全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 9 期 2011 年 9 月 • 1802 •
• 药材与资源 •
铁线莲属 8 种药用植物 ITS 序列分析
蒋 明 1，周英巧 1，李嵘嵘 2
1. 台州学院生命科学学院，浙江 临海 317000
2. 台州学院医药化工学院，浙江 临海 317000
摘 要：目的 通过测定并比较柱果铁线莲、单叶铁线莲、威灵仙、山木通、毛蕊铁线莲、转子莲、女萎和天台铁线莲的
ITS 序列，为铁线莲属药用植物的分子鉴定提供依据。方法 利用 PCR 法从叶片基因组 DNA 中扩增 ITS，借助 Clustal X、
MEGA、DNASTAR 等软件比较和分析 ITS 的序列特征。结果 铁线莲属 8 种药用植物 ITS1 与 ITS2 之间的长度为 534～561
bp，变异位点 50 个，信息位点 22 个；天台铁线莲与转子莲的遗传距离最小，与女萎遗传距离最大，亲缘关系最远。序列已
提交至 NCBI 数据库，登录号为 JF714638－JF714645。结论 获得铁线莲属 8 种药用植物的 ITS 序列，为分子鉴定奠定了基础。
关键词：铁线莲属；药用植物；ITS 序列；分子鉴定；PCR 法
中图分类号：R287.7 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)09 - 1802 - 05
ITS sequence analysis of eight medicinal plants in Clematis L.
JIANG Ming1, ZHOU Ying-qiao1, LI Rong-rong2
1. College of Life Science, Taizhou University, Linhai 317000, China
2. College of Pharmaceutical and Chemical Engineering, Taizhou University, Linhai 317000, China
Abstract: Objective To provide molecular evidence for identification of medicinal plants in Clematis L., sequencing and comparison
of ITS from C. uncinata, C. henryi, C. chinensis, C. finetiana, C. lasiandra, C. patens, C. apiifolia, and C. patens ssp. tientaiensis were
performed. Methods ITS sequences were amplified from leaf genomic DNA by PCR. Sequence features were compared and
analyzed using Clustal X, MEGA, and DNASTAR softwares. Results Between ITS1 and ITS2 of the eight medicinal plants in
Clematis L., the length of ITS region varied from 534－561 bp with 50 variable sites and 22 parsimony information sites. The smallest
genetic distance was observed between C. patens ssp. tientaiensis and C. patens, and the largest existed between C. patens ssp.
tientaiensis and C. apiifolia revealing their farest genetic relationship. Sequences were submitted to NCBI database with the registry
numbers of JF714638－JF714645. Conclusion ITS sequences of the eight medicinal plants in Clematis L. are obtained, which could
provide a foundation for molecular identification.
Key words: Clematis L.; medicinal plants; ITS sequence; molecular identification; PCR method

铁线莲属（Clematis L.）植物为多年生木质或草
质藤本，少数为直立灌木，分布于热带、亚热带、温
带和寒带地区[1]，全世界有 355 个种[2]，我国的铁线
莲属植物资源十分丰富，有 155 个种[3]。铁线莲属植
物含三萜皂苷、生物碱、香豆素、木脂素和黄酮类
等化学成分，具有抗菌、消炎、抗肿瘤和镇痛等药
理作用[4-5]，在临床和民间常用于利尿通淋和祛风止
痛等[6]。柱果铁线莲 C. uncinata Champ.、单叶铁线
莲 C. henryi Oliv.、威灵仙 C. chinensis Osbeck、山木
通 C. finetiana Lévl. et Vant.、毛蕊铁线莲 C. lasiandra
Maxim.、转子莲 C. patens Merr. et Decne.和女萎 C.
apiifolia DC. 为常见的铁线莲属药用植物，近年来，
在化学成分、HPLC 指纹图谱、组织培养和药理作
用等方面有一些相关研究[7-14]。而天台铁线莲 C.
patens ssp. tientaiensis M. Y. Fang 为多年生攀援草
质藤本植物，仅分布在浙江的天台山、括苍山和北
雁荡山，为浙江特有种，生于海拔 1 000 m 左右的
山坡林下及灌丛，具有一定的药用价值，在民间常
用于止痛、消炎等[15]。
核糖体 DNA 内转录间隔区（internal transcribed

收稿日期：2011-03-05
基金项目：浙江省新苗人才计划项目（2009R428012）
作者简介：蒋 明（1973—），男，浙江嵊州人，博士，副教授，研究方向为植物发育生物学及其分子调控。E-mail: jiangming1973@139.com
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spacer, ITS）序列由于长度保守、信息位点丰富、
核苷酸变异快，已被广泛用于植物种间、属间和科
内的系统发育与分类研究[16-18]。近年来，在药用植
物的分子鉴定、遗传多样性、系统分类等方面有大
量研究[19-23]，而有关用 ITS 序列鉴定铁线莲属药用
植物的研究未见报道。本研究通过测定 ITS 序列，
构建了铁线莲属 8 种植物的系统发育树，从分子系
统学角度探讨它们的亲缘关系，同时为铁线莲属药
用植物的分子鉴定提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料
除转子莲采自青岛崂山外，另外 7 种药材均采
自浙江的临海、黄岩、天台和临安，均由温州大学
丁炳扬教授鉴定。柱果铁线莲和转子莲为硅胶快速
干燥叶片，其余 6 种为新鲜、健康叶片，经蒸馏水
冲洗后用于 DNA 提取。来源见表 1。
表 1 铁线莲属 8 种药用植物来源
Table 1 Resource of eight plants in Clematis L.
