全 文 ：土木香药材HPLC指纹图谱研究及土木香内酯和异土木香内酯测定
张嫚丽1 ,霍长虹1 ,刘
丽2 ,李力更1 , 王于方1 ,史清文1*
( 1
河北医科大学药学院, 河北 石家庄
050017; 2
天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂,天津
300112)
摘
要:目的
建立土木香药材的指纹图谱, 测定主成分土木香内酯和异土木香内酯的量, 为土木香药材的鉴别及
质量控制提供依据。方法
采用 H PLC-DAD 法。色谱条件: H ichrom C18 ( 250 mm
4. 6 mm, 5. 0
m) ; 流动相为
乙腈-0. 1%甲酸水溶液梯度洗脱; 体积流量 1. 0 mL/ min;柱温 25
; 检测波长为 254 nm(指纹图谱) , 220 nm。结
果
建立了土木香药材的指纹图谱,同时测定了 15 批药材中土木香内酯及异土木香内酯的量。结论
方法稳定
可靠 ,重现性和精密度良好, 可作为土木香药材的指纹图谱及主成分测定的方法, 为该药材的标准化种植及质量控
制提供科学依据。
关键词:土木香; 土木香内酯; H PLC;指纹图谱
中图分类号: R282
7


文献标识码: A


文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1539-04
Studies on HPLC fingerprint and determination of alantolactone
and isoalantolactone in Inulae Radix
ZHANG Man-li1 , HUO Chang-hong1 , L IU Li2 , L I L-i geng 1 , WANG Yu-fang1 , SH I Qing-w en1
( 1
School of Pharmaceutical Sciences, H ebei Medical Univer sity, Shijiazhuang 050017, China; 2
T ianjin Ler entang
Pharmaceutical Facto ry, Zhongx in Pharmaceutical Co . , L td. , T ianjin 300112, China)
Abstract: Objective
T o establish HPLC fingerprint o f I nulae R adix and determine alantolactone and
isoalanto lactone simultaneously
Methods
HPLC-DAD method w as used and the separat ion w as carried
out on a H ichrom C18 column ( 250 mm
4. 6 mm, 5. 0
m) w ith the mix ture of acetonit rile and 0. 1% for-
m ic acid as mobile phase in a g radient elut ion model ( f low rate: 1. 0 mL/ m in, detection w ave: 254 nm fo r
fingerprint and 220 nm for determinat ion) , and the column temperature w as 25

Results
The f inger-
print of I nulae R adix was established
Alanto lactone and isoalanto lactone in 15 batches of I nulae Radix
were determined
Conclusion
The method is sensitive, quick, and useful to actualize standardizat ion
planting
It can be used for the quality contr ol for I nulae Radix

Key words: I nulae Radix ; alanto lactone; HPLC; fingerprint


土木香为菊科植物土木香 I nula helenium L

的干燥根。其味辛、苦,性温,归肝、脾经, 有健脾和
胃、调气解郁、止痛安胎之功效,主要用于胸胁、脘腹
胀痛、呕吐泻痢、胸胁挫伤、岔气作痛、胎动不安 [ 1]。
土木香中主要的化学成分是倍半萜内酯类[ 2] , 包括
土木香内酯、异土木香内酯、土木香醇、土木香酸、二
氢土木香内酯等,其中量较高的为土木香内酯和异
土木香内酯。有文献报道土木香中的倍半萜类化合
物具有抑制肿瘤细胞 [ 3]、驱虫、抗菌、抑制平滑肌、降
血糖和利胆等作用,土木香的乙醇提取物还具有镇
痛作用[ 4] 。此外,因马兜铃酸的毒性作用,国家食品
药品监督管理局要求在成药处方中以土木香替代含
马兜铃酸的青木香,使得该药材的应用越来越广泛。
因此,明确土木香药材的化学成分,建立全面的质量
控制方法,对该药材的合理开发利用具有重要意义。
通过 HPLC方法建立药材的指纹图谱已在中药材
中广泛应用[ 5-15] 。本实验首次建立了土木香药材的
HPLC 指纹特征图谱, 并建立了河北产土木香药材
指纹图谱的共有模式, 同时测定了两个主成分土木
香内酯和异土木香内酯的量,为该药材的质量控制

