全 文 ：　第 48卷　第 5期
　Vol.48　 No.5 　　　　　
山　东　大　学　学　报　(医　学　版)
JOURNALOFSHANDOOGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES)　　　　　
2010年 5月　
May2010　
收稿日期:2009-03-18
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30772594)。
作者简介:许爱辉(1982-),女 ,硕士研究生;潘喆(1982-),女 ,医师 ,主要从事前列腺癌分子生物学研究。
通讯作者:苑辉卿(1965-),女 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事肿瘤分子生物学研究。 E-mail:lyuanhq@sdu.edu.cn
　文章编号:1671-7554(2010)05-0018-05 ·基础医学·
地钱素 M抗前列腺肿瘤活性的初步探讨
许爱辉 1 ,潘喆 2 ,蒋汉明 1 ,孔峰1 ,胡志敏3 ,苑辉卿 1
(山东大学 1.医学院生物化学与分子生物学研究所 , 济南 250012;
2.第二医院内分泌科 , 济南 250033;3.齐鲁医院检验科 , 济南 250012)
摘要:目的　检测苔藓植物联苄类化合物地钱素 M的抗肿瘤活性 , 并初探其对前列腺癌细胞的作用机制。方法　
MTT法检测地钱素 M对人白血病细胞株(K562)、人肝癌细胞株(HepG2)、人乳腺癌细胞株(MCF-7)、人前列腺
癌细胞株(LNCaP、DU145及 PC-3)和人正常视网膜色素上皮细胞株(hTERT-RPE1)的增殖影响;溴脱氧尿嘧啶核
苷(BrdU)掺入法检测地钱素 M对 PC-3细胞增殖的作用 , 流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化;Westernblot-
ting检测细胞周期相关蛋白的表达;4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)染色法检测 PC-3细胞核的变化。结果　地
钱素 M可抑制 K562、HepG2、MCF-7、LNCaP、DU145、PC-3细胞的增殖 , 其对PC-3细胞增殖的抑制作用尤为显著 ,
而对 hTERT-RPE1细胞增殖的抑制作用较弱。BrdU结果显示 ,地钱素 M能够降低 BrdU在 PC-3细胞中的掺入;
流式细胞术示 , 地钱素 M将 PC-3细胞阻滞在 G0-G1期 , 且出现明显的 subG1峰 ,并伴随周期相关蛋白的变化;
DAPI示 ,细胞核发生凋亡的特征性变化。结论　地钱素 M具有抑制肿瘤细胞增殖的活性 , 并引起 PC-3细胞周期
阻滞 ,诱导细胞凋亡。
关键词:地钱素 M;细胞凋亡;细胞周期;前列腺癌细胞
中图分类号:R737.25 　　　文献标志码:A
MarchantinMdisplaysgrowthinhibitoryefectson
humanprostatecancercels
XUAi-hui1 , PANZhe2 , JIANGHan-ming1 , KONGFeng1 , HUZhi-min3 , YUANHui-qing1
(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology, SchoolofMedicine, ShandongUniversity, Jinan250012, China;
2.DepartmentofEndocrinology, TheSecondHospitalofShandongUniversity, Jinan250033, China;
3.DepartmentofClinicalLaboratory, QiLuHospitalofShandongUniversity, Jinan250012, China)
Abstract:Objective　ToInvestigatetheantiproliferationaleffectofMarchantinMonhumancarcinomacells.Methods
　ThecytotoxiceffectofMarchantinMwasassessedbyMTTassay.It′sinhibitoryeffectonthegrowthofPC-3cells
wasmeasuredbyincorporationofBrdU.ThecellcycleprogressionandapoptosisofPC-3cellsweredeterminedbyflow
cytometryassay.AlterationsinexpressionofcelcyclerelatedproteinsinPC-3 cellsexposedtoMarchantinMwerede-
terminedbyWesternbloting.NucleicmorphologicalchangesofMarchantinM-treatedPC-3 cellsweredeterminedby
stainingcellswithDAPI.Results　MarchantinM ledtoviabilityinhibitionofK562, HepG2, MCF-7, LNCaP,
DU145andPC-3 cellsinadose-dependentmanner.However, MarchantinMhadnosignificantinhibitoryeffectsonthe
growthofnormalhumanretinapigmentepithelialcels(hTERT-RPE1).Theflowcytometryassayindicatedthattreat-
mentwithMarchantinMresultedincellcyclearrestattheG0/G1phase.Furtherexaminationshowedthatexpressionof
celcyclerelatedproteinswerechangedaftertreatment.TheDAPIstainingassayshowedthatMarchantinMtreatment
causedanincreaseinthefractionofapoptoticcels.Conclusion　TheseobservationsindicatethatMarchantinMisa
promisingcompoundthatshowsantitumoractivityagainstprostatecancercells.
