 份种质资源;第大类包括采自迪庆的 2份种质资源。结论 灯盏花种质资源遗传变异
丰富,遗传关系与其采集地的地理分布距离具有一定的相关性,但并非严格按地理界线聚在一起。
关键词:灯盏花; 种质资源;遗传关系; ISSR
中图分类号: R282 7 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1523-05
ISSR Analysis on genetic relationships of Erigeron breviscapus germplasm resources
YANG Sheng-chao
1, 2
, WEN Guo-song
1
, L IU Xue- ling
1
, YAN G Yong- jian
1
, L I Yuan
1
,
M ENG Zhen-gui1 , YANG Jian-w en2
( 1 Institute of Chinese Medicinal Materials of Yunnan Ag ricultural Univeristy/ Yunnan P rovincial Center of Chinese Medicinal Materials
GAP T echnolog y, Kunming 650201, China; 2 Institute of H erbal Erig erontis o f Honghe Prefecture, Lux i 652400, China)
Abstract: Objective T o invest igate the genet ic relat ionships of Er igeron br ev iscapus at the molecular
biolo gy level Methods T hirty six g ermplasm resources of E brevi scap us collected f rom Yunnan,
Sichuan, and Guizhou Pr ovinces in 2005 w ere analy zed by inter-simple sequence repeat ( ISSR) and cluster
analysis based on NT SYS2 Results A total of 13 pr imer s w er e screened and 125 bands w ere amplif ied,
among which 103 bands ( 82. 40%) w ere found to be po lymor phic T hirty six germplasm resources of E
br ev iscapus were clustered into five g roups at genet ic distance 0. 54, the g roup included f ive germplasm
resources collected from Chux iong, Zhaotong, and Diqing of Yunnan Province; the group included 25
germplasm resources collected fr om Guizhou, Sichuan, and Northw est of Yunnan Province; gr oup in-
cluded one germplasm resource co llected f rom Wenshan of Yunnan Province; the g roup included one
germplasm resource co llected f rom Qujing of Yunnan Pr ovince; the g roup included tw o germplasm re-
sources co llected f rom Diqing of Yunnan Province Conclusion There is abundant genet ic div ersity in the
germplasm resources of E br evi scapus, and the genet ic relat ionships ar e closely r elated to geogr aphical
distance w her e they are co llected
Key words: Er igeron br ev iscapus ( Vant ) Hand-Mazz ; germplasm resour ces; genet ic r elat ionships;
ISSR
灯盏花 Erigeron breviscapus ( Vant ) Hand
-Mazz又名灯盏细辛或短葶飞蓬,为菊科( Compos-i
tae)飞蓬属多年生草本植物, 主要分布于我国西部和
西南部的云南、四川、贵州、广西、西藏、湖南等省
区[ 1]。灯盏花具有散寒解表、祛风除湿、舒筋活血、消
积止痛等功效,其主要化学成分灯盏乙素是治疗闭塞
1523中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 12-12 基金项目:国家 十五攻关项目( 2004BA721A34) ; 云南省 十一五社会发展攻关项目 ( 2006SG016) ;国家自然科学基金( 30760301,