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中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2010- 02-20





















基金项目:河北省自然科学基金项目( No. 08B032) ;河北省留学回国人员科技活动项目( No. 200602) ;河北省卫生厅科研基金项目 ( No.
05058, 08053)作者简介:张嫚丽( 1978
) ,女,黑龙江省五常市人,讲师,博士在读,主要从事中药及其化学成分研究。
T el : (0311) 86265634
E-mail: zhang-manli@ 163. com
* 通讯作者
史清文
T el: ( 0311) 86265634
E- mai l: shiqingw en@ hebmu. edu. cn
提供了更为可靠和准确的方法。
1
实验材料
1. 1
仪器与试药: 美国 Agilent 1200高效液相色谱
仪(在线脱气,四元泵,自动进样器, DAD检测器, 柱
温箱) ; Ag ilent chem off ice 色谱工作站; 色谱柱:
Whatman Par tisil 10 ODS-2( 250 mm
4. 6 mm,
5. 0
m) , Dikma Diamonsil C1 8 ( 250 mm
4. 6 mm,
5. 0
m) , H ichrom C18 ( 250 mm
4. 6 mm, 5. 0

m) ;甲醇、乙腈为色谱纯(美国迪马公司) , 其他试
剂均为分析纯。土木香内酯和异土木香内酯对照品
自制, NMR 鉴定其结构 (质量分数> 98% , HPLC
归一化法)。土木香对照药材(中国药品生物制品检
定所,批号 1090-200001)。
1. 2
药材:由河北医科大学药学院天然药物室王建
华教授鉴定为土木香 I nula helenium L
的干燥根。
1~ 10号为河北产, 11和 15 号四川产, 12 号甘肃
产, 13号河南产, 14号内蒙古产。
2
方法与结果
2. 1
土木香药材指纹图谱的建立
2. 1. 1
色谱条件: H ICHROM C18柱 ( 250 mm

