全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 11 期 2011 年 11 月

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金银花超微粉体不同极性部位的指纹图谱及其与抑菌活性相关性研究
张水寒 1，袁清照 1，蔡光先 1, 2*，冯小燕 2，邵 怡 2
1. 湖南省中医药研究院 医药粉体技术教育部工程研究中心，湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室，湖南
长沙 410013
2. 湖南中医药大学，湖南 长沙 410007
摘 要：目的 建立金银花超微粉体不同极性部位的指纹图谱，并研究其与抑菌活性的相关性。方法 采用系统溶剂提取法
得到 6 个不同极性部位，分别采用 HPLC 法进行测定，同时选择体外抑菌药理指标进行活性测定；用多元线性回归分析揭
示化学信息与抑菌指标的相关关系，寻找与药理指标密切相关的物质群。结果 确定以醋酸乙酯提取部位的 HPLC 指纹图
谱来制定金银花的抑菌活性指纹图谱。结论 应用该方法建立的金银花粉体的质量标准科学、合理、实用。
关键词：金银花；中药粉体；极性部位；HPLC；指纹图谱；抑菌活性
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)11 - 2226 - 05
Fingerprint of different polarity extracts from superfine powder of Lonicera
japonica and its correlation of antibacterial activity
ZHANG Shui-han1, YUAN Qing-zhao1, CAI Guang-xian1, 2, FENG Xiao-yan2, SHAO Yi2
1. Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovation Drug Province Department Co-construction,
Engineering Research Center of Chinese Materia Medica Powder Technology, Ministry of Education, Hunan Academy of
Chinese Medicine, Changsha 410013, China
2. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China
Abstract: Objective To establish the fingerprint of Lonicera japonica superfine powder with different polarity and study its
correlation of antibacterial activity. Methods Six different polarity extracts were obtained using the solvent system extraction and
then were detected by HPLC with gradient elution. Pharmacological activities were detected by antibiotic indexes in vitro. The
correlation between the pharmacological indexes and the information of HPLC fingerprint was discovered by multiple linear
regression analysis and compound groups related to pharmacological indexes were obtained. Results Antibacterial effect fingerprint
of L. japonica can be established by HPLC fingerprint of ethyl acetate fraction. Conclusion The method developed is practical and
can be used for evaluating the quality control of L. japonica powder.
Key words: Lonicera japonica Thunb.; Chinese materia medica powder; polarity fraction; HPLC; fingerprint; antibacterial activity

金银花 Lonicera japonica Thunb.是忍冬科植物
忍冬的干燥花蕾或带初开的花，味甘，性寒。《本草
纲目》载“金银花，善于化毒，故治痈疽、肿毒、
疮癣……”。目前认为金银花的化学成分主要包括有
机酸、黄酮类、三萜类和挥发油等 4 类化合物。《中
国药典》2010 年版一部载金银花仅以绿原酸和木犀
草苷为定量指标[1]。相比采用几个指标成分控制中
药的质量，指纹图谱更能直接分析中药的化学成分
且能体现中药的复杂性和整体性[2-3]。中药的药效取
决于其所含的化学物质，将中药的生物活性与化学
成分相关联，将指纹图谱中体现的有效物质群与生
物活性信息建立相关性称之为“谱-效学研究”[4-6]。
本实验通过建立金银花超微粉体不同极性部位的指
纹图谱，同时与各部位的抑菌活性指标相关联，筛
选出真正发挥抑菌活性的有效物质群，为有效控制
金银花粉体的质量提供技术标准。
1 仪器与材料
BFM—T6BI 型贝利微粉机（济南倍力粉体技术

收稿日期：2011-02-16
基金项目：国家财政部社会公益类行业科研专项（200807054）
作者简介：张水寒，女，研究员，研究方向为中药新制剂与新技术。Tel: (0731)88881651 E-mail: zhangshuihan0220@126.com
*通讯作者 蔡光先 Tel: (0731)88854261 E-mail: qzyuan601@126.com
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工程有限公司）；LC—10A 高效液相色谱仪（含二
元泵 DAD 检测器、CLASSVP 色谱工作站，日本岛
津公司）；T—214 型北京赛多利斯分析天平；HS—
3120 超声清洗器（江苏汉邦科技有限公司）；超纯
水机（上海默克科技公司）；HH—S112 型水浴锅；
上海跃进电热恒温鼓风干燥箱；SPX—250 型恒温
培养箱；HH—S112 型水浴锅；牛津杯（10 mm×
7.8 mm×6 mm）；无菌陶瓦盖、培养皿；无菌棉棒；
游标卡尺。
10 批金银花药材分别购自河南、河北、山东及
湖南等地，经湖南省中医药研究院生药室温俊达副
研究员鉴定，均为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica
Thumb.的干燥花蕾，见表 1。

