全 文 :价。为了提高标准生物效价的准确性和针对性,可以在细胞、个
体等不同水平同时建立几个标准生物效价来相互应证和说明。
进行谱效育种还必须与该药用植物规范化栽培技术的研
究与应用相结合, 否则, 就有可能影响谱效的稳定性和重复
性,难以达到中药材质量优质、稳定、可控的要求。谱效育种
涉及植物遗传育种、分析化学、药理学等多个学科的知识与技
术,因此, 必须加强有关学科间的渗透、交叉与合作才能完成。
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药用植物抗性基因工程研究现状与发展前景
贺 红,刘 丹,谢建辉,柴婷婷
(广州中医药大学中药学院,广东 广州 510405)
摘 要:概述了抗性基因工程的原理, 总结了我国药用植物抗性基因工程的研究现状及存在的问题, 并探讨了抗性
基因工程技术在药用植物育种中的发展方向及前景, 指出抗性基因工程技术在药用植物育种中的成功应用,将培
育更多抗性(抗病虫害、抗除草剂、抗逆性等)、质优的新品种, 促进药用植物资源的可持续发展。
关键词:抗性基因工程; 药用植物;育种
中图分类号: R282 12 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 01-附 1-04
Research status and prospect of resistant gene engineering in medicinal plant
HE Hong , LIU Dan, XIE Jian-hui, CH AI T ing- t ing
( Co lleg e of Chinese Mater ia Medica, Guang zhou Univer sity o f T r aditional Chinese Medicine, Guang zhou 510405, China)
Key words: resistant g ene eng ineer ing; medicinal plant; breeding
药用植物不仅本身作为药物应用于传统医学保健和治疗
中, 而且可作为化学药品的原料。因此,药用植物的生产在我
国的农业发展体系中具有战略意义。然而, 由于生态环境的
破坏、土地和其他自然资源的减少和恶化、生产效率和技术水
平的低下,使我国药用植物生产面临严峻的挑战。药用植物
的平均产量远低于其潜在的最高值,其原因之一是它们并不
总是生活在最适宜的环境中, 在生长发育过程中受到各种逆
境及有害生物的影响,为了防治病虫等危害,每年使用大量的
化学农药,生产成本升高,而且农药残留及环境污染问题日益
突出。因此,只有借助于先进的科学技术手段, 提高药用植物
的生产效率和品质,才能减轻资源的压力, 增强我国药用植物
产业的竞争力。其中, 基因工程在药用植物上的应用是较为
快捷和有前途的手段之一。植物抗性基因工程是根据分子遗
传学原理, 培育具有特定抗性的植物新品种的生物技术, 包括
植物抗病基因工程、植物抗虫基因工程、植物抗除草剂基因工
程和植物抗逆基因工程。抗性基因工程技术的成功应用, 将
有利于选育抗病、抗虫等转基因药用植物, 对于保证药材的产
量和质量, 减少环境污染有着重要意义。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月 附 1
收稿日期: 2009-10-15 基金项目:国家自然科学基金项目( 30873376)作者简介:贺 红( 1967 ) ,女,理学博士,研究员,主要从事中药生物技术研究。 T el: ( 020) 39358067
E-mail: hehong67@ yahoo. com. cn
1 抗性基因工程原理
抗性基因工程的程序是鉴定和分离抗性基因,抗性基因
的重组,将抗性基因导入受体, 获得能够抗性表达并稳定遗
传的再生个体[1]。
1. 1 抗性基因的分离和克隆: 目前已发展出一系列适合不