4. 6 mm, 5. 0
m) ,检测波长为254 nm,体积流量1. 0
mL/ min,柱温 25
, 进样体积 10
L。流动相为 A:
乙腈, B: 0. 1% 甲 酸水溶液。梯度洗 脱方法:
0~ 5 min, A 为 5% ~ 10%; 5 ~ 23 min, A 为
10% ~ 20%; 23~ 50 min, A 为 20% ~ 30% ; 50~ 53
min, A为 30%~ 65% ; 53~ 56 min, A为 65%等度洗
脱; 56~ 61 min, A 为 65% ~ 55% ; 61~ 66 min, A 为
55% 等度洗脱; 66 ~ 71 min, A 为 55% ~ 80%;
71~ 76 min, A为 80% ~ 100% ; 76~ 90 min, 纯乙腈
洗脱。
2. 1. 2
供试品溶液的制备: 土木香药材细粉(过 40
目筛) ,取该细粉约 0. 5 g ,精密称定,置于三角瓶中,
加甲醇10. 0 mL,称质量,超声提取45 min,放冷, 用
甲醇补充减失的质量,滤过( 0. 45
m 微孔滤膜) , 取
续滤液备用。
2. 1. 3
对照品溶液的制备: 精密称取土木香内酯和
异土木香内酯对照品适量,用甲醇配制成质量浓度分
别为 90. 70和 122. 4
g/ mL 的对照品溶液,备用。
2. 1. 4
精密度试验:取 1号土木香药材粉末 1份,
制备供试品溶液,进样,测得各共有峰相对保留时间
的 RSD均小于 0. 2% , 相对峰面积的 RSD均小于
1. 7%。同时考察各色谱峰的相似度,用相似度软件
计算,相似度均小于 0. 99,符合指纹图谱要求。
2. 1. 5
重现性试验:取 1号土木香药材粉末 6份,制
备供试品溶液,进样,测定,测得各共有峰相对保留时
间的 RSD均小于 0. 2%,相对峰面积的 RSD均小于
2. 8%。同时考察各色谱峰的相似度,用相似度软件
计算,相似度均大于 0. 99,符合指纹图谱要求。
2. 1. 6
稳定性试验: 取 1号土木香药材粉末 1份,
制备供试品溶液,进样, 测定, 分别在 0、2、4、8、24 h
进样分析,测得各共有峰相对保留时间的 RSD 均小
于 1. 4%, 相对峰面积的 RSD均小于 1. 8%。同时
考察各色谱峰的相似度,用相似度软件计算,相似度
均大于 0. 99,表明供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 1. 7
测定方法:取对照品溶液和供试品溶液( 1号
样品)各 10
L 注入高效液相色谱仪, 测定,见图 1。
以土木香内酯色谱峰的保留时间和峰面积为1. 0,计
算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积比值。
1-异土木香内酯
2-土木香内酯
1-isoalantolactone
2-alantolactone
图 1
对照品( A)和样品( B)HPLC色谱图
Fig. 1
HPLCChromatograms of ref erence substance ( A)
and sample (B)
2. 1. 8
相似度评价: 取土木香药材( 1~ 15号) , 制
备供试品溶液, 进样, 测定, 得到 H PLC 指纹图谱,
确定了 18个特征峰。指纹图谱见图 2( 1 号样品)。
将指纹图谱信号数据导入 2004A 版相似度评价软
件, 15批药材指纹图谱匹配结果( 5 点校正,中位数
法)为: 1( 0. 989) , 2( 0. 987) , 3( 0. 988) , 4( 0. 988) , 5
( 0. 989) , 6( 0. 988) , 7( 0. 985) , 8( 0. 989) , 9( 0. 979) ,
10( 0. 977) , 11( 0. 917) , 12( 0. 848) , 13( 0. 919) , 14
( 0. 924) , 15( 0. 947)。以 15号峰即土木香内酯色谱
峰为内参比峰,由土木香相似度评价结果可以看出,
15批土木香药材的相似度在0. 848~ 0. 989。其中 10
批河北产土木香药材的相似度较好,在0. 977~ 0. 989;
而 5 批 非 河 北 产 土 木 香 药 材 的 相 似 度
在0. 848~ 0. 947, 甘肃产土木香药材的相似度仅为