30660040)作者简介:杨生超( 1972 ) ,男,博士,教授,硕士生导师,主要从事药用植物资源及规范化种植研究。
T el / Fax: ( 0871) 5227160 E- mail : shengchaoyan g@ 163. com
* 通讯作者 杨建文 T el/ Fex: ( 0873) 6652208 E-mail: lx qssw@ 163. com
性脑血管疾病和脑溢血后遗症的天然特效药物[ 2]。
经多年的引种驯化,云南省泸西县实现了灯盏花的规
模化种植[ 3-4] ,并建立了 GAP 基地 [5] 。灯盏花种质资
源是其育种的基础,种质资源间遗传关系的探明有利
于促进种质资源保护和利用。目前已有灯盏花种质
资源的表型性状[ 6]、等位酶[ 7]、RAPD分子[ 8-9]、DALP
分子[ 10]等方面的遗传多样性与遗传关系的研究报
道。采自灯盏花主要分布区的云南、四川和贵州 3省
并保育于昆明种质资源圃的种质资源遗传多样性丰
富,种质资源间 RAPD分子遗传关系与其采集地的地
理分布距离密切相关[ 9] ,其灯盏乙素和咖啡酸酯的量
变异较大 [11] , 是灯盏花育种的基因库。简单重复序
列区间( inter-simple sequence repeat, ISSR)分子技术
已广泛应用于中药材的分子标记和遗传育种[ 12-17]。
为进一步了解灯盏花种质资源间的遗传关系, 应用
ISSR分子标记对采自云南灯盏花主要分布区和四
川、贵州两省并保育于昆明的 36份灯盏花种质资源
进行遗传关系研究,以期为全面地了解我国灯盏花种
质资源的遗传多样性特征,以及灯盏花种质资源的保
护、评价和利用奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料: 实验材料选自 2005年采自云南灯盏花
主要分布区的昭通、曲靖、红河、文山、昆明、楚雄、大
理、丽江、迪庆等 9个州(市)的 18个县,四川的 2个
县和贵州的 2个县, 并保育于云南生物谷灯盏花药
材料业有限公司的 36份灯盏花种质资源(表 1)。
表 1 灯盏花种质资源及来源
Table 1 Germplasm resources and their original location of E breviscapus
编号 采集地点 海拔/ m 编号 采集地点 海拔/ m
D32 云南双柏妥甸后山 2 050 D61 云南武定云白药基地 2 500
D33 云南武定岩子头 2 300 D62 云南永仁高山 2 300
D35 云南昭阳靖安松杉 2 200 D63 云南古城雪山村 2 860
D36 云南昭阳靖安西魁 2 200 D65 云南香格里拉 3 350
D37 云南宣威得禄 2 120 D66 云南大理苍山 2 200
D38 云南鲁甸岔口 1 960 D75 云南古城 2 410
D40 云南沾益石合(小个体居群) 2 150 D76 云南香格里拉 3 280
D42 云南沾益石合(大个体居群) 2 150 D77 云南香格里拉 3 280
D43 云南马龙 2 100 D78 云南香格里拉 3 280
D46 贵州印江梵静山山口 900 D79 云南弥勒 1 850
D47 贵州印江梵静山护国寺 1 000 D80 云南弥勒东山 2 100
D48 贵州雷山西江雷公山 1 000 D81 云南砚山阿猛 1 950
D49 贵州雷山西江雷公山 1 100 D82 云南弥勒 1 980
D50 贵州雷山西江雷公山 1 100 D83 云南个旧卡房 2 200
D51 贵州雷山西江雷公山 1 200 D84 云南丘北 1 800
D52 云南大理苍山 2 320 D87 云南会泽 2 600
D59 四川西昌 2 600 D88 云南古城 2 800
D60 四川德昌马鞍山 2 700 D89 云南丘北 1 900
1. 2 总 DNA 的提取及检测:用优化后的 CTAB 法
提取总 DNA。具体步骤: 每份资源取 1~ 12 个单
株,每株取 1~ 2片新鲜叶片, 放入预先灭菌、预冷处
理过的研钵中, 加入液氮研磨成粉状;将细粉末迅速
转移到离心管中,加入 1 mL CT AB提取液,充分混
匀,置于 62 水浴中保温 1 h; 从水浴中取出离心
管, 12 000 r/ min离心 10 min,将上清液转移到另一
新离心管中; 每管中加入 1/ 2 体积的氯仿-异戊醇
( 24 1) , 轻缓地颠倒混匀, 12 000 r/ min 离心 5
min, 上清液转至另一新离心管中;每管中加入 1/ 10
体积的 7. 5 mol/ L 醋酸胺和等体积的冰乙醇
( 100%) , 混匀, 放置在- 20 的冰箱中 30 m in;
12 000 r/ m in离心 15 m in获得 DNA 沉淀, 70% 的
乙醇洗两次,风干沉淀;加入 60 L T E 缓冲液溶解
DNA,并储存在 4 冰箱中[ 9] 。将总 DNA用0. 8%
的琼脂糖凝胶电泳检测, 用 25、50、75、100 ng 的
DNA 作为半定量标准。模板 DNA 的质量浓度为
10 ng/L。
1. 3 ISSR-PCR反应参数优化:扩增反应在 T-Gra-
dient PCR仪( Biometra,德国)上进行,反应总体积
为 20 L, 10 Buf fer 2 L, 25 mmol/ L M gCl2 1. 5
L, 10 mmol/ L dNT P(上海生工公司) 1 L, 模板
