全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 12 期 2011 年 12 月

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分子印迹流动注射化学发光法测定紫草中紫草素
贾宝秀*，李玉琴，刘彩红，李 珂
泰山医学院药学院，山东 泰安 271016
摘 要：目的 建立分子印迹流动注射化学发光法定量分析紫草素的新方法。方法 在酸性条件下，紫草素对高锰酸钾-
甲醛体系发光反应具有明显的增敏作用，以甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂合成紫草素的分子
印迹聚合物，并将其作为分子识别物质，利用紫草素-高锰酸钾-甲醛化学发光体系，结合流动注射化学发光分析技术，
建立测定紫草素的分子印迹流动注射化学发光分析方法。结果 体系的化学发光强度与紫草素质量浓度呈线性关系，其标
准曲线为 Y＝43.2 X＋12.68，r＝0.999 3，线性范围为 1.20～80.0 μg/mL，检出限为 0.36 μg/mL。结论 利用分子印迹流动
注射化学发光分析法测定紫草中的紫草素简便、快速、准确。
关键词：紫草；紫草素；分子印迹聚合物；流动注射化学发光；增敏作用
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)12 - 2545 - 04
Determination of shikonin in Arnebia euchroma by molecular imprinting-flow
injection chemiluminescence method
JIA Bao-xiu, LI Yu-qin, LIU Cai-hong, LI Ke
School of Pharmacy, Taishan Medical University, Tai’an 271016, China
Key words: Arnebia euchroma (Royle) Johnst.; shikonin; molecular imprinting polymer; flow injection chemiluminescence;
sensitizing effect

紫草 Arnebia euchroma (Royle) Johnst.为紫草科
多年生草本植物的干燥根，主要分布于新疆、西藏、
云南、贵州、东北等地[1]。紫草的主要成分有两大
类，一类为脂溶性的萘醌类化合物，主要包括紫草
素、乙酰紫草素、2, 3-二甲基戊烯酰草素等多种紫
草素及其衍生物；另一类为水溶性成分，如紫草多
糖等。紫草具有活血、凉血、清热解毒、利尿、抗
炎杀菌、诱导多种肿瘤细胞凋亡[2]等功能。主治血
热毒盛、疹出不畅、黄疸、丹毒、大便温闭等症。
紫草中紫草素的测定常采用紫外分光光度法[3]、薄
层扫描法[4]、毛细管电泳法[5]及高效液相色谱法[6-8]
等，其中紫外分光光度法常需配合一些辅助手段，
过程复杂；薄层扫描法操作程序过多，影响因素不
易消除；HPLC 分析时间长、试剂成本高、样品处
理较繁琐。因此，建立一种快速、简便、灵敏度高、
选择性好的测定紫草素的新方法具有重要的意义。
化学发光（CL）分析法是一种分子发光光谱分
析法，具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，所用
仪器简单低廉，但选择性差限制了其应用。分子印
迹技术（molecular imprinting technique，MIT）是近
年来发展的高效分离技术，它模拟了生物学上抗体
抗原的特异选择性，在中药功能因子分离中已有应
用[9]。近年来将化学发光与分子印迹技术结合[10-11]，
形成了高选择性、高灵敏度的测定方法。本实验合
成了紫草素的分子印迹聚合物（MIP），并制备了在
线富集发光流通池，建立了紫草素-高锰酸钾-甲醛
体系的分子印迹化学发光分析法，对紫草中紫草素
进行测定，方法准确可靠。
1 材料与仪器
紫草素对照品（中国药品生物制品检定所，
批号 110769-200204）；紫草药材（济南药业集
团有限责任公司中药饮片厂，批号（20070305、
20070507）；α-甲基丙烯酸（MAA）（天津市永大化学
试剂开发中心），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）
由本实验室自制，乙二醇（上海化学试剂总厂第三
分厂），对苯二酚（天津市大茂化学试剂厂），对甲