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中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
9-二咖啡酸酐
14-异土木香内酯
15-土木香内酯
9-caf feic acid anhydride
14-isoalantolactone
15-alan tolactone
图 2
土木香药材指纹图谱
Fig. 2
Reference fingerprint of Inulae Radix
0. 848,表明土木香因产地、气候、存方法等原因, 内
在质量存在着一定的差异。
2. 1. 9
河北产土木香药材共有模式的建立: 10 批
河北产土木香药材的指纹图谱及相似度评价, 指纹
图谱匹配结果( 5点校正, 中位数法)为: 1( 0. 989) , 2
( 0. 989) , 3( 0. 988) , 4( 0. 989) , 5( 0. 989) , 6( 0. 989) ,
7( 0. 988) , 8( 0. 986) , 9( 0. 990) , 10( 0. 979)。指纹图
谱信号数据导入 2004A版相似度评价软件,生成色
谱指纹图谱共有模式(图 3)。
图 3
河北产土木香指纹图谱共有模式图
Fig. 3
Mutual pattern of HPLC fingerprint
on I
helenium from Hebei Province
2. 2
土木香内酯与异土木香内酯的测定
2. 2. 1
色谱条件和系统适应性试验: 色谱柱为 HI
CHROM C18 ( 250 mm
4. 6 mm, 5. 0
m)。流动
相:乙腈-0. 1% 甲酸溶液梯度洗脱, 运行时间 15
min。0~ 3 m in, 乙腈 65%等度洗脱; 3~ 10 min 乙
腈由 65%线性梯度至 55% ; 10~ 15 min 乙腈 55%
等度洗脱。检测波长 220 nm; 体积流量: 1. 0 mL/
min; 柱温: 25
; 进样量: 10
L。在该色谱条件下
测定土木香内酯和异土木香内酯对照品溶液、土木
香药材供试品溶液, 色谱图见图 4。土木香内酯和
异土木香内酯达到基线分离, 理论板数分别为9 161
和7 630,分离度分别为 1. 83和 2. 49。
2. 2. 2
对照品溶液及供试品溶液的制备
对照品溶液的制备: 精密称取对照品土木香内
酯 57. 10 mg,异土木香内酯 32. 50 mg,分别置于 10
1-异土木香内酯
2-土木香内酯
1-isoalantolactone
2-alantolactone
图 4
对照品溶液( A)和供试品溶液( B)
HPLC色谱图
Fig. 4
HPLCChromatograms of reference (A) and sample
( B) in Inulae Radix from Hebei Province
mL 量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 摇匀, 得二
者的对照品储备液。精密吸取各对照品储备液 5. 0
mL,置于 10 mL 量瓶中, 加甲醇稀释至刻度,摇匀,
得含土木香内酯 2. 855 mg/ mL, 异土木香内酯
1. 625 mg / mL的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备: 取土木香药材细粉 100 g
(过 40目筛) , 取该细粉约 0. 3 g, 精密称定, 置于三
角瓶中,加甲醇 6. 0 mL, 称质量,超声提取 45 min,
放冷, 用甲醇补足减失的质量, 滤过( 0. 45
m 微孔
滤膜) , 取续滤液备用。
2. 2. 3
线性范围考察:取混合对照品溶液 1. 0 mL,
采用倍比稀释法制成系列质量浓度的溶液, 取 10

L 注入液相色谱仪,分析并记录结果。以对照品质
量浓度( X )为横坐标,峰面积( Y )为纵坐标,进行线
性回归,得土木香内酯和异木香内酯回归方程, 土木
香内酯: Y= 1. 00
104 X- 8. 16
104 , r= 0. 999 9;
异土木香内酯: Y= 1. 18
104 X - 4. 97
104 , r=
0. 999 8,线性范围分别为: 0. 571 ~ 2. 86
g/ mL,
0. 325~ 1. 62
g / mL。
2. 2. 4
精密度试验: 取供试品约 0. 3 g, 精密称定,
制备供试品溶液, 重复进样 6次, 每次 10
L,测定。
土木香内酯和异土木香内酯量的 RSD 分别为
0. 46%和 1. 13%。
2. 2. 5
重现性试验: 取同一批土木香药材, 重复 6
次取样制备供试品溶液,测定,土木香内酯和异土木
香内酯量的 RSD分别为 1. 68%和 0. 85%。
2. 2. 6
稳定性试验: 取供试品约 0. 3 g, 精密称定,
制备供试品溶液, 分别于 0、2、4、6、8、24 h测定土木
香内酯和异土木香内酯,记录各自的峰面积,计算 6
次进样土木香内酯和异土木香内酯峰面积的 RSD
分别为 1. 63%和 1. 05%。
2. 2. 7
回收率试验:取已知量的同一批土木香药材
6份, 每份约 0. 15 g, 精密称定,按约等量精密加入
土木香内醌和异土木香内酯对照品, 测定,计算平均