DNA ( 10 ng / L ) 0. 5 L, T aq 酶( 1 U/ L, Promega公
司) 0. 2 L, ddH 2O 14. 4 L。进行 PCR扩增前覆
盖一滴石蜡油。预变性 94 , 4 m in; 变性 94 , 1
m in;退火50 , 1 m in;延伸72 , 2 min; 重复 2~ 4
步循环 35次;终延伸 72 , 10 min; 4 保存。
1. 4 PCR扩增产物的检测:加 2 L 上样缓冲液于扩
增产物中,取 10 L 扩增产物于 1. 5%琼脂糖凝胶上
样孔内电泳检测,所用电泳缓冲液为0. 5 TBE,电泳
1524 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
在140 V电压下进行 50~ 70 min,花青素染色,并于
紫外成像系统UVP-8000G上观察摄影。
1. 5 ISSR引物的筛选及退火温度的确定:从 36份
种质资源中随机选取 5 个个体的 DNA 样品进行预
备实验, 选出扩增条带较多的引物,共从 44条引物
(上海生工公司)中筛选出 13条能够获得清晰条带、
重复性好的引物, 并根据各引物的特性,确定了各引
物的退火温度。见表 2。
表 2 筛选出的引物序列及退火温度
Table 2 Screened primers and annealing temperature for PCR
序号 序列( 5- 3) 退火温度/ 序号 序列( 5-3) 退火温度/
AW52480 ( AC) 8 T A 51. 00 AW52499 ( AG) 8C7 53. 00
AW52481 ( T G) 8GG 55. 00 AW52502 ( GACA) 4 51. 55
AW52482 ( AG) 8GT 53. 00 AW52507 ( AG) 8CG 55. 00
AW52486 ( GAA) 6 50. 00 AW52508 ( AG) 7 T 48. 10
AW52493 ( AC) 8G 54. 59 AW52510 ( AC) 8 ( CT) G 54. 00
AW52495 ( AC) 8YG 55. 00 AW52516 ( GA) 8C 54. 59
AW52496 ( AT G) 6 48. 19
1. 6 数据分析: 根据 ISSR 引物对 36份灯盏花材
料扩增的电泳图谱, 每个条带视为一个位点数,统计
位点总数和多态性位点数, 同一 ISSR 位点上按
DNA 条带的有无分别赋值,有带的记为 1, 无带的
记为 0。按照多态性比例= (总谱带数- 共有谱带
数) /总谱带数 100%计算多态性比例。按文献的
方法[ 18] 计算遗传相似系数( G s ) , 计算公式为: G s =
2N ij ( N i+ N j ) ,其中 N ij为材料 i 和 j 共有的扩增片
段数目, N i 为材料 i 中出现的扩增片段数目, N j 为
材料 j 中出现的扩增片段数目,根据 G s 值按不加权
成对群算数平均法( unw eighted pair g roup method
w ith arithmet ic means cluster analysis, U PGMA )
建立系统聚类分支树状图。统计分析在 NT SYS
2. 1统计软件系统中进行。
2 结果与分析
2. 1 灯盏花种质资源 ISSR多态性:用所选的 13条
ISSR引物对 36份灯盏花种质资源进行扩增, 从表 3
可以看出,共得到 125条带可靠、清晰、重复性高的条
带,引物 AW52516和 AW52510扩增出的条带最多,
分别为 13 条和 12条, 平均每个引物扩增出 9. 6条
带。125个条带中有 103条是多态条带,总的多态条
带比率( PPB)为 82. 4%。每个引物平均多态位点数
为 7. 9, 13个引物在 36份灯盏花种质资源中得到的
多态性均较高,平均多态条带率 66. 67% ~ 92. 31%,
引物 AW52516多态性最高,平均多态条带百分率为
92. 31%。引物 AW52496的扩增结果见图 1。
表 3 36 份灯盏花种质资源遗传多样性
Table 3 Genetic diversity on 36 germplasm resources of E breviscapus
序号 总带数 PB PPB/ % 序号 总带数 PB PPB/ %
AW52480 11 9 81. 82 AW52502 10 9 90. 00
AW52481 9 7 77. 78 AW52507 9 8 88. 89
AW52482 9 6 66. 67 AW52508 8 6 75. 00
AW52486 7 5 71. 43 AW52510 12 11 91. 61
AW52493 10 8 80. 00 AW52516 13 12 92. 31
AW52495 9 7 77. 78 总数 125 103 82. 40
AW52496 9 8 88. 89 平均 9. 6 7. 9 81. 54
AW52499 9 7 77. 78
图 1 引物 AW52496 对 36 份灯盏花种质资源扩增的
DNA指纹图谱
Fig. 1 Amplified results on 36 germplasm resources
of E breviscapus by Primer AW52496
2. 2 灯盏花种质资源的遗传相似系数:对扩增结果
采用 Ne-i Li相似系数( Gs )的计算方法得到遗传相
似系数矩阵, 36份灯盏花材料的 Gs 值在 0. 339 8~