收稿日期：2011-02-12
*通讯作者 贾宝秀 E-mail: jiabaoxiu@163.com.
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苯磺酸（天津市巴斯夫化工有限公司），偶氮二异丁
腈（AIBN，天津市博迪化工有限公司）。所用试剂
均为分析纯。
IFFM—E 型流动注射化学发光分析仪（西安瑞
迈电子科技有限公司），IFFS—A 型多功能化学发光
检测器（西安瑞迈分析仪器有限公司）。Avater370
型傅里叶变换红外分光光度计（美国热电设备公
司）；UV—2450PC 型紫外可见分光光度计（日本岛
津设备公司）。
2 方法
2.1 MIP 的合成
称取 0.5 mmol 模板分子紫草素和 4 mmol 的功
能单体 MAA 溶于 3.0 mL 甲苯中，超声，静置 3 h，
使模板分子与功能单体充分作用，加入 8 mmol 交
联剂 EGDMA 和 28.0 mg 引发剂 AIBN，超声，充
氮气 10 min 后立即密封。将其置于 60 ℃恒温水浴
锅中 60 h，得到紫色固体聚合物。将固体聚合物取
出，真空干燥，研磨，过 200 目筛，得到粒径 76 μm
左右的分子印迹聚合物颗粒。然后加入甲醇-乙酸
（4∶1）溶液洗脱，超声，静置，上清液离心后于紫
外分光光度计检测，反复洗涤直至无模板分子检出
为止。真空干燥至恒定质量，得到分子印迹聚合物
（MIP）。空白聚合物（NMIP）的制备步骤，除不加
模板分子外，与上述操作相同。
2.2 微型 MIP 柱的制备
向玻璃柱（16 mm×3 mm）内填充 MIP 颗粒，
两端用玻璃棉堵住，防止流失并保持畅通，将此
MIP 柱连接在流路中，置于光电倍增管前。高锰酸
钾和甲醛盐酸溶液合并流通过 MIP 柱与柱中的紫
草素发生化学发光反应，产生发光信号，直到发光
信号趋于稳定不再变化，此时柱中的紫草素被洗干
净，用水洗去柱中的残留物质以备用。
2.3 MIP 的静态结合试验
精密称取 MIP 或 NMIP 40.0 mg 放入 10 mL 试
管中，加入 5.0 mL 已知浓度的紫草素溶液，置于
25 ℃恒温培养振荡器中，室温下振荡 8 h，滤膜滤
过，滤液用紫外分光光度法测定紫草素的平衡浓度，
根据吸附前后溶液中紫草素的浓度变化，计算聚合
物的吸附量（Q），平行测定 3 次，取平均值。
2.4 干扰试验
在选择的试验条件下，分析在 20.0 μg/mL 的紫
草素溶液存在下，分别采用分子印迹聚合物和未采
用分子印迹聚合物时常见物质的干扰情况，以加入
干扰物前后发光强度的相对误差小于±5%作为不
干扰的标准，以共存物质对本体系不产生干扰的最
大允许质量与被测物的质量比值为干扰倍数，干扰
倍数值越大，说明方法选择性越好。结果见表 1。
可以看出，使用 MIP 与未用 MIP 相比，方法的选
择性得到了较大的提高。
表 1 在有无 MIP 两种情况下共存物质对紫草素的干扰
Table 1 Interference of coexisting substances on shikonin
with MIP or without MIP
干扰倍数
共存物质 有 MIP 无 MIP
K+、Na+、Cl− 1 500 1 200
Ca2+、Mg2+、Fe3+ 1 000 500
淀粉 800 600
蔗糖 500 200
色氨酸，甘氨酸，酪氨酸 100 5
3 结果与讨论
3.1 MIP 的结合特性
利用静态结合试验，来考察 MIP 对紫草素吸附
特性。根据其对不同初始浓度紫草素水溶液的Q值，
绘制吸附等温线，见图 1。

图 1 MIP（A）和 NMIP（B）对紫草素的等温吸附曲线
Fig. 1 Isothermal adsorption curves of MIP (A) and NMIP (B)
可以看出，随着紫草素质量浓度的逐渐升高，
MIP 和 NMIP 对紫草素的吸附量都呈增大趋势，但
在所考察的质量浓度范围内，MIP 的吸附量明显大
于 NMIP，且随紫草素质量浓度的增大，二者吸附
量的差别也增大。说明 NMIP 对紫草素的吸附主要
是非特异性吸附，其吸附能力相对较弱；而 MIP 包
含有功能基固定排列的空穴，其大小和结构与模板
分子相互补，这种空穴对印迹分子紫草素具有“记
忆”功能，因而 MIP 对紫草素的吸附能力强。
3.2 化学发光分析条件的优化
3.2.1 反应介质及其浓度的选择 以 1.0 mol/L 的
硫酸、硝酸、磷酸、盐酸、多聚磷酸分别为反应介
50
45
40
35
30
25
20
15
0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
A
B
Q
/
(m
g·
g−
1 )

