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Genetic diversity of Artemisia annua in natural populations of China revealed by SRAP marker

我国黄花蒿天然群体遗传多样性的SRAP分析



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 8 期 2011 年 8 月

• 1591 •
• 药材与资源 •
我国黄花蒿天然群体遗传多样性的 SRAP 分析
陈大霞,彭 锐*,李隆云,崔广林,吴叶宽
重庆市中药研究院 中药种植研究所 重庆市中药良种选育与评价工程技术研究中心,重庆 400065
摘 要:目的 研究我国黄花蒿天然群体种质资源的遗传多样性,并对其进行 SRAP 分析。方法 采用 SRAP 分子标记技术,
以我国天然群体主要分布区域的 60 份黄花蒿种质资源为试验材料,运用 Popgene version 1.31 软件和 Treeconw 软件计算相
关参数,UPGMA 方法聚类,构建亲缘关系树状图。结果 24 对 SRAP 引物组合扩增出 232 条带,多态性比率(PPB)为
81.47%。SRAP 标记的 Nei’s 基因多样性(H)为 0.190 5,Shannon’s 信息指数(I)为 0.300 0。青蒿素量高的 4 个地区之间,
多态位点百分率在 50.00%~61.21%,平均为 55.82%,SRAP 标记的 H 值为 0.155 7~0.179 3,I 值为 0.237 9~0.276 6;SRAP
检测不同材料间遗传相似系数为 0.643 2~0.872 7,平均为 0.754 7。结论 SRAP 标记能有效地揭示我国野生黄花蒿丰富的
遗传多样性,为黄花蒿新品种选育提供了物质基础。
关键词:黄花蒿;SRAP;遗传多样性;Nei’s 基因多样性(H);Shannon’s 信息指数(I)
中图分类号:R282.7 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2011)08 - 1591 - 05
Genetic diversity of Artemisia annua in natural populations of China revealed
by SRAP marker
CHEN Da-xia, PENG Rui, LI Long-yun, CUI Guang-lin, WU Ye-kuan
Chongqing Engineering Research Center for Fine Variety Breeding Techniques of Chinese Materia Medica, Institute of Material
Medical Planting, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China
Abstract: Objective The genetic diversity of Artemisia annua germplasmic resources in natural populations of China was analyzed
by SRAP marker. Methods Taking 60 germplasm of A. annua version in main distribution areas of natural population in China as
testing materials, the relative parameters were calculated by Popgene version 1.31 and Treeconw software. The systematic diagram of
genetic relationship was made up by Treeconw software and clustered by UPGMA method. Results The 232 DNA bands were
amplified with 24 pairs of SRAP primer combinations, and the percentage of polymorphic bands (PPB) was 81.47%. At species level: Nei’s
gene diversity (H) was 0.190 5 using SRAP marker. Shannon’s information index (I) was 0.300 0 by SRAPs; Among the four areas with
higher level of artemisinin: PPB were 50.00%—61.21%, the average was 55.82%. He were 0.155 7—0.179 3 by SRAP marker. I were
0.237 9—0.276 6 by SRAP maker; Genetic distance were 0.643 2—0.872 7, the average was 0.754 7. Conclusion SRAP marker is
an efficient method in revealing the abundant genetic diversity of wild A. annua in China, which provides the material basis for
promising germplasm of further breeding.
Key words: Artemisia annua L.; SRAP; genetic diversity; Nei’s gene diversity (H); Shannon’s information index (I)

黄花蒿 Artemisia annua L.为菊科一年生草本植
物,以全草入药,有清热凉血等功效,民间用于治
疗高热不退、气管炎、中暑、皮肤瘙痒、荨麻疹、
脂溢性皮炎等。从黄花蒿中提取的青蒿素具有较强
的抗疟疾活性,被世界卫生组织(WHO)推荐为一
线抗疟中药。青蒿素(artemisinin)的量随产地不同
差异极大,具有显著的生态地域性[1-2],因此,为了
培育出高产优质的黄花蒿新品种,有必要对全国黄
花蒿种质资源进行亲缘关系和遗传多样性分析。近
年来,已有采用分子标记进行黄花蒿遗传多样性研
究的报道[3-6],但大多局限于某一地区的种质资源或
研究材料相对偏少。为避免由此造成的偏差,本实
验采用SRAP标记技术对不同来源的野生黄花蒿 60
个样品进行分子评价,旨在为黄花蒿遗传资源多样
性及为黄花蒿资源保护、利用以及新品种选育提供
分子依据。