同条件的抗性基因分离与克隆方法, 如功能克隆法、序列克
隆法、基于 mRNA 差异显示技术的克隆方法、图位克隆法及
转座子标签法等[2]。植物抗性基因克隆的主要目标是识别、
分离特异性基因并获得基因完整的全序列, 确定染色体定
位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关
系。基因克隆是整个基因工程或分子生物学的起点, 在此基
础上才能进行转化载体构建和植物转化与再生,最后对外源
基因进行检测和分析。随着分子生物学技术的不断发展, 植
物基因分离技术已日臻完善和多样化。
1. 2 抗性目标基因
1. 2. 1 抗病毒基因: 由于植物病毒具有相对较小的基因组,
因此较可能通过分子生物学手段对病毒进行控制,目前发展
了不同的抗病毒策略, 包括外壳蛋白介导的抗性; 复制酶介
导的抗性;病毒卫星 RNA 策略; 缺陷型运动介导的抗性等。
这些策略用来整合或创造出植物病毒系统中的新抗性因子,
干扰病毒感染功能的进行,从而阻止疾病的扩展。目前, 外
壳蛋白介导的抗病毒途径比较成熟,一些重组植株已进入大
田试验,有些已应用于农业生产。其他策略的抗病毒基因工
程正在发展中,而且不断有新的发现和策略出现。
1. 2. 2 抗真菌和细菌基因: 在自然界,当植物受到病原菌攻
击,抗性品种会启动一系列防卫基因的表达。感病品种则不
会有防卫基因的激活, 或防卫基因延迟表达, 或表达量不足
以抵抗病原菌的侵染。目前植物基因工程已克隆了一些抗
菌蛋白基因,如几丁质酶基因、葡聚糖苷酶基因、抗菌肽基
因[3]及诱导超敏反应的抗性蛋白基因等。
1. 2. 3 抗虫基因:抗虫性是寄主植物抵御或减少昆虫危害
的能力。植物抗虫育种所利用的遗传抗性包括拒虫性、抗虫
性及耐虫性 3 个方面,耐虫性完全着眼于植物对害虫危害的
承受力,而拒虫性及抗虫性着眼于减少危害。植物基因工程
主要研究了植物的抗虫性遗传抗性。目前,普遍使用的抗虫
基因根据其来源大致可分为微生物来源和植物来源的抗虫
基因,如苏芸金芽孢杆菌毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀
粉酶抑制剂基因及植物凝集素基因。在进行植物抗虫基因
操作时,需要根据受体植物种类、害虫的特点,正确地选择使
用适宜的抗虫基因。
1. 2. 4 抗除草剂基因: 目前,抗除草剂的基因工程主要有 2
种策略,一是修饰除草剂作用的靶蛋白,使其对除草剂不敏
感,或促其过量表达以使植物吸收除草剂后仍能进行正常代
谢,如抗 EPSPS 抑制剂基因的研究及其应用; 二是分离能解
除除草剂毒性的酶基因(如 bar 基因等) , 上述两种策略都已
取得了积极的结果,获得了各类抗除草剂转基因植物。
1. 2. 5 抗逆基因:非生物胁迫如干旱、高盐度和极端温度对
植物都产生共同的结果,即细胞脱水或渗透胁迫。在自然条
件下, 植物抗渗透胁迫主要通过组织结构变化保存水分和通
过细胞代谢调节渗透压的变化。植物对缺水的响应表现在
合成大量被称作渗透保护剂的低分子化合物, 这些渗透保护
剂通过降低细胞渗透势维持细胞的膨压。植物抗渗透胁迫
的基因工程集中于调节渗透压分子及其基因相关的研究上。
植物抗寒相关基因主要为环境因素诱导表达的基因以及与
细胞膜生物合成有关的基因。
1. 3 植物遗传转化系统: 当分离得到具有功能的目的基因
后,就需要选取合适的遗传转化方法将外源基因导入到受体
植物中去。外源基因导入到植物有 3 个关键因素必须考虑:
一是要有适宜的基因包括目的基因、标记基因或报告基因和
合适的选择条件; 二是要有较完善的组织培养系统, 植物细
胞必须有效地再生成植株; 三是外源基因导入到植物的途径
和方法, 要求损失小、频率高且外源基因能稳定地整合到基
因组上, 才有可能实现目的基因的稳定遗传与正常的时空表
达。目前, 已发展出一系列比较完善的植物转化系统, 根据