紫草素/(mg·mL−1)
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质，测定高锰酸钾-甲醛-紫草素体系的化学发光强
度。结果表明，在盐酸介质中化学发光信号最强，
所以选取盐酸为反应介质，并且化学发光强度随盐
酸浓度的增大而先增大后减小，当盐酸为 1.8 mol/L
时，发光信号趋于平稳且信噪比最大。因此选择盐
酸浓度为 1.8 mol/L。
3.2.2 高锰酸钾浓度的选择 高锰酸钾在此化学发
光反应中是氧化剂，影响反应的化学发光强度。在
紫草素为 20 μg/mL，盐酸浓度为 1.8 mol/L，甲醛体
积分数为 10.0%条件下，本试验考察了 5.0×10−5～
4.0×10−4 mol/L 高锰酸钾对发光强度的影响，结果
见图 2。高锰酸钾为 3.0×10−4 mol/L 时，发光强度
最大。
3.2.3 甲醛体积分数的选择 甲醛作为增敏剂可以
增强化学发光强度，提高方法的灵敏度。在紫草素
为 20 μg/mL，盐酸浓度为 1.8 mol/L，高锰酸钾为
3.0×10−4 mol/L 条件下，考察 2%～15%不同体积分
数的甲醛溶液对发光强度的影响。结果见图 3，随
着甲醛体积分数的增大发光强度增大，当其体积分

图 2 高锰酸钾浓度对化学发光体系的影响
Fig. 2 Effect of KMnO4 concentrations
on chemiluminescence

图 3 甲醛体积分数对化学发光体系的影响
Fig. 3 Effect of HCHO concentration
on chemiluminescence
数为 10%时，化学发光强度得到最大值，继续增大
时，化学发光强度减小，因而本实验选用 10%甲醛
溶液。
3.2.4 吸附时间的选择 吸附时间是指标准溶液或
样品溶液流过 MIP 柱的时间。吸附时间决定着紫草
素吸附在 MIP 柱上的量，既影响测定的灵敏度，又
影响测定的线性范围。考察了吸附时间在 10～120 s
对化学发光强度的影响。对于 20.0 μg/mL 的紫草素
溶液，随着吸附时间的增加发光强度逐渐增大，在
50 s 时，吸附基本达到平衡。因此，选择的吸附时
间为 50 s。
3.2.5 化学发光反应时间的选择 化学发光试剂
流过 MIP 柱时，与吸附在柱上的紫草素发生反应，
产生增强的化学发光。当发光强度回到基线时，表
明 MIP 柱上的紫草素已被反应完全，完成这样一
个发光过程需要 40 s。所以，选择化学发光反应时
间为 40 s。
3.2.6 最佳化学反应条件的确定 通过对化学反
应条件的优化，最终确定的反应条件为盐酸 1.8
mol/L，高锰酸钾 3.0×10−4 mol/L，甲醛体积分数
为 10%，吸附时间 50 s，化学发光反应时间为 40 s。
3.3 对照品溶液的制备
称取紫草素对照品 5.0 mg，加适量乙醇溶解后
定容于 10 mL 量瓶中，得 500 mg/L 的对照品储备
溶液，4 ℃保存，临用时稀释成各质量浓度的对照
品溶液。
3.4 供试品溶液的制备
将干燥紫草药材用粉碎，过 30 mm 孔径筛，
精确称取紫草药材粉末 0.50 g，置 50 mL锥形瓶中，
加乙醇 30 mL，超声提取 30 min，振摇后静置冷
却 10 min，滤过，滤渣加 20 mL 乙醇，超声提取
20 min，合并乙醇滤液并定容至 50 mL，置水浴蒸
干，残渣用乙醇溶解并定容至 20 mL，用 0.22 μm
微孔滤膜滤过后即得供试品溶液。
3.5 标准曲线的绘制
在“3.2.6”项选定的最佳实验条件下，对 2.0、
10.0、20.0、30.0、40.0、60.0、80.0 μg/mL 紫草素
溶液的发光强度进行测定，绘制标准曲线。结果表
明，体系的化学发光强度与其质量浓度呈线性关
系，以相对化学发光强度（Y）为纵坐标，紫草
素的质量浓度为横坐标（X），绘制其标准曲线为
Y＝43.2 X＋12.68，r＝0.999 3。线性范围为 1.20～
80.0 μg/mL，检出限为 0.36 μg/mL。
900
800
700
600
500
400
300
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
发
光
强
度
/
lx