收稿日期:2011-01-06
基金项目:国家科技攻关计划(2004BA721A32);国家科技支撑计划(2006BAI09B01-04,2006BAI09B02-04);国家中医药管理局行业专项(201107011)
作者简介:陈大霞(1968—),女,重庆人,副研究员,硕士,主要从事药用植物分子生物学研究。Tel: (023)89029061 E-mail: 17837@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 8 期 2011 年 8 月

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1 材料和方法
1.1 材料
黄花蒿天然群体采自我国黄花蒿的主要分布区
域,涉及 13 个省市,共 60 份样品(表 1),其中含
青蒿素量高的重庆市有 15 份、四川省 11 份、贵州
省 8 份、广西壮族自治区 11 份。由重庆市中药研究
院李隆云研究员鉴定为黄花蒿 Artemisia annua L.的
全草。参照文献报道[7-9]方法进行取样,即每个天然
群体取 10 株,选取成熟植株上的幼嫩叶片,样品等
量混合为 1 个样本,这个样本代表该群体,并放入
装有硅胶的自封袋,快速干燥。
1.2 基因组 DNA 的提取
参照文献方法提取基因组 DNA[10]。用 Smart
SpeeTM3000 型分光光度计(Bio-Rad 公司)测定其
浓度和纯度,将样品稀释为 40 ng/μL,用作 PCR 扩
增的模板。
1.3 SRAP-PCR 扩增
PCR 扩增在 Eppendorf Mastercycler®梯度 PCR
仪(Eppendorf)上进行。SRAP 引物采用 Li 等[11]
的引物,由北京赛百盛基因有限公司合成,所用引
物序列见表 2。SRAP-PCR 扩增程序参照 Li 等[11]
的方法,PCR 反应总体积为 25 μL,每个反应体系
含 1×PCR 缓冲液,MgCl2 2.0 mmol/L,dNTPs 250
μmol/L,引物各 0.2 μmol/L,TaqDNA 聚合酶 1 U,
模板 40 ng,不足部分 ddH2O 补足。SRAP 扩增程
序采用复性变温法,共 40 个循环,即 94 ℃预变性
5 min;前 5 个循环:94 ℃变性 30 s,35 ℃退火 1
min,72 ℃延伸 1.5 min;后 35 个循环:94℃变性
30 s,50 ℃退火 1 min,72 ℃延伸 1.5 min;循环
结束后 72 ℃延伸 7 min;4 ℃保存。
1.4 产物的检测
取扩增产物 5 μL 在 6%的非变性聚丙烯酰胺凝
胶上电泳分离,以 0.5×TBE 为缓冲液,稳压 150 V,
电泳至溴酚蓝距凝胶边缘 1 cm 处结束。采用银染
表 1 试验样品
Table 1 List of tested materials
编号 来源 编号 来源 编号 来源
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
重庆綦江 1
重庆綦江 2
重庆綦江 3
贵州桐梓
贵州遵义
贵州息烽
贵州平坝
贵州关岭
贵州晴隆
云南昆明
广西靖西 1
广西靖西 2
广西大新
广西崇左
广西合浦
海南海口
海南定安
海南琼中
广东雷州
广西芩溪
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
广西蒙山
广西荔蒲
广西阳朔
广西龙胜
湖南靖州
湖南麻阳
湖南凤凰
贵州铜仁
贵州松桃
重庆秀山
重庆酉阳
重庆黔江
湖北咸丰
湖北建始
重庆奉节
重庆武隆 1
重庆武隆 2
重庆丰都 1
重庆丰都 2
重庆长寿
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
四川岳池
四川南充
四川盐亭
四川梓潼
四川三台
四川中江
四川都江堰
四川眉山
四川乐山
四川荣县
四川隆昌
重庆荣昌
重庆永川
重庆渝北
河南郑州
河南鹤壁
北京北望山
天津
山东宁阳
山东青岛
法进行染色。染色后,用Caplio R4 数码相机照相、记录。
1.5 数据的采集、统计、分析
根据各分子标记的电泳迁移率及其有无,统计
所有二元数据,按 DNA 条带的“有”或“无”进
行统计,有带(扩增阳性)记为“1”,无带(扩增
阴性)记为“0”,强带和弱带的赋值均为 1,形成
0/1 矩阵图输入计算机。对于多态性位点,仅在重
复试验中能稳定出现的差异带用于数据分析。
根据 SRAP 扩增的结果,运用 Popgene version
1.31 软 件 计 算 多 态 性 比 率 ( percentage of
polymorphic bands, PPB)、Nei’s 基因多样性(Nei’s
表 2 SRAP 引物序列
Table 2 Sequences of SRAP primers
上游引物 序列 5→3 下游引物 序列 5→3 下游引物 序列 5→3
ME1 TGAGTCCAAACCGGATA EM1 GACTGCGTACGAATTAAT EM8 GA CTGCGTACGAATTCTG
ME2 TGAGTCCAAACCGGAGC EM2 GACTGCGTACGAATTTGC EM9 GACTGCGTACGAATTCGA
ME3 TGAGTCCAAACCGGAAT EM3 GACTGCGTACGAATTGAC EM10 GACTGCGTACGAATTCAG
ME4 TGAGTCCAAACCGGACC EM4 GACTGCGTACGAATTTGA EM11 GACTGCGTACGAATTCCA
ME5 TGAGTCCAAACCGGAAG EM5 GACTGCGTACGAATTAAC EM12 GACTGCGTACGAATTGAT
ME6 TGAGTCCAAACCGGTAA EM7 GACTGCGTACGAATTCAA
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 8 期 2011 年 8 月