Keywords:MarchantinM;Apoptosis;Cellcycle;Prostatecarcinomacells
许爱辉 , 等.地钱素 M抗前列腺肿瘤活性的初步探讨 19　 　
　　苔藓植物作为从水生到陆生过渡的一类高等植
物 ,品种繁多 ,化学成分结构多样 ,包括萜类化合物 、
酚类化合物和双联苄类化合物等 ,是发现药效活性
分子的宝贵资源 。其所含的联苄类化合物 ,作为一
类新型植物抗生素 ,具有广泛的药理活性 ,包括抗菌
和抗真菌活性 、细胞毒性 、诱导凋亡的活性 、逆转耐
药作用 、抑制环氧合酶和 DNA聚合酶的特性 [ 1-5] 。
本研究通过对天然来源的联苄类化合物进行抗肿瘤
活性筛选 ,寻找具有良好抑制肿瘤细胞增殖活性的
化合物 ,并对分离得到的地钱素 M(MarchantinM)
进行抗肿瘤活性分析 ,初步探讨其抑制前列腺癌
PC-3细胞增殖的作用机制 。
1　材料与方法
1.1　材料　地钱素 M由山东大学药学院天然药物
化学教研室提供。此化合物由该室自 Asterelaan-
gusta中分离纯化 得到 [ 2] 。 人白血病 细胞株
(K562)、人肝癌细胞株(HepG2)、人乳腺癌细胞株
(MCF-7)、人前列腺癌细胞株(LNCaP、DU145)本
室保存 。人前列腺癌 PC-3细胞购自中国科学院上
海细胞库。人正常视网膜色素上皮细胞株(hTERT-
RPE1)由山东大学医学院朱长军教授惠赠 。 MTT
购自 Sigma公司 , p21Cip1、CyclinD1、GAPDH抗体购
自 Santacruz公司 ,磷酸化成视网膜细胞瘤(Rb)抗
体购自 CelSignalTechnology公司。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养　K562、HepG2、LNCaP、DU145、
PC-3细胞培养于含 10%胎牛血清的 RPMI1640培
养液中 , MCF-7细胞培养于含 10%胎牛血清的
DMEM培养液中 , hTERT-RPE1细胞培养于含 10%
胎牛血清的 DMEM-F12培养液中 。细胞于 37℃,
5% CO2细胞培养箱中培养至密度达到 60% ～ 80%
后 ,进行药物处理 。对照组加入相应体积的 DM-
SO。另外 , LNCaP细胞培养液在实验前 24h更换
为不含血清的培养液培养 ,以除去内源性的甾体激
素 。培养液更换为活性炭处理的血清 ,同时在阳性
对照组中加入 10nmol/L激素二氢睾酮(dihydrotes-
tosterone, DHT),药物处理组的培养液中加入地钱
素 M和 10nmol/LDHT,对照组为未处理组。
1.2.2　MTT法检测细胞增殖　细胞接种于 96孔
板中 ,地钱素 M作用于细胞 24h后进行活细胞检
测 。另外 , PC-3和 hTERT-RPE1细胞经地钱素 M
处理 24、48、72h后 ,检测细胞增殖情况。每实验组
设 3个复孔 ,至少重复 3次 。
1.2.3　溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)染色检测细胞增
殖　PC-3细胞接种于 24孔板内 ,地钱素 M分别以
0、5、 10 μmol/L浓度作用 24 h后 , 加入 BrdU(10
μmol/L)继续作用 3 h。细胞经磷酸盐缓冲液
(PBS)洗涤后多聚甲醛固定 20min, 0.2%tritonX-
100破膜 15min。经 PBS洗涤后用 4mol/LHCl处
理 20min, 100mmol/LTris(pH7.8)处理 5min。细
胞用 20%山羊血清封闭 1h后 ,再加入 anti-BrdU抗
体孵育过夜。 PBS洗涤后 ,细胞用碘化丙啶(PI)复
染 30min。尼康荧光倒置显微镜拍摄图像 。
1.2.4　流式细胞术检测细胞周期和凋亡　PC-3细
胞接种于 75mL细胞培养瓶后 ,并经地钱素 M作用
24h,细胞经预冷的 PBS洗涤 2次后 , 70%冷乙醇
固定 ,应用流式细胞仪分析细胞周期时相和凋亡率
的变化。
1.2.5　细胞总蛋白的提取　PC-3细胞分别用 0、5、
10μmol/L浓度的地钱素 M作用 24h, PBS洗涤后收
集细胞。然后用细胞裂解液(20mmol/LHepes, 420