转化方式不同, 大致可分为农杆菌转化法、DNA 直接导入法
和花粉管通道转化法。
1. 4 转基因植株的检测与鉴定:通过遗传转化获得植株后,
是否是真正的转基因植株, 还需要进行严格的检验与鉴定。
大多数植株基因研究都采用愈伤组织或再生芽的抗性鉴定、
报告基因检测、简易 PCR 检测、目的基因整合的 Southern 杂
交检测、目的基因转录水平的 Northern 检测以及释放水平的
蛋白质Western的鉴定,最后还要进行目的性状的田间鉴定。
2 药用植物抗性基因工程的应用
2. 1 药用植物抗病基因工程:病害的发生流行, 给中药材生
产和发展带来了严重损失, 甚至限制了某种药用植物在某一
地区的栽培。如人参根病常年发病率为 20% ~ 30% , 栽过
参的老参地不能连作,需要 10 年以上才能再栽参。病害不
仅影响中药材的产量, 更为严重的是造成中药材外观及内在
质量的下降。传统的抗病育种存在种质资源贫乏、抗病基因
和劣质性状基因连锁、周期长、工作量大、抗性基因的遗传不
稳定, 不能解决某些品种间的远缘杂交问题, 以及难以对新
的病原小种做出及时反应等不足。随着现代分子生物学的
发展以及植物基因工程技术的日趋完善, 人们开始着眼于鉴
定和克隆抗病相关蛋白的基因, 并期望通过将外源抗病基因
导入植物从而提高植物对病害的抗性。
根据有害生物的种类,主要可分为病毒病害、细菌病害和
真菌病害等。利用植物病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶的部
分基因或利用反义 RNA 抑制病毒编码的加工酶等策略已获
得了几十种转基因植物,有的已进入生产实用阶段。利用几
丁质酶和葡聚糖苷酶基因抑制真菌性病害已在多种转基因植
物上得到良好表现。利用破坏病原细菌毒素、抑菌肽类、溶菌
酶类等方法获得抗细菌的转基因植物也已有成功报道。
柑橘属植物是多种中药材的原植物。据不完全统计, 世
界上已报道的柑橘病毒和类似病毒病大约 80 余种[ 4]。但目
前柑橘的抗病毒基因工程仅在衰退病中开展。Gutier rez
等[ 5]于 1997年首次报道了将柑橘衰退病外壳蛋白基因转入
附 2 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41卷第 4期 2010 年 4 月
酸橙和来檬中。贺红等[6]将柑橘衰退病病毒外壳蛋白基因
转入枳壳 Poncirus tr if o liate Raf 中, 经 Southern 杂交证明
获得了转基因植株。陈善春等[7]成功地将柞蚕抗菌肽基因
导入柑橘 3 个品种。中药麦芽为禾本科植物大麦 H ordeum
vulgar e L 的成熟果实,即籽粒经发芽干燥而得, 大麦为药
食同源植物。近年来,国内外研究者对大麦抗白粉病及黄矮
病等基因进行了鉴定、定位与克隆研究,并探讨了大麦抗病
育种的策略。天麻是我国特有的一种药用植物,它在与蜜环
菌长期的相互作用中形成了一套有效的抑制及消化真菌的
机制,从而成为研究植物与真菌相互作用的良好模式系统之
一。Xu 等[8]从人工栽培的黄天麻中分离得到一种抗真菌蛋
白( GAFP-1) , 王晓晨等[9]克隆了 GAFP-1cDNA 并检测了全
长序列。由于 GAFP-1 在体外对梨腐烂病菌、立枯丝核菌及
灰葡萄孢等植物病原真菌均有明显的抑制作用, 编码
GAFP-1的基因可望应用于植物抗真菌病害基因工程。白
术属补益类中药,随着栽培规模的扩大,受到病原物的危害
逐渐增强,毛碧增等[10]利用基因枪介导法转化水稻几丁质
酶基因(RCH 10)和苜蓿-1, 3-葡聚糖酶基因( A GL U) 获得
抗立枯病白术,同时拓宽了白术抗病育种的基因库。
2. 2 药用植物抗虫基因工程: 危害药用植物的动物很多, 其
中昆虫占 95%以上 , 其他还有蜗牛、螨类、鼠类等。昆虫中
的害虫以药用植物的根、茎、叶、花、果实等为食,给中药材生
产带来严重损失。