表 1 10 批不同产地金银花样品
Table 1 Ten batches of L. japonica from different origins
批 次 产 地 购买地
20090711 山东济南 湖南省中医药研究院
20091020 湖南新宁 湖南省新宁县基地
20090519 河北巨鹿 河北金银花市场
2009091601 河南封丘 河南封丘金银花研究所
200911060 山东费县 长沙市芝林大药房
20091010 山东平邑 长沙市高新大药房
20091101 山东沂蒙 长沙市老百姓大药房
2009102401 山东耒阳 长沙市双舟大药房
20091104 山东济南 长沙市华盛大药房
20090425 河北安国 长沙市养天和大药房

绿原酸（批号 110753-200612）、盐酸四环素（批
号 130488-200403）、氯霉素（批号 130555-200501）
对照品均购自中国药品生物制品检定所。
甲醇（色谱纯，Tedia 公司）；磷酸（色谱纯，
天津市科密欧化学试剂开发中心）；甲醇、石油醚、
三氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇、乙醇（分析纯，天
津市恒兴化学试剂有限公司）；分析用水为超纯水；
聚山梨酯-80（分析纯，天津恒兴化学试剂有限公
司）；无菌氯化钠溶液、灭菌蒸馏水（单位自制）。
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus [CMCC
（B）26003]、铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa
[CMCC（B）10104] 均购于湖南省药品检验所。
肉汤琼脂培养基（批号 090919，用于金黄色葡
萄球菌培养）、麦康凯琼脂培养基（批号 090422，
用于铜绿假单胞菌培养），均购自上海信然生物技术
有限公司。
2 方法与结果
2.1 样品的制备
2.1.1 金银花超微粉体样品制备 称取金银花药材
300 g 于贝利粉碎机中，在−10 ℃～10 ℃下进行超
微粉碎 7 min，即得金银花超微粉体。粒径（D）分
布为 0.84～107.33 μm，D50≤16 μm，D＜75 μm 的
颗粒累积在 98%以上。
精密称定已制备的金银花超微粉体样品 0.5 g
于具塞锥形瓶中，加 50%甲醇 50 mL 称定质量，
静置 30 min，然后超声提取 30 min，放冷，称定
质量，用 50%甲醇补足减失的质量，离心，取上清
液适量，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，
即得。
2.1.2 单一极性部位样品制备[7] 精密称取金银花
超微粉体 0.5 g，按照次序进行单一溶剂提取，分别
精密加入石油醚、三氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇、
乙醇、水各 50 mL，称定质量，索式提取到管内样
品无色为止，放冷，再称定质量，用相应的溶剂补
足减失的质量，取出样品挥干至无上次溶剂残留，
再进行下次提取。提取液滤过，精密量取续滤液 5
mL，水浴蒸干，各极性部位的残渣分别用甲醇充分
洗涤并定容至 5 mL，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得
单一极性部位样品。
2.1.3 参照物溶液的制备 精密称取绿原酸对照品
适量，加 50%甲醇配成绿原酸质量浓度为 76 μg/mL
的参照物溶液。
2.2 6 个极性部位指纹图谱的建立
2.2.1 色谱条件 Lichrospher5 C18 柱（200 mm×
4.6 mm，5 μm）；柱温 35 ℃；流动相为甲醇（A）- 0.1%
磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0～10 min，15%～20%
A；10～20 min，20%～25% A；20～30 min，25%～
32% A；30～35 min，32%～40% A；35～40 min，40%～
41% A；40～50 min，41% A；50～55 min，41%～15%
A；55～60 min，15% A；体积流量 1 mL/min；进样
量 10 μL；检测时间 60 min；检测波长为 240 nm。
2.2.2 精密度试验 取“2.1.2”项下醋酸乙酯部位
的样品 10 μL，按以上色谱条件连续进样 6 次，用“中
药指纹图谱相似度计算软件”计算，所得相似度为
0.998 5、0.997 8、0.996 6、0.996 5、0.988 7、0.996 8，
相似度极高，说明供试品进样精密度良好。
2.2.3 重现性试验 平行取样品 5 份，按“2.1.2”
项下方法制备 5 份醋酸乙酯部位样品，进样 10 μL，
相似度计算结果为 0.994 3，0.954 7，0.995 8，0.997 2，
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0.993 4，相似度高，说明方法的重现性良好。
2.2.4 稳定性试验 取醋酸乙酯部位供试液 10 μL，
分别在 0、6、12、24、48 h 进样，在同台仪器测得
的色谱指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度评价结
果分别为 0.992 8、0.995 3、0.993 4、0.996 5、0.994 4，
相似度高，说明 48 h 内供试品溶液稳定性较好。结
果表明样品指纹图谱各色谱峰相对迁移时间和峰面
积基本一致，符合指纹图谱研究的技术要求。
2.2.5 供试品溶液的测定 取“2.1.2”项下各极性
部位样品及超微粉体样品各 10 μL，按照上述色谱
条件进行检测，记录 60 min 的色谱峰，即得金银
花超微粉体及单一极性部位的 HPLC 指纹图谱
（图 1）。