0. 796 1,说明 36份灯盏花遗传变异较丰富, 其中采
自贵州雷山西江雷公山的 D42与云南沾益的 D50、
贵州雷山西江雷公山的 D49 与 D50的遗传相似系
数最大为 0. 796 1,说明它们之间的亲缘关系较近,
遗传差异较小,四川德昌马鞍山的 D60与 D78 的遗
传相似系数最小,为0. 339 8,亲缘关系较远,具有相
对较高的遗传多样性。
1525中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
2. 3 聚类分析:基于遗传相似系数, 利用 U PGMA
法对 36份灯盏花种质进行聚类分析, 结果见图 2。
在相似系数为 0. 54时, 36份不同产地的灯盏花可
聚为 5大类:采自云南丘北的 D84、云南宣威的 D37
各聚为一类(第 、类) ,采自云南香格里拉的 D65
与 D76单独聚为 1 类(第类) , 在余下的 32 份材
料中 D32、D38、D81、D83、D75、D88、D78 7份材料
与其他材料间也具有较大的遗传分化, 聚为第 类
( 类) ,在剩下的 25份材料(第 类)中, 又可明显
地划分为两大亚类 (第 A、B 类) , 其中, 第 B
类所包含的材料最多, 共 20份, 材料间的遗传分化
也较大。从地理分布来看, 第 类材料采自于云南
的楚雄、昭通、文山、红河、丽江、迪庆; 第 A 类材
料采自于楚雄、大理、丽江; 第 B 类材料采自于云
南昭通、曲靖、迪庆、红河、文山, 贵州雷山西江、印
江,四川德昌、西昌; 第类材料采自于文山; 第类
材料采自于曲靖; 第类材料采自于迪庆。从以上
聚类结果可以看出,说明各灯盏花种质并不是按地
理界线严格聚在一起。聚类结果也表明, 部分灯盏
花之间的相似系数非常高, 如云南古城( D75)与云
南古城( D88)的完全相同, 它们相互之间的亲缘关
系很近,云南昭阳靖安松杉( D35)与云南昭阳靖安
西魁 ( D36)、云南弥勒 ( D79 ) 与云南弥勒东山
( D80)、云南香格里拉帕纳海( D65)与云南香格里拉
( D76)、贵州雷山西江雷公山( D49)与贵州雷山西江
雷公山( D50)等来自于同一个县的灯盏花材料之间
的亲缘关系也较近。
图 2 灯盏花 36 份种质资源的 DNA多态性聚类分析树
型图( UPGAM)
Fig. 2 Dendrogram ( UPGAM) on DNA polymorphism
of 36 germplasm resources in E breviscapus
3 讨论
本研究利用 ISSR标记检测到 36 份灯盏花种
质资源总的多态性条带百分率 82. 40%, 遗传相似
系数在 0. 339 8~ 0. 796 1, 表明 36份灯盏花种质资
源表现出了较高的遗传多样性, 亲缘关系较远。此
前与该试验共享 26份种质资源, 基于 RAPD分析
总的多态性条带百分率 87. 85% , 遗传相似系数
0. 480 5~ 0. 976 1的研究结果相近 [ 9]。继续支持基
于 RAPD 和 DALP 分析, 认为灯盏花遗传变异丰
富,遗传分化剧烈, 种内分化突出的观点 [ 8-10] , 而与
对云南 3个灯盏花居群的核型和等位酶分析认为灯
盏花遗传一致度高的观点[ 7] 不同。
本研究基于 ISSR的聚类分析结果把 36 份种
质资源分为 5类, 灯盏花遗传多样性较丰富,对来自
同一地区的亲缘关系较远的种质, 如贵州雷山西江
雷公山的 D49与 D50,或来自不同地区亲缘关系较
远的种质,如贵州雷山西江雷公山的 D42与云南沾
益的 D50, 应作进一步的深入研究。这一聚类结果
与此前共享 26份种质资源的 RAPD分析结果 [ 9]相
比较,在第类与 RAPD聚类共享 16 份种质资源
中,有 12份种质资源属于 RAPD聚类的第三类群,
另有采自弥勒的 D80和 D82, 采自香格里拉的 D77
和四川德昌的 D79则分属于其他类群; 第类的
D65和 D76均属于 RAPD聚类的第 类群; 第 类
的 6份种质资源分散在 RAPD聚类所分的 3个类
别中;其余原 RAPD 聚类未单独聚类的 D84(云南
丘北)、D37(云南宣威)均分别聚为一类。两种分子
标记方法的聚类结果, 有 18份种质资源的聚类具有
一致性,占共享种质资源数的 69. 2% , 有 8份种质
资源的聚类存在差异。这可能主要是由于两种标记
方法的引物系列差异所引起的 DNA 位点不同。
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北柴胡移栽试管植株与种子植株中皂苷的动态分析
郝建平1 ,王丽荣1 ,徐笑飞1 ,秦雪梅2 , 张丽增2 , 赵玉臣3*
( 1 山西大学 生命科学学院, 山西 太原 030006; 2 山西大学中医药现代研究中心,山西 太原 030006;
3 山西省药物培植场, 山西 绛县 043610)
摘 要:目的 为应用离体快速繁殖技术进行北柴胡优良种质选育提供实验依据。方法 应用分光光度法测定北
柴胡移栽试管植株不同生长期的根、茎叶中柴胡总皂苷的量,应用柱前衍生化 HPLC-UV 法测定柴胡皂苷 a和 d
的量,并以同型、同时的种子植株作为对照。结果 北柴胡试管植株根、茎叶中柴胡总皂苷及皂苷 a 和 d 的量在试
管苗阶段最低,在一年生植株中最高, 在两年生植株中的营养生长期次高, 在花期、果期、枯萎期依次降低; 在根中
的量远高于茎、叶; 引种自山西左权的移栽试管植株的量均高于引种自山西陵川和万荣的类型;移栽试管植株根、