mmol/LNaCL, 0.2mmol/LEDTA, 0.5mmol/LDTT,
0.1%NP40, 25%甘油 , 0.5mmol/L苯甲基磺酰氟 ,
50mg/Laprotinin, 1mmol/L原钒酸盐 , 10mmol/L
氟化钠和 10mmol/Lβ-甘油磷酸酯)裂解 20 min,
4℃ 12 000r/min(离心半径为 20cm)离心 15min,
取上清。 Bradford法测蛋白浓度。
1.2.6　Westernbloting检测蛋白表达变化　每样
品取 40μg蛋白上样 , SDS-PAGE(8%或 12%)用于
分离蛋白组分 。电转移法将蛋白条带转移至硝酸纤
维素薄膜上 (NC膜 ,购自 Bio-Rad)。薄膜经 TBS
配制 5%的脱脂奶粉溶液室温封闭 1h后 ,分别与抗
p21Cip1、抗 CyclinD1、抗 GAPDH及抗磷酸化 Rb的
抗体 4 ℃孵育过夜 。经 TBS洗涤后分别加入辣根
过氧化物酶偶联的二抗培养 1h后 ,用增强型 ECL
化学发光(ECL,购自 Milipore)进行蛋白分析。
1.2.7　4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)染色法检
测细胞核变化　细胞接种于 24孔板内 ,分别以 0、
5、10μmol/L的地钱素 M作用于 PC-3细胞 24 h。
PBS洗 2遍 ,甲醇固定 5min, PBS洗涤后 , 0.1%
Triton固定 5min,加 DAPI染液孵育 10min, PBS洗
涤后显微镜下观察 。
1.3　统计学处理　所有数据均使用 SPSS12.0统
计软件包进行分析 。实验结果采用 t检验 , P<
0.05为差异有统计学意义 。
2　结　果
2.1　地钱素 M对肿瘤细胞增殖的影响　地钱素 M
　 20　 山　东　大　学　学　报　(医　学　版) 48卷 5期　
对各种肿瘤细胞均有抑制作用 ,但作用强度有差异。
地钱素 M对 K562细胞和 HepG2细胞的抑制作用较
弱 ,需要在≥20μmol/L的浓度对其细胞增殖有明显
的抑制作用。但对 MCF-7和 LNCaP、PC-3、DU145
细胞的抑制作用比较明显 ,在 10μmol/L的浓度作用
24h后就有明显的抑制作用 ,其对 PC-3细胞的增殖
抑制作用尤为显著 ,在浓度为 5μmol/L时呈现非常
显著的抑制作用(P<0.01),且这种抑制作用呈剂
量 、时间依赖性。地钱素 M对正常细胞 hTERT-
RPE1的增殖影响较小 ,在较高浓度(50μmol/L)作
用 72h后才有明显的抑制作用 ,结果见图 1。地钱素
M作用于 PC-3细胞后 , BrdU掺入实验结果如图 2所
示 ,对照组的细胞处于正常增殖状态 , BrdU的掺入较
多 ,呈现较多 、较强的绿色荧光;而地钱素 M处理组
增殖的细胞数目明显减少 ,在 5μmol/L的地钱素 M
作用下 ,即呈现明显的增殖抑制结果。
图 1　地钱素 M对多种肿瘤细胞增殖的影响
Fig.1　MTTanalysisofmulti-tumorcelproliferation
图 2　BrdU染色检测对 PC-3细胞增殖的影响
Fig.2　BrdUanalysisiofthePC-3cellproliferation
2.2　地钱素 M对细胞周期的影响　见图 3。地钱
素 M作用于 PC-3细胞 24h后 ,处于 G0/G1期的细
胞明显增多 ,并伴随相应的 S期细胞数减少 。另
外 ,随着地钱素 M作用浓度的增加 , subG1峰逐渐
增强 ,凋亡率随浓度增加而明显增高。
2.3　地钱素 M对周期相关蛋白的影响　见图 4。
地钱素 M显著诱导 PC-3细胞 p21Cip1的表达 ,并随
着作用浓度的增加而明显增加 ,同时 G1期重要的
正调控蛋白 CyclinD1的表达被显著抑制 ,也呈浓度
依赖性降低。另外 Rb蛋白的磷酸化水平随地钱素
M浓度的升高而降低。
图 3　流式细胞术检测细胞周期及凋亡率的变化
Fig.3　ChangesofcelcycleandapoptosisbyFCM
许爱辉 , 等.地钱素 M抗前列腺肿瘤活性的初步探讨 21　 　
图 4　细胞周期相关蛋白表达的变化
Fig.4　EffectsofMarchantinM onexpressionsofcellcycle
