全 文 ：昆布多糖硫酸酯对非激素依赖型人前列腺癌 PC23 细胞
及 bcl22、caspase23 基因表达的影响
邹明畅 ,崔飞伦 ,盛玉清 ,邱　镇
①
(江苏大学附属人民医院 ,江苏 镇江 　212002)
摘 　要 :目的 　研究昆布多糖硫酸酯 (LAMS) 对体外培养的非激素依赖型人前列腺癌 PC23 细胞株的作用 ,以及
对 bcl22 和 caspase23 基因表达的影响 ,探讨其抗肿瘤的作用机制。方法 　分别用 0、50、100、200μg/ mL LAMS 作
用于 PC23 细胞 ,用 WST28 法检测细胞生长的抑制作用 ,利用流式细胞术 ( FCM) 分析细胞周期和凋亡的变化 ,用
荧光显微镜观察 PC23 细胞形态 , RT2PCR 和 Western blotting 检测细胞增殖、凋亡相关基因 bcl22 和 caspase23
mRNA 及蛋白的表达。结果 　LAMS 能抑制 PC23 细胞的增殖 ,呈时间2剂量效应 ;不同质量浓度 L AMS 诱导
PC23 细胞出现剂量依赖性 S + G2期阻滞 ;LAMS 作用于 PC23 细胞后出现凋亡的形态学改变 ,LAMS 对 PC23 细胞
bcl22 mRNA 和蛋白表达均呈剂量依赖性减弱 ,对 PC23 细胞 caspase23 mRNA 和蛋白表达均呈剂量依赖性增强。
结论 　LAMS 能抑制体外 PC23 细胞的生长 ,并促进其 S + G2期阻滞和凋亡 ,LAMS 影响 PC23 细胞相关基因蛋白
的表达 ,可能是其抑制前列腺癌的作用机制之一。
关键词 :昆布多糖硫酸酯 ; 前列腺癌 ; PC23 细胞 ; bcl22 ; caspase23 ; 细胞凋亡
中图分类号 :R286191 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 01 - 0099 - 05
　　前列腺癌是欧美国家主要的男性肿瘤疾病 ,流
行病学研究调查显示 :前列腺癌的发生主要与年龄、
种族、家族遗传背景、地理位置和饮食等因素有
关[ 1 ] 。对于晚期前列腺癌 ,特别是转变为雄激素非
依赖型前列腺癌后 ,泌尿外科医生往往束手无策。
昆布为海带科植物海带 L ami nari a j a ponica
Aresch. 或翅藻科植物昆布 Eckloni a k urome
Okam. 的干燥叶状体 ,内含藻胶酸、氨基酸、多糖、
甘露醇和多种维生素及丰富的碘 ,其中昆布多糖是
昆布的主要活性成分。昆布多糖具有抗肿瘤、调节
免疫、抗凝血等多种活性。昆布多糖经硫酸酯化后 ,
构象发生了改变 ,生成的昆布多糖硫酸酯 (laminar2
in sulp hate , L AMS) 具有多种生物活性 ,其能有效
抑制肿瘤细胞增殖[2 ] ,研究发现 LAMS 为良好的免
疫激活剂 , 能抑制碱性成纤维细胞生长因子
(bF GF) 的附着及其依赖性细胞的增殖[3 ] 。LAMS
还具有抗血管生成及体内外抗肿瘤作用[4 ] 。本研究
利用氯磺酸2吡啶法对昆布多糖进行硫酸酯化得到
L AMS ,通过体外实验研究 L AMS 对非激素依赖型
人前列腺癌 PC23 细胞的作用 ,以及对 bcl22 和
caspase23 基因表达的影响 ,探讨 L AMS 抗肿瘤作
用及其作用机制。
1 　材料
　　非激素依赖型人前列腺癌 PC23 细胞株 ,第二
军医大学长海医院中心实验室提供。LAMS 为本
实验室自制 ,质量分数为 96 % ,L AMS 的相对分子
质量为 16 315。CC K28 试剂盒 (日本株式会社同仁
化学研究所) 、细胞周期检测试剂盒 (美国 Becton
Dickinson 公司) 、Annexin V2FITC 凋亡试剂盒 (晶
美生物公司) 、DMSO (二甲基亚砜) 、胰蛋白酶、氯
霉素、青霉素、ED TA (Amresco 公司) ; RPMI 1640
( Gibco 公司) ; PI ( Sigma 公司) ;小牛血清 ( FBS) ;
TRIzol Reagent ( invit roger ) ; Reverse Tran2
scriptase M2ML V、RNase Inhibitor、Oligod ( T )
18、dN TP Mixt ure (10 mmol/ L) 、SYBR Premix Ex
Taq ( Ta KaRa) ; ECL (发光试剂盒) (上海普飞) ;