植物基因工程的迅速发展为虫害的防治带来了革命性
的变化。利用苏芸金芽孢杆菌 ( Bt)杀虫蛋白基因 Cry 和
Cry 已分别获得抗鳞翅目和鞘翅目害虫的转基因植物, 有
的已开始生产应用;利用凝集素蛋白基因抗同翅目的蚜虫和
飞虱的转基因烟草也初见成效;利用 Ser和 Cys 的酶抑制剂
基因已获得具广谱抗性的转基因植物。此外开发利用其他
杀虫蛋白、昆虫激素、杆状病毒等在抗虫植物基因工程的应
用也在研究。
在药用植物方面, 罗青等[11]选用对蚜虫具有明显抗性
的基因 雪花莲外源凝集素酶基因,通过农杆菌转化法感染
宁杞 1 号,获得完整的转基因枸杞。张磊等[ 12, 13]将抗鳞翅
目昆虫的基因 半夏凝集素基因转化四倍体菘蓝, PCR 及
Sout hern 杂交结果表明,外源基因已整合到转基因菘蓝的基
因组中, RT-PCR 结果表明其 DNA 可以正常转录成 mR-
NA ,表明可以利用农杆菌介导的基因转化技术培育抗虫菘
蓝新品系。丁如贤等[14]利用叶盘法将 Cry I (A ) C 和豇豆胰
蛋白酶抑制剂基因 Cp T I 共同转入四倍体菘蓝获得对小菜
蛾抗性。
2. 3 药用植物抗除草剂基因工程: 因为杂草和栽培植物竞
争水分、养料和光照, 影响植物产量,同时杂草种子还会降低
其质量。因此通过化学方法来控制杂草已成为农业及中药
材生产中不可缺少的一部分。
抗除草剂基因工程是一项比较成功的植物基因工程。
现在报道的抗除草剂转基因植物有几十种,主要是农作物品
种,这些植物给农业生产带来了极大的便利。在药用植物方
面, 1992 年, Saito 等[ 15]构建了一个嵌合载体 pARK5, 含有
CaMV35S 启动子控制的 bar 基因, 转录因植株及其后代显
示了对除草剂草丁膦 ( phosphino thr icin) 和 bialapho s 的抗
性。同样地, Yamazaki等[ 16]利用 Ri双元载体转化系统, 将
编码 phosphino thricin乙酰转移酶的 bar 基因成功地导入到
野甘草 Scopar ia dulcis L 基因组中, 转基因植株及其子代
对除草剂表现出明显的抗性, 而次生代谢途径仍能正常进
行。许铁峰等[ 17] CaMV35S 为启动子,将带有抗除草剂基因
( bar 基因)的 pCAMBIA3300 植物双元表达载体,导入根癌
农杆菌菌株 EHA105, 作为基因工程菌转化四倍体菘蓝, 筛
选得到的抗性植株经 PCR 鉴定, 表明 bar 基因已转移到四
倍体菘蓝的基因组。
2. 4 药用植物抗逆基因工程: 抗逆包括抗盐碱、抗旱、抗涝
及抗寒等。逆境条件会造成植物水分供应失调, 温度过低引
起的冷冻害或高温强光引起的灼伤, 土壤酸碱度不合适, 缺
氧, 这些可概括为非生物逆境。几乎所有的非生物逆境均能
抑制植物的生长和促进植物衰老, 导致细胞死亡或降低植物
产量。
植物抗逆基因工程是发展得较晚的一类抗性基因工程,
这与人们对植物抗逆性机制的认识有关。然而, 抗逆基因工
程无疑对改良植物品种, 增强其适应性具有重要意义。药用
植物的药效与其抗逆性之间可能会存在某种相关。因为药
用植物的有效成分往往是次生代谢产物, 这些产物的合成有
时是与环境的胁迫有关的。因此,对于药用植物而言, 其最
佳种植区域往往并不是其最适生长区域, 导致其质量与产量
之间存在一些矛盾。因此, 将抗逆基因工程应用于药用植
物, 不仅可增强植物自身的抗逆能力,而且, 有希望解决药用
植物产量与质量之间的矛盾。此外, 还可能带来特定化学成
分的变化。
3 药用植物抗性基因工程技术的发展前景
当今世界面临人口过度增长、全球气候变迁、环境恶化、
生态系统破坏、生物资源逐渐灭绝等一系列的严重问题。植
物生产面临更多的病虫危害和逆境, 抗性育种显得尤为迫切。
植物基因工程培育植物优良品种取得了举世瞩目的成果, 已
成为现代农业发展的主要技术之一。应用这些抗性目的基因