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gene diversity,H),Shannon’s 信息指数(Shannon’s
information index,I)和 Treeconw 分析遗传距离
(genetic distance,D)。采用 UPGMA 聚类法建立系
统聚类分支树状图。
2 结果与分析
2.1 SRAP 标记的多态性
本研究从 66 个 SRAP 引物组合中筛选出 24 个
扩增谱带清晰并呈现多态性的引物组合用于
SRAP-PCR 扩增,图 1 为引物组合 ME6-EM2 的扩
增图谱。扩增结果见表 3,扩增片段大部分集中在
100~600 bp。24 个 SRAP 引物共扩增出 232 条可
区分的 DNA 条带,每个引物检测到的位点在 5~13
个,平均每个引物扩增出 9.3 条带。在扩增的 232
DNA 条带中,有 189 条带呈多态性,PPB 为 81.47%,
每个 SRAP 引物可扩增出 4~12 条多态性带,平均
每个引物产生 7.6 条多态性带。
2.2 遗传多样性分析
由 I 和 H 估计 60 份野生黄花蒿的基因多样性,
观察到的等位基因数目(Na)为 1.806 0,有效等位基
因数目(Ne)为 1.309 3,H=0.190 5,I=0.300 0。
由 I和H估计青蒿素量高的4个地区的野生黄花蒿
的基因多样性,见表 4。不同地区的 PPB 在 50.00%~
61.21%,平均为55.82%。H 在0.155 7~0.179 3,平均
为0.168 3。I 在0.237 9~0.276 6,平均为 0.258 7(表3)。
2.3 聚类分析
用 Treeconw 软件计算供试材料间的遗传相似
系数。结果表明,重庆綦江 2 与重庆秀山之间的遗
传相似系数最小,为 0.643 2;重庆丰都 2 与重庆长
寿之间遗传相似系数最大,为 0.872 7。各供试材
料间的遗传相似系数平均为 0.754 7。
据SRAP数据计算的遗传相似系数,按UPGMA
法进行聚类分析,建立聚类分支树状图(图 2)。60

图 1 引物 ME6-EM2 的扩增图谱
Fig. 1 Amplification of primer combination ME6-EM2
表 3 24 个 SRAP 引物组合的扩增结果
Table 3 Amplification of 24 SRAP primer combinations
引物组合 总带数 多态性带数 PPB/% 引物组合 总带数 多态性带数 PPB/%
ME1-EM4
ME1-EM9
ME1-EM12
ME2-EM1
ME2-EM7
ME2-EM8
ME2-EM9
ME2-EM10
ME3-EM2
ME3-EM4
ME4-EM2
ME4-EM5
ME5-EM1
13
13
14
11
10
6
10
9
7
7
6
7
11
8
10
11
10
8
4
8
6
6
5
4
7
11
61.54
76.92
78.57
90.91
80.00
66.67
80.00
66.67
85.71
71.43
66.67
100.00
100.00
ME5-EM4
ME5-EM5
ME5-EM8
ME5-EM10
ME5-EM11
ME6-EM1
ME6-EM2
ME6-EM3
ME6-EM7
ME6-EM10
ME6-EM11
总合
平均
9
4
9
11
8
11
12
10
5
10
7
232
9.28
7
3
7
9
5
10
9
10
4
9
6
189
7.56
77.78
75.00
77.78
81.82
62.50
90.91
75.00
100.00
80.00
90.00
85.71