引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
2 　方法
211 　细胞处理 : 取对数生长期 PC23 细胞 , 用
0105 % 胰蛋白酶 + 0102 % ED TA 消化后制成单细
胞悬液 ;将细胞浓度调整为 5 ×104 / mL 接种于培养
皿 (10 mm 直径) ,每皿加 6 mL 细胞悬液 ;24 h 后
更换培养液 ,将细胞分为 4 组 ,每组 3 个培养皿。4
组分 别 为 : 对 照 组、L AMS ( 50、100、200 μg/
mL) 组。
212 　L AMS 对体外培养 PC23 细胞生长的影响 :将
·99·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
①　　收稿日期 :2009204210
　　基金项目 :镇江市科学技术局资助项目 (SH2007027)
　　作者简介 :邹明畅 (1971 —) ,男 ,江苏金坛人 ,副主任中药师 ,硕士 ,研究方向为中药学。
Tel : (0511) 88915959 　E2mail : zou mc @126. com
处理的 PC23 细胞接种于 96 孔板 ,每孔加 100μL
细胞悬液 ,每组 6 个复孔和一个调零孔 (只加培养
液不加细胞) 。应用 WST28 法测定细胞第 1～3 天
的吸光度 ( A ) 值 (每天取出一块 96 孔板检测) 。
检测时 ,每孔内加 10μL 的 CC K28 试剂 ,继续培养
4 h ,酶联免疫测定仪在 450 nm 波长处测 A 值 ,参
比波长为 600 nm。
213 　L AMS 对 PC23 细胞周期的影响 :第 3 天 ,弃
培养液 , PBS 洗涤细胞 3 次 , 0105 % 胰蛋白酶 +
0102 % ED TA 消化 ,1 000 r/ min 离心 5 min ,弃上
层液体 ;加入 1 mL 缓冲液 ,轻轻摇动试管使细胞分
散悬浮 ;室温下 1 000 r/ min 离心 5 min ,弃上层液
体 ;重复以上两步骤 2 次 ;加入 250μL Solution A ,
轻轻摇动试管 ,室温下静置 10 min ;加入 200 μL
Solution B ,轻轻摇动试管 ,室温下静置 10 min ;加
入 200μL Solution C ,轻轻摇动试管 ,4 ℃避光静
置 10 min ;流式细胞仪检测。
214 　L AMS 对 PC23 细胞凋亡的影响 :培养 24、
48、72 h ,分别弃培养液 , PBS 洗涤细胞 3 次 ,不含
ED TA 的 0105 % 胰蛋白酶消化 ,1 000 r/ min 离心
5 min ,弃上层液体 ; PBS 洗涤细胞 2 次 ;用 500μL
结合缓冲液悬浮细胞 ;加入 5μL Annexin V2FITC
混匀后 ,加入 5μL PI ,混匀 ;室温、避光反应 5 min ;
流式细胞仪检测。
215 　荧光显微镜观察 PC23 细胞形态 :第 3 天 ,取
出盖玻片 ,PBS 洗涤细胞 2 次 ;在 500μL 的结合缓
冲液中加入 5μL Annexin V2FITC ,5μL PI 混匀 ;
将上述溶液滴加于盖玻片表面 ,使长有细胞的盖玻
片表面均匀覆盖 ;室温、避光反应 5 min ;将盖玻片
倒置于载玻片上 ,于荧光显微镜下、双色滤光片
( FITC 和罗丹明) 观察。Annexin V2FITC 荧光信
号呈绿色 ,PI 荧光信号呈红色。
216 　R T2PCR 检测 bcl22 和 caspase23 mRNA 的
表达 :采用 Genamics Expression 软件设计引物 ,
bcl22 mRNA 扩增引物序列 : 上游 5′2GGGA GA2
CA GGGTACGA TAA23′, 下 游 5′2CA T T T GGG2
GAACCGTCT GAA23′;caspase23 mRNA 扩增引物
序列 : 上游 5′2ACT GGAA T GTCA TCTCGCTCT2
GCGA23′, 下 游 5′2CCACGACCCGTCCT T T GA2
3′; β2actin 作 为 内 参 照 : 上 游 5′2A GA GC2
TACGA GCT GCCT GAC23′, 下 游 5′2ACA TCT2
GCT GGAA GGT GGAC23′, 扩 增 产 物 211 bp 。
Trizol 提取液提取总 RNA ,用逆转录酶 Reverse