S1-石油醚部位 S2-三氯甲烷部位 S3-醋酸乙酯部位 S4-正丁醇部位
S5-乙醇部位 S6-水溶性部位 S7-50%甲醇提取液 S-绿原酸
S1-petroleum ether extracts S2-chloroform extracts S3-ethyl acetate
extracts S4-butanol extracts S5-ethanol extracts S6-water solution
parts S7-50% methanol extracts S-chlorogenic acid
图 1 金银花超微粉体及单一极性部位的 HPLC 指纹图谱
Fig. 1 HPLC fingerprint of superfine powder of L. japonica
and single polarity fraction

2.2.6 相对保留值 α的计算 选择峰面积较大，出
峰时间居中且分离度好，各样品均存在的绿原酸的
色谱峰为参照峰 S，其 α 值为 1，求出样品所有峰
的相对保留值 αi。αi＝tRi′/tRs′，tRi′为各组分的调整保
留时间（调整保留时间为 10 批样品的各个特征峰的
平均保留时间），tRs′为绿原酸的调整保留时间。
2.2.7 相对峰面积Ri的计算 按照 α值大小次序排
列，在每个 α项下标出该组分的相对面积比值 Ri。
Ri 为各峰与参照物峰的峰面积比值，以衡量样品中
各成分相对量稳定情况，评价样品中成分的稳定性。
Ri＝I 峰面积/S 参照物峰面积
根据样品的 HPLC 图谱，计算 αi 和 Ri，凡是 αi
值相同或相近（误差＜1%）的峰即可认为是同一化
合物峰。将各个样品每个峰的 Ri 值列在相应的 αi
值项下，其 αi项下无相应峰的样品，其 Ri 值计为 0，
这样，由αi值和Ri值组成6个极性部位样品的HPLC
相对保留值指纹谱，见表 2。

表 2 6 个极性部位样品的 HPLC 相对保留值指纹谱
Table 2 HPLC fingerprint of relative peak area of six
different polarity fraction samples
极性部位主要特征峰 Ri 峰号 αi
S1 S2 S3 S4 S5 S6
1 0.116 0.054 0.346 0 0.038 0.227 1.449
2 0.163 0 0 0 0 0 0.740
3 0.189 0 0 0 0 0 0
4 0.324 0.068 0 0 0.131 0.286 1.785
5 0.395 0.331 0 0 0.034 2.510 3.656
6 0.543 0.066 0 0 0.029 0.049 0.805
7 0.629 0.062 1.165 0.032 0.021 0 0
8 0.912 0 0.345 0 0.033 0 0
S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
9 1.049 0.057 0.419 0 0.051 0.083 0.892
10 1.125 0 1.144 0.064 0.073 0 0.488
11 1.251 0.094 1.804 0.033 0 0.078 0.720
12 1.478 0.050 0.418 0.036 0.045 0 0
13 1.660 0 6.212 0 0.056 0.086 0
14 1.738 0.096 2.222 0.200 0 0 0
15 1.842 0 0.405 0.031 0 0 0
16 1.997 0.074 0.043 0.082 0 0.055 0.614
17 2.040 0.131 1.419 1.517 0.226 0.066 0
18 2.131 0 0.395 0 0 0 0
19 2.156 0.062 9.145 0.386 0.070 0 0
20 2.205 0 0 0.036 0.066 0 0
21 2.352 0 0.405 0.123 0.041 0 0