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中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
回收率,结果土木香内酯和异土木香内酯的平均回
收率分别为 98. 5%和 99. 4%, RSD 分别为 1. 37%
和 1. 00%。
2. 2. 8
样品测定: 对不同产地的共 15批土木香及
土木香对照药材,测定,计算样品中土木香内酯和异
土木香内酯的量,结果见表 1。
表 1
15批土木香药材及对照药材中土木香内酯和异土木
香内酯测定结果( n= 3)
Table 1
Determination of alantolactone and isolalantolaclone
in 15 batches of samples and control herbs (n= 3)
药材批次 土木香内酯/ ( mg
g- 1 ) 异土木香内酯/ ( mg
g - 1)
1号(河北) 28. 72 18. 02
2号(河北) 26. 35 17. 52
3号(河北) 28. 26 17. 75
4号(河北) 28. 52 17. 65
5号(河北) 27. 53 21. 53
6号(河北) 29. 30 22. 02
7号(河北) 24. 85 16. 03
8号(河北) 28. 13 18. 16
9号(河北) 38. 52 22. 50
10号(河北) 40. 17 23. 12
11号(四川) 72. 34 55. 67
12号(甘肃) 46. 13 23. 50
13号(河南) 48. 00 37. 67
14号(内蒙) 38. 83 22. 24
15号(四川) 44. 01 31. 94
对照药材
6. 66 12. 64
3
讨论
3. 1
提取溶剂与方法的考察:比较了不同提取方法
(索氏回流、连续加热回流和超声)、提取溶剂( 50%
甲醇、70%甲醇、甲醇、石油醚、二氯甲烷) ,以及不同
超声提取时间( 15、30、45、90 min)对提取效率的影
响,结果表明甲醇超声提取 45 min时各色谱峰的响
应值不再增加, 且方法稳定,重现性好。
3. 2
色谱条件的优化:比较了Whatman Partisil 10
ODS-2( 250 mm
4. 6 mm, 5. 0
m) , Dikma Dia-
monsil C18 ( 250 mm
4. 6 mm, 5. 0
m) , H ichr om
C18 ( 250 mm
4. 6 mm, 5. 0
m) , 3种色谱柱, 结
果表明色谱柱 Hichrom C18 ( 250 mm
4. 6 mm,
5. 0
m)能使土木香药材中最难分离的土木香内酯
和异土木香内酯达到基线分离。
甲醇-水体系无法实现土木香内酯和异土木香
内酯的基线分离, 而采用乙腈-0. 1%甲酸水体系, 通
过调整梯度洗脱的时间和比例, 则能使大多数成分
达到良好分离。因仅测定了土木香内酯和异土木香
内酯两个成分, 考虑到测定方法的快速、简便以及实
用性的要求,未采用与指纹图谱相同的流动相条件。
3. 3
本实验对 15批土木香药材进行了指纹图谱研
究,标定了 18 个共有峰。9号峰为二咖啡酸酐, 14
号峰为异土木香内酯, 15号峰为土木香内酯。本课
题组还对土木香药材的化学成分进行了系统研究,
共分得 19个化合物,鉴定了其中的 11个化合物,分
别为土木香内酯、异土木香内酯、11, 13-二氢异土木
香内酯、1-羟基-11, 13-二氢异土木香内酯、2-羟基-
11, 13-二氢异土木香内酯、3-羟基-11, 13-二氢异土
木香内酯、3-羟基-11, 13-二氢土木香内酯、macro-
phy llilactone E、2-乙酰氧甲基-7-( 7
-苯基-2
-二氢
吲哚)
二氢吲哚、乌苏烷-12-烯-18-
-氢-3-O-
-D-
葡萄糖苷以及二咖啡酸酐 [ 16]。以上单体均作为对
照品进行指认,可能因部分化学成分在药材中的量
较低而未能出现相应的对照品峰。
本研究确定了 10 批河北产土木香药材的特征
指纹图谱,首次建立了河北产土木香药材的共有模
式。对 10批河北产药材进行的相似度评价及主成
分的测定结果表明, 10批药材的相似度均在 0. 9以
上,各样品间整体出峰相似,说明目前河北产土木香
药材的化学组成一致性好, 质量比较稳定。本研究
从指纹图谱和指标性成分测定两方面同时对药材的
质量进行控制,为该药材的全面开发和深入研究奠
定了基础。
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中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月