Transcriptase M2ML V 进行逆转录合成 cDNA ,进
行 R T2PCR ,扩增条件为 :变性 95 ℃、10 s ,退火
60 ℃、20 s ,延伸 72 ℃、20 s ,共进行 40 个循环 ,最
后 72 ℃延伸 2 min ,4 ℃保存。最后用 115 % 琼
脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。
217 　Western blot ting 检测 Bcl22 和 caspase23 蛋
白表达 :将细胞裂解制片 ,离心取上清液 ,95 ℃变
性 , - 20 ℃保存。灌胶后将其放入电泳槽中 ,取出
上样样品至 200μL 的 EP 管中 ,加入 5 ×SDS 上样
缓冲液至终浓度。将样品于沸水中煮 5～10 min 使
蛋白变性 ,冰上冷却 ,用微量进样器取 15μL 蛋白
样品上样 ,缓慢加入。电泳 :80 V 恒压 ,样品跑至分
离胶 ;改 120 V 恒压样品跑到底。终止电泳 ,进行
转膜。400 mA 转膜 60 min。立春红染色 , 用
dd H2 O 冲洗。PVDF 膜用 5 % 脱脂奶粉溶解在
TBST ,常温封闭 2 h ,摇床缓慢混匀。将封闭的膜
用 TBST 冲洗两遍 ,5 min ×2 次。加入一抗 (用
TBST 稀释) , 4 ℃过夜。( MMP22 稀释成 1 μg/
mL , MMP29 稀释成 3 μg/ mL ) ; TBST 洗膜 : 10
min ,3 次 ,加入二抗 (1 ∶5 000 用 TBST 稀释) ,室
温 ,反应 1 h。(MMP22 二抗为 anti2mouse , MMP2
9 二抗为 anti2rabbit) ; TBST 洗膜 :10 min ,3 次 ,化
学发光试剂检测。
218 　统计学分析 :所有实验数据用 x ±s 表示 ,应
用 SPSS 1310 统计软件中的 ANOVA 对多组数据
进行统计学分析 ,两组数据间比较采用 St udent2t
检验。
3 　结果
311 　L AMS 对 PC23 细胞生长的抑制作用 :不同质
量浓度 L AMS 作用后 ,采用 WST28 法进行细胞增
殖的检测。L AMS 质量浓度为 50μg/ mL 时 ,对非
激素依赖型人前列腺癌 PC23 细胞无明显的生长抑
制作用 ,24、48、72 h 生长抑制率均为负值 ;LAMS
质量浓度为 100、200μg/ mL 时对 PC23 细胞有明
显的生长抑制作用 ,LAMS 质量浓度为 200μg/ mL
且作用 72 h 的抑制率为 45191 % ,随着 L AMS 质
量浓度的增加和作用时间的延长 ,对 PC23 细胞的
生长抑制率逐渐增高 ,呈时间2剂量效应 ,其中对照
组 (0μg/ mL ) 与 50μg/ mL 组间无显著性差异 ,
100、200μg/ mL 组与对照组 (0μg/ mL) 比较均有
显著性差异 ( P < 0105) ,结果见图 1。
312 　L AMS 对 PC23 细胞周期的影响 :不同质量浓
度 LAMS 作用于 PC23 细胞 72 h 后 ,用流式细胞仪
分析细胞周期。随着 L AMS 质量浓度增加 , G1 期
细胞比例逐渐减少 , S + G2 期细胞比例呈剂量依赖
·001· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
1～3 　50、100、200μg ·mL - 1 LAMS
图 1 　不同质量浓度的 LAMS 作用不同时间对 PC23 细胞的
生长抑制作用 ( n = 6)
Fig. 1 　Inhibition of LAMS at different concentration on growth
of PC23 cells treated for different times ( n = 6)
性增加 ,表明存在 S + G2 期阻滞。其中对照组 (0
μg/ mL) 与 L AMS 50μg/ mL 组间无显著性差异 ,
L AMS 100μg/ mL 组与对照组 (0μg/ mL) 比较均
有显著性差异 ( P < 0101) ,L AMS 200μg/ mL 组与
对照组 ( 0 μg/ mL ) 比较均有显著性差异 ( P <
0105) ,结果见表 1。
313 　L AMS 对 PC23 细胞凋亡的影响 :不同质量浓
度 LAMS 作用后 ,第 3 天进行流式细胞仪分析 ,