已创造出了众多具有抗病虫、抗除草剂、抗寒、抗旱、抗盐碱等
优良性状的植物新品种。但目前这方面的研究主要集中在农
作物方面, 而药用植物相关的研究还处于起步阶段, 大多还停
留在转化技术研究,与实际应用还有较大的距离。
制约药用植物抗性基因工程研究的因素有多种,主要问
题在于相关的研究基础还很薄弱, 抗性基因的克隆及抗性机
制等方面的研究大多还是空白。对大多数药用植物而言, 高
效再生转化受体系统尚未建立。目前, 已知通过离体培养获
得的再生植株的药用植物有枸杞、西洋参、延胡索、毛地黄、
丹参、黄连、川白芷、栝楼、西红花、长春花、地黄、巴戟天、阳
春砂、广藿香、芦荟、溪黄草等。数量依然有限, 而且有的再
生频率不高, 难以作为基因转化的受体系统。
同时, 药用植物本身的特殊性也制约抗性基因工程研究
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月 附 3
的开展。在我国,药用植物经过几千年的应用和发展, 已经
形成了具有悠久历史的传统中药。药用植物有别于农作物,
其有效成分是植物细胞的次生代谢产物,这一特点决定了药
用植物与农作物的遗传转化有着不同的侧重点,即在转基因
药用植株的筛选和评价过程中,转基因事件对药用植物有效
成分乃至药效的影响是首要考虑因素。转基因药材面临着
重新评价药物的有效性和安全性问题。在我国的新药管理
体系中,转基因中药材是作为一类新药处理的。由于受到大
多数中药有效成分和疗效机制不明确这个瓶颈的限制, 药用
植物转基因产物的药效评价问题是其中最突出、最难解决的
问题。目前只有在现有药材质量评价体系的基础上, 初步加
以评价,并在实践和发展中不断完善。
此外,对于安全性的疑虑, 也是限制我国药用植物基因
工程研究和应用的因素之一。目前转基因植物安全性问题
主要包括两个方面:一是对人体健康的影响, 二是对环境的
影响。但是,目前在已经商业化生产并应用的转基因作物
中,还未找到任何证据证明这些作物是不安全的。随着科学
技术的不断发展,评价和管理的技术体系和法制体系的不断
完善,相信转基因产品的安全性问题将不再是药用植物基因
工程研究和应用的障碍。
目前,有关植物基因工程的一些技术、方法都已较为成
熟,其安全性也得到实践的验证,但现有的研究主要集中在
农作物方面。随着现代科学技术的蓬勃发展,学科之间相互
渗透、相互作用, 为药用植物基因工程育种提供了良好的可
供借鉴的方法和技术。
4 结语
植物基因工程在世界范围内的研究和应用已有 20 多年
的历史,发展十分迅速。转基因植物的应用已经带来了巨大
的经济效益,且逐年呈上升趋势。植物基因工程的应用和产
业化,不仅带来了直接经济效益, 而且对环境、社会均产生深
远的影响。目前,有关基因工程的一些技术、方法都已相当
成熟,其安全性也得到实践的验证, 管理模式也日益规范和
成熟。而随着人类医药健康需求的不断增长和变化, 药用植
物的生产必将在世界农业中占有越来越重要的经济和战略
地位。因此,基因工程在药用植物上的应用也是必然的趋
势,其中药用植物抗性基因工程的研究和应用,显得尤为迫
切。我国是一个药用植物资源生产和消费大国,具有得天独
厚的药用植物资源优势和市场优势,药用植物抗性基因工程
研究和应用具有广阔的发展空间。但是,目前相关领域的研
究较为薄弱,如在药用植物抗性生理、抗性机制及抗性基因
的克隆等方面的研究还有待加强, 许多新的问题需要去探索
和研究。与农作物相比, 药用植物对内在质量的要求更高,
发展具有中医药自己优势特点的药用植物基因工程技术, 也
将是一个具有挑战性的课题。随着现代科学技术的蓬勃发
展, 学科之间相互渗透相互作用,通过借鉴与合作 ,基因工程
将在药用植物育种中发挥巨大作用, 将培育更多抗性(抗病
虫害、抗除草剂、抗逆性等)、质优的新品种, 保证药用植物资
源的可持续利用。
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