2.3 不同极性部位的抑菌活性对比研究
2.3.1 抑菌活性样品制备 称取金银花超微粉体适
量，分别加单一提取溶剂石油醚、三氯甲烷、醋酸
乙酯、正丁醇、乙醇、水进行索式提取，每次提取
到管内样品无色为止，提取液滤过，置于水浴锅蒸
干，得到各单一溶剂提取部位，用 0.1%聚山梨酯-80
溶液充分振摇溶解，制成每毫升相当于 1 g 药材的
药液，灭菌备用。
2.3.2 菌液的配制 分别接种金黄色葡萄球菌新鲜
1
2
3
4
5
6
7
8
S
9 10
11 12
13
14
15 16
17
18
19
20 21
S7
S6
S5
S4
S3
S2
S1
0 17.39 34.77 52.16
t / min
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培养物至肉汤琼脂斜面培养基上，接种铜绿假单胞
菌新鲜培养物至麦康凯琼脂培养基上，均在 35 ℃
下培养 18～24 h。用 0.9%无菌氯化钠溶液 1～2 mL
将菌苔洗下，然后用灭菌水稀释，制成 100 cfu/mL
的两种菌悬液。
2.3.3 阳性对照溶液的制备 取盐酸四环素、氯霉
素适量，精密称定，分别加蒸馏水稀释成含四环素、
氯霉素 50 μg/mL 的溶液。
2.3.4 体外抑菌实验 取培养皿 3 个为一组，在第
1 培养皿中对角均匀放置 2 个牛津杯（共 4 个），第
1 管滴满阳性对照溶液，对角第 2 管滴满空白对照
溶液（0.1%聚山梨酯-80 溶液），另 2 个牛津杯中分
别滴满 2个供试品溶液。在规定条件下（温度 37 ℃，
时间 17 h）培养后，测量形成的抑菌圈直径。样品
共 10 批，实验结果以 x ±s 表示，测定结果见表 3。

表 3 6 个极性部位对供试菌的抑菌圈直径 ( sx ± ，n＝10)
Table 3 Average diameters of six polarity fraction samples
against bacteria tested ( sx ± ，n＝10)
抑菌圈直径/mm
组 别
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌
阴性对照 ― ―
阳性对照 21.23±1.20 19.21±1.40
石油醚部位 8.10±0.08 10.02±0.11
三氯甲烷部位 16.15±0.22 14.32±0.92
醋酸乙酯部位 18.78±1.30 16.98±0.48
正丁醇部位 15.58±1.60 13.18±0.06
乙醇部位 14.55±0.40 13.65±0.07
水溶性部位 13.11±0.30 9.28±1.34

2.4 6 个极性部位抑菌活性结果与指纹图谱相关性
研究[8]
将金银花粉体不同极性部位的抑菌活性结果与
Ri-αi 数据带入 SPSS 13.0 软件进行多元线性回归分
析，以抑菌圈平均值为 Y 值，以 Ri数据为 X 值，并
按照出峰顺序表示为 X1，X2，X3……，进行 Stepwise
回归分析，分析结果见表 4、5。
其中，醋酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌抑菌活
性的回归方程为 Y＝17.844－0.202 X7＋1.039 XS＋
0.153 X11＋0.225 X12＋2.209 X14＋1.124 X16＋1.479
X17－0.348 X19＋0.966 X20－1.171 X21；醋酸乙酯部
位对铜绿假单胞菌抑菌活性的回归方程为 Y＝
39.74－0.382 X7＋1.395 XS＋0.255 X11＋0.919 X12＋
2.434 X14＋0.999 X16＋3.901 X17－0.154 X19＋0.927
表 4 金黄色葡萄球菌抑菌活性结果与Ri-αi数据相关性分析
Table 4 Correlation analysis between anti-S. aureus
activity and Ri -αi data
不同部位
正相关
峰数/个
负相关
峰数/个
非相关
峰数/个
(∑S 有效/∑S 总)/%
石油醚部位 6 2 5 72.37
三氯甲烷部位 6 3 7 63.61
醋酸乙酯部位 7 3 2 95.51
正丁醇部位 4 3 8 69.08
乙醇部位 4 0 6 26.25
水溶性部位 3 0 7 18.84

表 5 铜绿假单胞菌抑菌活性结果与 Ri-αi 数据相关性分析
Table 5 Correlation analysis between anti-P. aeruginasa
activity and Ri-αi data
不同部位
正相关
峰数/个
负相关
峰数/个
非相关
峰数/个
(∑S 有效/∑S 总)/%
石油醚部位 5 2 6 65.28
三氯甲烷部位 6 4 6 70.32
乙酸乙酯部位 7 3 2 95.51
正丁醇部位 4 3 8 69.08
乙醇部位 4 0 6 26.25
水溶性部位 3 0 7 18.84