L AMS 质量浓度为 50、100、200μg/ mL 时促进 PC2
3 细胞的凋亡 ,LAMS 质量浓度为 200μg/ mL 且作
用 72 h 的凋亡率为 7175 % ,随着 LAMS 质量浓度 表 1 　不同质量浓度 LAMS 对 PC23 细胞周期的影响( x ±s , n = 3)Table 1 　Effect of LAMS at different concentration on cycledistriction of PC23 cells ( x ±s , n = 3)组别 ρ/ (μg ·mL - 1) G1 S + G2对照 0 671 45 ±0125 321 55 ±0125LAMS 50 661 07 ±0139 331 93 ±0139100 581 06 ±0134 3 3 411 94 ±0134 3 3200 531 26 ±2121 3 461 74 ±2121 3　　与对照组比较 : 3 P < 01 05 　3 3 P < 0101　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs cont rol group的增加 ,PC23 细胞凋亡率逐渐增高 ;但 PC23 细胞的凋亡率与作用时间的延长无明显关系。荧光显微镜观察 ,随着 L AMS 质量浓度的增加 ,PC23 细胞凋亡小体逐渐增多 ,甚至出现细胞死亡。结果见图 2。314 　L AMS 对 PC23 细胞 bcl22 mRNA 表达的影响 :对照组 (0μg/ mL ) PC23 细胞有 bcl22 mRNA阳性 ,显示为 185 bp 条带 ,随着 LAMS 质量浓度的增加 ,bcl22 mRNA 的表达明显减弱 ,分别是对照组的 92155 %、32169 %、14115 % ,呈剂量依赖性。其中对照组 (0μg/ mL) 与 L AMS 50μg/ mL 组间无显著性差异 ,L AMS 100、200μg/ mL 组与对照组(0μg/ mL) 比较均有显著性差异 ( P < 0101) ,结果见图 3。
315 　L AMS 对 PC23 细胞 caspase23 mRNA 表达
·101·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
的影响 :对照组 (0 μg/ mL ) PC23 细胞 caspase23
mRNA 阳性 ,显示为 151 bp 条带 ,随着 L AMS 质
量浓度的增加 ,caspase23 mRNA 的表达明显增加 ,
分别是对照组的 142142 %、430130 %、912112 % ,呈
剂量依赖性。其中对照组 (0μg/ mL) 与 L AMS 50
μg/ mL 组间无显著性差异 ,L AMS 100、200μg/ mL
组与对照组 (0μg/ mL) 比较均有显著性差异 ( P <
0101) ,结果见图 4。
316 　L AMS 对 PC23 细胞 Bcl22 蛋白表达的影响 :
不同质量浓度 L AMS 作用后 , Western blot ting 检
测 Bcl22 的结果为 23 000 条带。对照组 (0 μg/
mL) PC23 细胞 Bcl22 蛋白表达与 GA PD H 的比值
为 0151 ±0101 ; LAMS 50 μg/ mL 组为 0148 ±
0101 ,L AMS 100μg/ mL 组为 0118 ±0104 ,LAMS
200μg/ mL 组为 0104 ±0102。与对照组比较 ,随着
L AMS 质量浓度的升高 ,Bcl22 蛋白表达明显减弱 ,
呈剂量依赖性。其中对照组 (0μg/ mL ) 与 LAMS
50μg/ mL 组间无显著性差异 ,L AMS 100μg/ mL
组与对照组 (0μg/ mL) 比较均有显著性差异 ( P <
0105) ,L AMS 200μg/ mL 组与对照组 (0μg/ mL )
比较均有显著性差异 ( P < 0101) ,结果见图 5。
317 　L AMS 对 PC23 细胞 Caspase23 蛋白表达的
影响 : 不同质量浓度 L AMS 作用后 , Western
blotting 检测 Caspase23 的结果为 32 000 条带。对
照组 (0μg/ mL) PC23 细胞 Caspase23 蛋白表达与
GA PD H 的比值为 0152 ±0106 ;L AMS 50μg/ mL