编 号 采集地 名 称 登录号
ChITS 临海括苍山 单叶铁线莲 JF714638
CtITS 天台华顶 天台铁线莲 JF714639
CpITS 青岛崂山 转子莲 JF714640
ClITS 临安天目山 毛蕊铁线莲 JF714641
CcITS 天台石梁 威灵仙 JF714642
CuITS 黄岩划岩山 柱果铁线莲 JF714643
CaITS 临海括苍山 女萎 JF714644
CfITS 临海大雷山 山木通 JF714645
1.2 基因组 DNA 的提取
DNA 的制备采用 SDS 法，称取约 1 g 叶片，
经液氮研磨成粉末后用于 DNA 的提取。
1.3 ITS 序列的 PCR 扩增
采用 ITS 通用引物 P1：5’-AACAAGGTTTCC-
GTAGGTGA-3’和 P2：5’-TATGCTTAAATTCAGC-
GGGT-3’ 进行 PCR 扩增，反应在 Bio—Rad C1000
型 PCR 仪上进行。PCR 反应总体积为 20 μL，其中
含 2 μL 10×PCR 缓冲液（含 20 mmol/L Mg2+），0.5
μL dNTP，0.4 μL Taq DNA 聚合酶，P1 与 P2 引物
各 0.5 μL，40 ng DNA 模板，最后加 ddH2O 至 20 μL。
扩增程序为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，
55.5 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，32 个循环后
72 ℃延伸 7 min。PCR 产物全部点样于 1.2%的琼脂
糖凝胶，电泳结束后，在紫外灯下用干净刀片割取含
目的条带的胶块，置于 1.5 mL 离心管中备用。
1.4 PCR 产物的回收、连接和测序
PCR 产物采用 DNA 凝胶回收试剂盒回收，操
作步骤按其提供的说明书进行。取各样品 5 μL PCR
回收产物，克隆到 p-GEM T-easy 载体，置于 4 ℃
冰箱连接过夜，将连接产物转入 DH5α 大肠杆菌感
受态细胞，涂布于 Luria-Bertani（LB）固体培养基
上，37 ℃培养 12 h，挑取白色单菌落于 LB 液体培
养基中，37 ℃振荡培养 10～13 h，菌液经 PCR 验
证后各取 2 个阳性克隆双向测序。
1.5 序列提交和分析
序列通过在线工具 BankIt 提交至 NCBI 数据
库，并获得相应登录号。ClustalX 1.81 软件用于序
列比对，DNASTAR 5.01 软件用于统计 GC 值，采
用 MEGA 3.1 软件构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 ITS 序列比较
测序结果表明，利用 P1/P2 引物扩增到的序列
中除 ITS1、5.8 S 和 ITS2 的全长外，还包含 18 S 和
28 S 的部分序列，铁线莲属 8 种药用植物的 ITS 序
列已提交至 NCBI，编号、登录号和对应的植物名
称见表 1。序列分析结果表明，铁线莲属 8 种药用
植物 ITS1 和 ITS2 之间的长度为 534～561 bp，序列
最长的是天台铁线莲，转子莲次之，两者在长度上
仅差 1 个碱基，序列最短的是单叶铁线莲；ITS1 长
度为 156～180 bp，G＋C 量为 57.69%～65.00%；
ITS2 的长度为 219～223 bp，G＋C 量为 66.21%～
70.14%；天台铁线莲和转子莲 5.8 S 序列长度为 158
bp，其余均为 159 bp。结果见表 2。
表 2 铁线莲属 8 种药用植物 ITS 序列长度及 G＋C 量
Table 2 Length and G+C contents of ITS sequences
of eight plants in Clematis L.