2 4 6 8 10 12 14 16
甲醛 / %
900
800
700
600
500
450
发
光
强
度
/
lx

KMnO4 / (×10−4mol·L−1)
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3.6 精密度试验
对 20.0 μg/mL 的紫草素溶液进行分析，6 次平行
测定紫草素发光强度的 RSD 值为 2.8%。
3.7 重现性试验
精密称取批号为 20070305 的样品 6 份，按供
试品溶液制备方法制备样品，测定，计算紫草素的
平均质量分数为 1.65%，RSD 为 2.6%，说明该方法
的重现性良好。
3.8 稳定性试验
精密量取适量批号为 20070305 的供试品溶
液，分别于制备后 0、1、2、4、8、12、24 h 测定，
记录发光信号，计算其 RSD 为 3.2%，表明供试品
溶液在 24 h 内稳定。
3.9 加样回收率试验
精确称取紫草药材（批号 20070305）粉末 0.50
g，置 50 mL 锥形瓶中，加乙醇 30 mL，超声提
取 30 min，振摇后静置冷却 10 min，滤过，滤渣
加 20 mL 乙醇，超声提取 20 min，合并乙醇滤液
并定容至 50 mL，置水浴蒸干，残渣用乙醇溶解
并定容至 20 mL，用 0.22 μm 微孔滤膜过滤后即
得供试品溶液，依本法测定其浓度，分别稀释成
20.87、41.75、35.50 μg/mL 的样品溶液，依次加
入 20.00、30.00、35.00 μg/mL 已知质量浓度的紫
草素对照品溶液，每个浓度平行测定 3 次，计算
其平均值，得到回收率为 96.1%。
3.10 样品测定
精密量取供试品溶液适量，进行分析，根据回
归方程计算出 2批药材中紫草素的量，分别为 1.67%
和 1.42%。采用高效液相色谱法[7]测定，分别为 1.64%
和 1.45%。两种方法测定结果基本一致。
4 结论
本实验合成了紫草素的分子印迹聚合物，并
制备了在线富集发光流通池，建立了紫草素-高锰
酸钾-甲醛体系的分子印迹化学发光分析法，对紫
草中紫草素进行测定。该方法灵敏度高，重现性
好，样品处理及仪器操作简便，试剂用量少，以
分子印迹聚合物为分子识别物质，提高了化学发
光法的选择性，与中高效液相色谱法相比，此法
具有简便、快速、准确等优点，可实现对中药及
其制剂中紫草素的快速测定。
参考文献
[1] 葛 锋, 王晓东, 王玉春. 药用紫草的研究进展 [J].
中草药, 2003, 34(9): 附 6-附 10.
[2] 吴 振, 吴立君, 田代真一, 等. 紫草素通过线粒体途
径诱导 A375-S2 细胞凋亡 [J]. 中国中药杂志, 2004,
29(12): 1173-1177.
[3] 陈发奎. 常用中草药有效成份含量测定 [M]. 北京:人
民卫生出版社, 1998.
[4] 罗淑荣, 李 彤. 组织培养紫草中萘醌的测定 [J]. 药
学学报, 1991, 26(12): 953-955.
[5] 李全文, 陈缵光, 周 勰, 等. 毛细管电泳法测定紫草
中的紫草素 [J]. 分析化学, 2006, 34(7): 991-994.
[6] 施玉峰, 谢明勇, 梁瑞红, 等. 反相高效液相色谱法测
定紫草素衍生物 [J]. 色谱, 2005, 23(2): 209.
[7] 孟宪生, 沙 明, 曹爱民, 等. HPLC 法测定紫草及其制剂
紫金油中紫草素的含量 [J]. 中草药, 2003, 34(7): 615-616.
[8] 姜 林, 李晓瑾, 贾晓光. 新疆紫草 HPLC 指纹图谱的
研究 [J]. 中成药, 2005, 27(11): 1241-1244.
[9] 郭利飞, 宋承成, 陈永强, 等. 分子印迹技术分离中草
药功能因子的研究与应用 [J]. 药物分析杂志, 2009,
29(6): 1055-1062.
[10] 何云华, 吕九如, 张红鸽, 等. 分子印迹-化学发光分析
法测定安乃近 [J]. 高等学校化学学报, 2005, 26(4):
642-646.
[11] 刘永明, 刘振波, 徐淑周. 分子印迹-后化学发光法测
定盐酸环丙沙星 [J]. 分析试验室, 2009, 28(3): 47-50.