81.47

M 1 24 24 47 47 60 M
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 8 期 2011 年 8 月

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表 4 青蒿素量高的地区黄花蒿的遗传多样性
Table 4 Genetic diversity of A. annua in high-content artemisinin area
地区 N K P/% Na Ne H I
重庆 15 142 61.21 1.612 1 (0.488 3) 1.294 1 (0.340 8) 0.179 3 (0.185 5) 0.276 6 (0.265 7)
四川 11 116 50.00 1.500 0 (0.501 1) 1.258 9 (0.341 3) 0.155 7 (0.187 3) 0.237 9 (0.270 3)
贵州 8 126 54.31 1.543 1 (0.499 2) 1.266 1 (0.333 5) 0.163 1 (0.182 2) 0.252 3 (0.263 4)
广西 11 134 57.76 1.577 6 (0.495 0) 1.292 8 (0.355 5) 0.174 9 (0.190 6) 0.268 0 (0.271 4)
平均 128 55.82 1.558 2(0.495 9) 1.278 0 (0.342 8) 0.168 3 (0.186 4) 0.258 7 (0.267 7)
N-样点数,K-多态位点数,P-多态位点百分数,括号内数据为标准误差
N-sample number, K-number of polymorphic loci, P-percentage of polymorphic loci, Standard deviation is in brackets