X20－1.571 X21（Y 为药效指标，Xi 为色谱峰）。分别
对回归方程进行方差假设检验，F 值分别为 30.86、
10.01（P＜0.01），有显著差异。
根据药效指纹图谱分析原则，选用 240 nm 处
醋酸乙酯有效部位的指纹图谱来建立金银花粉体的
“药效指纹图谱”，见图 2，10 批醋酸乙酯有效部位
的叠加图谱见图 3。以醋酸乙酯有效部位有效峰的
相对峰面积比值来建立金银花粉体的相对保留值
“药效指纹图谱”见表 6。
3 讨论
3.1 色谱条件的选择
色谱条件的选择不仅要达到全谱分离，还要保
证抑菌活性效果显著的部位达到最佳的分离度和灵
敏度，并要求与抑菌效应成正相关的峰最多，总峰
面积最大，使有效成分峰的峰面积占总图谱峰面积
的比例最大[8]。金银花的成分复杂，本实验采用二
极管阵列检测器，在波长 200～400 nm 进行全谱扫
描以获得最佳检测波长；还考察了不同流动相体系
及不同洗脱方式对全谱分离效果的影响；综合考虑
各影响因素后，选择检测波长 240 nm，以甲醇-0.1%
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*有效
*effective

图 2 金银花粉体的抑菌活性指纹图谱
Fig. 2 Antibacterial effect fingerprint
for L. japonica powder




图 3 10 批醋酸乙酯部位的 HPLC 指纹图谱
Fig. 3 HPLC fingerprint of ethyl acetate fraction
of ten batches of samples

磷酸水溶液梯度洗脱进行金银花超微粉体的药效指
纹图谱分析。
3.2 相关性分析原则
醋酸乙酯部位 HPLC 图谱含有与抑菌活性呈正
相关的峰最多，而且有效峰面积之和最大，分离度
较好。由 10 批样品指纹图谱可得有效峰的峰面积总
和均值为 13 664 856，占色谱图总峰面积的均值为
表 6 金银花粉体保留值抑菌活性指纹谱
Table 6 Antibacterial effect fingerprint of relative
peak area for L. japonica powder
不同 αi 值的 Ri 批 次
1.000 1.251 1.478 1.738 1.997 2.040 2.205
20090711 1.000 0.040 0.025 0.199 0.089 1.531 0.021
20091020 1.000 0.031 0.034 0.208 0.079 1.498 0.021
20090519 1.000 0.031 0.029 0.191 0.070 1.522 0.051
2009091601 1.000 0.041 0.041 0.199 0.094 1.523 0.032
200911060 1.000 0.034 0.038 0.189 0.088 1.526 0.043
20091010 1.000 0.028 0.036 0.199 0.084 1.512 0.045
20091101 1.000 0.032 0.037 0.199 0.077 1.525 0.034
2009102401 1.000 0.024 0.037 0.204 0.069 1.519 0.045
20091104 1.000 0.033 0.038 0.205 0.083 1.509 0.038
20090425 1.000 0.035 0.041 0.210 0.087 1.506 0.032

95.51%。从而确立了具代表性的金银花粉体有效部
位的抑菌活性指纹图谱，这对于金银花粉体的工业
化生产及推广应用具有积极的指导意义。
参考文献
[1] 中国药典 [S]. 一部. 2010.
[2] 李春来, 李俊松, 刘 丹, 等. 赭石炮制品 X 射线衍射
分析及指纹图谱的建立 [J]. 中草药, 2011, 42(4): 701-
703.
[3] 林武霖, 王如伟, 孙柳燕. 延胡索质量控制的研究进展
[J]. 中草药, 2011, 42(2): 409-412.
[4] 赵渤年, 于宗渊, 丁晓彦, 等. 黄芩质量评价谱-效相关
模式的研究 [J]. 中草药, 2011, 42(2): 380-383.
[5] 孙国祥, 雒翠霞, 任培培, 等. 中药指纹图谱学体系的
构建 [J]. 中南药学, 2007, 5(1): 70-74.
[6] 韦 辉, 刘素香, 刘 毅, 等. 丹参药材的综合质量评
价研究 [J]. 药物评价研究, 2011, 34(5): 343-347.
[7] 赵琰玲, 尹 莲. 金银花化学成分与有效成分提取研
究进展 [J]. 医药导报, 2007, 26(5): 521-523.
[8] 周立艳, 梁生旺, 王淑美, 等. 牡丹皮高效液相色谱
“药效指纹图谱”研究 [J]. 时珍国医国药, 2008, 19(6):
1337-1339.

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