relatedprotein
2.4　地钱素 M诱导 PC-3细胞凋亡　见图 5。对照
组细胞核均匀 ,但经 5 μmol/L的地钱素 M作用
24h后 ,细胞核内染色质浓集 ,呈现凋亡细胞的特
点 ,而 10μmol/L的地钱素 M进一步使染色质浓
缩 ,核膜裂解 。
图 5　DAPI染色观察细胞核的变化
Fig.5　ChangesofcellnucleusbyDAPIstainning
3　讨　论
地钱素 M是来源于苔藓类植物狭叶花萼苔
(Asterelaangusta)的双联苄类化合物 。目前双联
苄类化合物已被证实有抗肿瘤活性 ,本研究在对双
联苄类化合物地钱素 M的抗肿瘤活性活性筛选的
过程中发现其对 K562、HepG2、 MCF-7、 LNCaP、
DU145和 PC3细胞的作用比较明显 ,尤其对前列腺
癌细胞株(PC-3)抑制作用最为明显 ,而对人正常上
皮细胞 hTERT-RPE1的抑制增殖作用比较弱 ,说明
此化合物具有选择性的抑制细胞增殖的特性 ,但其
选择性作用机制尚待进一步研究。
前列腺癌(prostatecancer, PCa)在欧美国家的
发病率居男性恶性肿瘤的第一位 ,而近年来在我国
发病率呈逐年上升的趋势 [ 6] 。由于前列腺癌的发病
机制复杂 ,目前尚无理想的治疗方法 ,临床主要采用
手术 、内分泌治疗 、放化疗和冷冻治疗 ,而内分泌治
疗是前列腺癌的标准治疗方法 。内分泌治疗使前列
腺癌临床症状明显改善 ,患者生活质量得以提高 。
然而经一定中位缓解期(一般为 18 ～ 24个月)后 ,
绝大多数前列腺癌转为激素难治性前列腺癌
(HRPC)[ 7-8] ,对抗内分泌治疗 ,转移恶化 ,预后差 ,
死亡率高 。尽管对 HRPC的病理机制有相当深入
的研究 ,至今临床仍缺乏有效的治疗方案 ,化学治疗
仍是治疗 HRPC的主要手段 。本研究对地钱素 M
抗前列腺肿瘤的活性进行了初步探讨。
本研究结果表明 ,地钱素 M能够阻滞 PC-3细
胞于 G0/G1期 ,并诱导细胞凋亡 。真核细胞分裂增
殖必须通过两个关键的细胞周期调控点:G1/S和
G2 /M关卡调控点 。细胞在生长因子的刺激下 , Gl
期 CyclinD表达 ,并与 CDK4/CDK6结合 ,使下游的
靶蛋白如 Rb蛋白磷酸化 ,磷酸化的 Rb释放出转录
因子 E2F,促进许多 E2F应答基因的转录 ,如 Cy-
clinE、A和 CDK1的基因 ,促进细胞由 Gl期进入 S
期[ 9] 。 p21Cip1作为细胞周期抑制蛋白 ,是细胞生长
重要的负调控因子 [ 10] 。 p21Cip1能够与 CyclinD/
CDK4形成复合物使细胞周期停滞在 G1期。通过
诱导 p21Cip1在前列腺癌细胞中的表达 ,会抑制细胞
增殖 。本研究结果显示 ,地钱素 M能够诱导 p21Cip1
的表达 ,同时降低 CyclinD1和 Rb的磷酸化状态蛋
白的表达 ,因此 ,地钱素 M抑制细胞增殖可能与阻
滞细胞在 G0 /G1期有关 。地钱素 M作用于 PC-3细
胞后 ,通过流式检查到细胞凋亡率的增高 ,同时也观
察到细胞核发生了凋亡相关的变化 ,表明地钱素 M
阻滞细胞周期进程的同时诱导细胞凋亡 ,从而抑制
PC-3细胞的增殖。然而 ,地钱素 M诱导的细胞凋
亡率远低于其抑制率 ,提示可能存在其它非凋亡途
径介导的细胞死亡 。
综上所述 ,地钱素 M通过阻滞 PC-3细胞的周
期进程 ,诱导其凋亡从而抑制了细胞的增殖 ,且对正
常细胞的抑制作用较弱;另外通过对几十个双联苄
化合物进行抗肿瘤活性筛选 ,也发现其结构与活性
存在构效关系 ,目前本课题组正在对此类化合物进
行结构修饰 、衍生物制备等工作 ,以期发现更有潜力
的抗肿瘤药物 。
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(编辑:刘霞)
(上接第 17页)　单纯饮食疗法可减缓心肌重构的
进展 ,饮食与运动联合干预可使心肌重构早期良性
逆转。罗格列酮具有明显的改善心肌重构的作用 ,
是可以考虑采取的有效干预措施 ,但儿童应用的安
全性有待进一步验证 。
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(编辑:孙玉芝)