组为 0152 ±0103 ,LAMS 100μg/ mL 组为 0191 ±
0104 ,LAMS 200μg/ mL 组为 1119 ±0103。与对
照组比较 ,随着 L AMS 质量浓度的升高 ,Caspase23
蛋白表达明显增加 ,呈剂量依赖性。其中对照组
(0μg/ mL) 与 L AMS 50 μg/ mL 组 间 无 显 著
性差异 , LAMS 100、200 μg/ mL 组 与 对 照 组
(0μg/ mL) 比较均有显著性差异 ( P < 0101) ,结果
见图 6。
·201· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
图 6 　LAMS 对 PC23 细胞 Caspase23 蛋白表达的影响 ( x ±s , n = 3)
Fig. 6 　Effect of LAMS on Caspase23 protein expression of PC23 cells ( x ±s , n = 3)
4 　讨论
　　前列腺癌是欧美国家主要的男性肿瘤疾病 ,目
前普遍的观点认为 ,从正常前列腺组织发展到前列
腺癌要经历 4 个主要的过程 :前列腺上皮细胞内瘤、
局部前列腺癌、侵袭性前列腺癌和转移性前列腺癌
等几个阶段 ,其间每一步都伴随着遗传的改变和各
种基因的异常[ 5 ] 。
本实验结果证实 L AMS 体外能抑制 PC23 细
胞的生长 ,并促进其 S + G2期阻滞和凋亡 ,抑制 bcl2
2 mRNA 表达及其蛋白表达 , 并促进 caspase23
mRNA 表达及其蛋白表达。
本研究结果初步证实 LAMS 具有体外抗前列
腺癌作用。
参考文献 :
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徐长卿多糖的分离纯化及其抗辐射和升高白细胞的作用
朱世权1 ,2 ,蔡文秀1 ,薛 　玲1 ,许云禄1
①
(11 福建医科大学蛇毒研究所 ,福建 福州 　350004 ; 21 福建省肿瘤医院 药剂科 ,福建 福州 　350014)
摘 　要 :目的 　从徐长卿中提取多糖组分并观察其对辐射和环磷酰胺 (CTX) 所致小鼠骨髓抑制的影响。方法
水提醇沉法从徐长卿根茎粉末中提取徐长卿多糖粗品 (CPB) ,粗品经 DEA E2Sepharose FF 柱纯化 ,组分作 IR 分
析。以 715 Gy 60 Co 射线正面及背面照射小鼠 ,观察徐长卿多糖对模型小鼠外周白细胞总数、骨髓 DNA 系数、胸
腺系数及脾系数的影响。以 CTX 100 mg/ kg ip 1 次致小鼠骨髓抑制后 ,观察徐长卿多糖对模型小鼠外周血白细胞
总数的影响。结果 　CPB 经 DEA E2Sepharose FF 柱色谱分离获得两个多糖组分峰 (CPBA 和 CPBB) ,提取率分别
16157 %、7180 %。小鼠接受 60 Co 辐射后 ,CPBB 高剂量[ 100 mg/ (kg ·d) ]组小鼠外周血白细胞数、骨髓 DNA 系
数与模型组相应指标比较均明显增高 ( P < 0105) ;CPBB 低剂量 [ 50 mg/ (kg ·d) ]组胸腺系数及脾系数 (0192 ±
0132) 与模型组相应指标比较均明显增高 ( P < 0101) 。小鼠 ip CTX 后 ,CPBB 高、中剂量组小鼠外周血白细胞数
与模型组比较均有明显提高 ( P < 0105) 。结论 　徐长卿多糖 CPBB 有明显对抗60 Co 辐射引起的小鼠胸腺、脾缩小
和骨髓 DNA 降低的作用 ,同时也有对抗60 Co 辐射或 CTX 引起的白细胞降低的作用。
关键词 :徐长卿 ; 多糖 ; 60 Co ; 环磷酰胺 ; 抗辐射
中图分类号 :R286191 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 01 - 0103 - 04
·301·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
①　　收稿日期 :2009203212
　　作者简介 :朱世权 (1972 —) ,男 ,福建省闽清县人 ,主管药师 ,硕士 ,研究方向为医院药学。
Tel : (0591) 87688691 　E2mail : zsqsxq @126. com
　　3 通讯作者　许云禄　Tel : (0591) 83569646 　E2mail : snake @mail . fjmu. edu. cn