茎叶中的量均高于相同类型的种子植株中的量。结论 离体快速繁殖是纯化北柴胡种质和提升药材品质、提高药
材产量的有效方法;快速繁殖植株具有优良的遗传稳定性 ,选择综合性状好的种质作为繁殖的起始材料, 能够保证
后代性状的优良和整齐一致;果期二级花序的种子成熟期为移栽试管植株根的适宜采收期。
关键词:北柴胡; 试管植株;种子植株; 柴胡皂苷
中图分类号: R282 6 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1527-04
Dynamic analysis of saikoside in tes-t tube plants of Bupleurum chinense
compared with seeding plants
HAO Jian-ping1 , WANG L-i rong1 , XU Xiao- fei1 , QIN Xue-mei2 , ZHANG L-i zeng 2 , ZHAO Yu-chen3
( 1 School of L ife Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine,
Shanx i Univ ersity , T aiyuan 030006, China; 3 Cultivat ing H erbs Farm o f Shanx i P rov ince, Jiang Count y 043610, China)
Abstract: Objective T o prov ide a scient ific basis for breeding on Bup leurum chinense by r apid propa-
gation method in v it ro Methods Pre-column derivat izat ion HPLC-U V and v isible-spect rophotometry
methods w er e used to determine the contents o f saiko saponin a, saikosaponin d, and saikosaponins in the
root and aerial part of test- tube plants of B chinense in dif ferent grow ing per iods, and compared w ith see-
ding plants of same breeding and g row ing periods Results The contents of saikosaponins, saiko saponin
a, and saiko saponin d w ere minimum in r oots, stems, and leaves of plantlets They w ere the uppermost in
annual test- tube plants, and w ere the second at vegetative grow th phase of biennial test- tube plants The
contents w er e reduced ordinally at bud form ing phase, seed r ipening phase, and w ilt ing phase of biennial
test- tube plants T he content in the roo t w as much higher than that in aerial par t of test- tube plants The
contents of test- tube plants w hich w ere int roduced from Shanx i Zuoquan w ere higher than which f rom
Shanxi Wanrong and Lingchuan The content in method o f B chinense breeding w as an ef fect ive w ay to
maintain and improve the yield in roots, stems, and leaves of test- tube plants w ere higher than those in
seeding plants Conclusion The r apid propagat ion in vi tr o is an effect ive method for purify ing germplasm
of B chinense and ascending honew o rt medicinal material quality and y ield The genetic stability of rapid
1527中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 11-11 基金项目:山西省科技攻关计划项目( 20100311091)作者简介:郝建平( 1959 ) ,男,山西省忻州市人,山西大学生命科学学院副教授,硕士研究生导师,主要从事植物细胞工程的教学和研究工作,已发表相关研究论文 70余篇。 E-mail: jph ao@ sxu . edu. cn