图 2 60 份黄花蒿种质资源的聚类图
Fig. 2 Dendrogram of 60 germplasmic resources of A. annua
个不同产地的黄花蒿聚为 3 类。第 1 类包括 55 份种
质,可以细分为 2 个亚类:第 1 个亚类的种质主要
来源于四川和重庆,包括四川的 11 份种质、重庆的
10 份种质以及来源于北方的几份种质;第 2 亚类的
种质主要来源于广西,包括广西的 9 份种质、湖南
的 3 份种质和湖北的 2 份种质。第 2 类有 3 份种质,
其中有 2 份种质来源于海南,另一份来源于贵州关
岭;第 3 类仅 2 份种质,来源于广西芩溪和重庆永
川。聚类分支树状图中,来源于贵州的种质聚类分
散在 3 个类群中,但在最小分支中还是表现出一定
的地域相关性,如贵州遵义和贵州息烽、贵州铜仁
和贵州松桃聚在一起。以上聚类结果显示,60 份黄
花蒿种质的聚类有一定的地域相关性,尤其在一些
小分类群中表现尤其明显。
3 讨论
3.1 黄花蒿种质资源的遗传多样性
黄花蒿种质类型复杂多样,其植物学性状表现
出极高的形态多样性,从植株高矮到叶色、叶形、
株形等都表现出很大变异。蒋向辉等[6]对 15 份种质
资源材料形态调查表明:株高、茎粗、茎色、夹角、
节间距等形态指标适合于青蒿外部性状观察记载。
目前,应用形态标记对黄花蒿种质资源方面的研究
主要集中在青蒿素的量与其生物学特性的关系,黄
正方等[12]认为青蒿素的量与黄花蒿叶片的叶色、叶
形,茎秆的颜色有关系;郑丽屏等[3]研究认为,青
蒿素量高的黄花蒿具有较长的节间和较粗的茎杆。
形态标记虽然简单易行,可操作性强,但易受外部
环境影响。而分子标记类型多、数量大,分析 DNA
序列的差异,不受环境影响,已广泛应用于遗传多
样性方面的研究。
关于黄花蒿自然分布居群的遗传结构分化研
究,在分子生物学方面已有报道。郑丽屏等[3]首次
通过 RAPD 技术分析了我国 10 个黄花蒿居群之间
在遗传物质上的变化,RAPD 位点多态性及各居群
中特征谱带的出现都表明我国黄花蒿群体中具有较
丰富的遗传多样性,黄花蒿遗传分化与青蒿素量变
化及地理分布基本对应。为避免单一分子标记方法
50
51
48
49
54
43
52
45
42
46
36
7
44
38
39
40
47
1
5
6
37
41
3
2
4
55
56
58
59
57
60
18
19
9
10
31
34
35
33
25
27
28
29
24
30
23
26
21
22
15
32
12
11
13
14
17
8
16
20
53
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对研究结果造成偏差,石开明等[4]利用 RAPD 和
ISSR 分子标记技术对 11 份鄂西野生青蒿种质进行
了遗传多样性研究,两种标记揭示的多态百分率分
别为 61.63%和 60.78%,表明青蒿种质具有比较丰
富的遗传变异,均可以有效地揭示青蒿种质的遗传
多样性状况。陈大霞等[5]采用新型分子标记 SRAP
对 45 份供试黄花蒿种质资源的遗传多样性进行了
初步分析。结果表明,多态性检测率较高,占 81.7%,
证实 SRAP 是一种有效的标记。本实验对全国各地
野生黄花蒿的代表性材料进行群体的遗传结构分
析,同样证实野生黄花蒿具有丰富的遗传多样性。
以上研究虽然所采用的材料不同,方法各异,
但均从分子水平上证实黄花蒿野生群体中存在着极
显著的遗传变异,这些遗传变异是黄花蒿种质资源
筛选的关键。产生这些遗传变异的原因是多方面的,
有性生殖、体细胞突变、自然选择、基因流、遗传
漂变及环境的影响等。本研究中的黄花蒿属于异花
授粉植物,基因型高度杂合,遗传背景十分复杂,
异花授粉产生新的基因组合,在自然界几乎每两个
青蒿植株间都存在遗传差异。其种子小而多,萌发
能力强且野生适应性高,能在自然条件下大量繁殖,
成苗较易,因此有性生殖是黄花蒿产生遗传变异的
主要因素。此外,环境的影响也是一个重要因素。
我国从海拔 50 m 的沿海地带至海拔 3 650 m的青藏
高原均有黄花蒿分布,随着海拔的升高,气候、植
被、土壤等各种生态环境也呈现明显的垂直变化,
因而形成外部形态差异较大的生态型。
3.2 黄花蒿野生资源的开发与利用
黄花蒿的全草均可入药,能解暑、退虚热、抗
癌,是中医传统使用的抗疟药,原产于中国,现在
澳大利亚、阿根廷、保加利亚、法国、美国等许多
国家均有栽培,种质资源十分丰富,为黄花蒿新品
种选育提供了丰富的物质基础。黄花蒿虽然为世界
广布种,但国外黄花蒿中青蒿素量多低于 0.1%,甚
至微量[8]。我国是青蒿素的主产国,主要分布在广
西、云南、四川、贵州、重庆等省市。青蒿素的量
随产地不同而差异极大,广西、四川等地黄花蒿中
青蒿素量相对较高,在 0.4~1.0%,北方地区量多
在 0.1%左右[12]。青蒿素量低于 0.5%的黄花蒿几乎
没有工业提取价值,使得青蒿素的天然资源相对匮
乏。目前,通过化学的方法合成青蒿素的研究虽然
取得一定的进展,但尚未显示出商业开发的可行性,
从黄花蒿中提取分离仍是青蒿素的唯一来源。因此,
黄花蒿作为我国特有的抗疟植物资源,应该得到合
理的开发与利用。
对黄花蒿种质资源的开发与利用在于培育出单
位面积青蒿素量高的品种,而拥有丰富的种质资源
是育种的基础,育种上突破性的进展往往取决于关
键性优良基因的发掘和利用。因此,应合理开发与
利用黄花蒿的种质资源,收集黄花蒿野生型、栽培
型种质资源,建立种质资源圃。从生态适应性、生
长习性、DNA 分子标记以及产量、有效成分量等经
济性状指标对黄花蒿种质资源进行综合评价,同时
有目的地选用具有优良基因的野生品种通过选择、
杂交、回交等方法培育出高产优质的新品种、新变
种,使优良基因得到有效转移。此外,青蒿素量受
环境因子的影响较大,极易因杂交或环境的改变造
成优良性状的退化,在今后的研究中,应全力保护
野生种所携带的决定重要经济性状的遗传基因。
参考文献
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