ITS1 ITS2
编 号 ITS/bp 长度/bp G+C/% 长度/bp G+C/%
ChITS 534 156 57.69 219 67.12
CtITS 561 180 65.00 223 69.06
CpITS 560 180 63.89 222 68.92
ClITS 550 172 59.88 219 66.21
CcITS 545 165 58.79 221 70.14
CuITS 542 164 57.93 219 68.95
CaITS 552 173 60.69 220 68.18
CfITS 541 164 58.54 218 67.89
2.2 系统发育分析
利用 Clustal X 1.81 软件对 8 个序列进行比对，
结果表明，CtITS 与其原种 CpITS ITS 序列之间差
异最小，仅存在 4 个碱基的差别，而其余 6 种与
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CtITS 的差别都很大，除发生转换和颠换现象外，
还存在片段或碱基缺失现象，如 CfITS、CcITS 和
CuITS 在＋61 处缺失 15～16 个碱基，ChITS 在＋
201 处缺失 13 个碱基（图 1）。
利用 MEGA 3.1 软件计算 ITS1 和 ITS2 的变异
位点及信息位点，结果表明，ITS1 含 26 个变异位
点和 14 个信息位点，分别占总位点数的 14.21%和
7.65%；而 ITS2 序列中的变异位点和信息位点分别


图 1 铁线莲属 8 种药用植物 ITS1 和 ITS2 序列的比对
Fig. 1 ITS1 and ITS2 sequences comparison of eight plants in Clematis L.
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为 24 和 8 个，占总位点数的 10.71%和 3.57%。利
用 MEGA 3.1 的 Kimura 2-parameter 计算 8 种药用
植物之间的遗传距离。结果表明，天台铁线莲与转
子莲之间的遗传距离最小，为 0.005 5，两者的亲缘
关系最近；其次是毛蕊铁线莲与单叶铁线莲，遗传
距离为 0.011 1；天台铁线莲与女萎之间遗传距离最
大，达 0.060 5，两者关系最远（表 3）。
基于 ITS1 和 ITS2 序列，采用 NJ 法构建了系
统发育树，经 1 000 次自举检测，结果（图 2）表明，
8 种植物可分为两大组，亲缘关系较近的天台铁线
莲与转子莲处于同一分支，山木通与威灵仙处于另
一分支，它们归于一组；遗传距离较近的毛蕊铁线
莲与单叶铁线莲聚为一组，而女萎和柱果铁线莲各
自形成单系树，归于一组。
表 3 铁线莲属 8 种药用植物的遗传距离
Table 3 Genetic distances among eight plants in Clematis L.
编 号 CpITS CtITS CfITS CcITS CuITS ClITS ChITS CaITS
CpITS
CtITS 0.005 5
CfITS 0.033 8 0.039 6
CcITS 0.051 2 0.057 2 0.030 8
CuITS 0.051 3 0.057 3 0.033 7 0.051 2
ClITS 0.045 6 0.051 6 0.036 8 0.048 4 0.042 6
ChITS 0.045 6 0.051 6 0.042 8 0.048 4 0.048 5 0.011 1
CaITS 0.054 4 0.060 5 0.042 6 0.054 2 0.048 3 0.019 5 0.030 9


图 2 基于 ITS1 和 ITS2 序列构建的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree constructed based
on ITS1 and ITS2 sequences
3 讨论
限制性片段长度多态性（restriction fragment
length polymorphism，RFLP）、简单序列重复区间扩
增多态性（inter-simple sequence repeat，ISSR）、随机
扩增多态性 DNA（randomly amplified polymorphic
DNA，RAPD）、扩增片段长度多态性（amplified
restriction fragment polymorphism，AFLP）、叶绿体
rbcl、叶绿体 trnL-F 和 ITS 等均为药用植物鉴定、
遗传多样性研究、系统演化分析和植物分类常用的
分子标记。ITS 序列分析技术具有技术简单、结果
准确、重复性好等优点，近年来广泛应用于药用植
物鉴定，是药学研究中的一种重要分子标记[24]。
本研究以 8 种铁线莲属药用植物为材料，利用
PCR 技术分离、测定了各自的 ITS 序列，并提交至
NCBI 数据库，登录号为 JF714638-JF714645，丰富
了 GenBank 数据库中铁线莲属植物的序列信息。在
本研究中，由于柱果铁线莲和转子莲的采集地较远，
只能以干燥叶片为样品提取 DNA，SDS 法提取的
DNA 虽然有降解现象，但并不影响两者 ITS 序列的
扩增，以干叶、干燥茎为材料进行 ITS 序列克隆已
有报道[25-26]。转子莲是天台铁线莲的原种，两者在
形态上十分相似，通过比较它们的 ITS 序列，发现
在个别碱基上存在差异，因此，ITS 序列可将两个
近缘种区分开。ITS 序列可用于植物种间、属间和
科内的系统发育与分类，本研究中，铁线莲属植物
在 ITS 序列上存在几个到几十个碱基的差异，变异
位点和信息位点丰富，可作为铁线莲属 8 种药用植
物之间鉴定的分子标记。本课题组将继续收集国内
外铁线莲药用植物资源，为开展更全面的分子鉴定、
系统发育分析和居群遗传多样性研究奠定基础。
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CtITS
CfITS
CcITS
CuITS
CaITS
ClITS
ChITS
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