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去甲斑蝥素干扰 HL-60 肿瘤细胞周期及其机制研究
李金龙1-3 ,蔡于琛1-2 ,胡志明3 , 高基民3 ,冼励坚1-2*
( 1 华南肿瘤学国家重点实验室, 广东 广州 510060; 2 中山大学肿瘤防治中心,广东 广州 510060;
3 南方医科大学生物技术学院 生物治疗研究所, 广东 广州 510515)
摘 要:目的 明确去甲斑蝥素 ( no rcantharidin, NCTD) 对肿瘤细胞周期的影响,进一步阐明 NCTD 的抗肿瘤作
用机制。方法 体外培养 HL-60 细胞, NCTD 作用后采用3H-T dR 掺入实验检测 DNA 复制;流式细胞术检测细
胞周期进程; Western blotting 检测细胞周期调控蛋白 Cdk1、Cyclin B1、Cdc 25c 表达变化。结果 不同浓度 ( 16~
128 mol/ L ) NCTD 作用于 HL-60 细胞 12 h 后, DNA 复制受到抑制, 细胞周期出现明显的 S 期累积, 并呈剂量依
赖性趋势;同时观察到 G 2/ M 的阻滞, 且调控 G2 / M 周期进程的调节蛋白 Cdk1、Cyclin B1 及 Cdc 25C 蛋白表达下
调。结论 NCTD 可抑制 HL-60 细胞 DNA 复制、下调周期调控蛋白从而干扰肿瘤细胞的周期进程。
关键词:去甲斑蝥素; DNA 复制; H L-60; 细胞周期
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 08-1315-04
Norcantharidin disturbed cell cycle progress in cancer HL-60 cells and its mechanism
LI Jin- long
1-3
, CAI Yu- chen
1-2
, HU Zh-i ming
3
, GAO J-i min
3
, XIAN L-i jian
1-2
( 1 State Key Labo rato ry of Oncolog y in Southern China, Guangzhou 510060, China; 2. Cancer Center,
Sun Yat- sen Univer sity, Guangzhou 510060, China; 3. Institut e o f Biotherapy, School
of Biot echnolog y, Southern Medical Univ ersit y, Guang zhou 510515, China)
Abstract: Objective T o confirm the inf luence o f no rcantharidin ( NCT D) on cancer cel l cycle, and to
further explore the ant-i cancer mechanism o f NCTD. Methods HL-60 Cells w ere cultured and treated
w ith NCT D,
3
H-T dR incor por at ion assay w as performed to ref lect DNA replicat ion, f low cytometry w as
used to detect cell cycle prog ress, and the cel-l cycle-regulation proteins w ere detected by Western blot t ing.
Results After t reatment w ith NCTD for 12 h, DNA replicat ion w as signif icant ly inhibited and the cell cy-
cle w as ar rested mainly at S phase in a dose-dependent manner. G 2 / M Phase accumulat ion w as also ob-
ser ved and G2 / M regulation pro teins Cdk1, Cyclin B1, and Cdc25c w ere down-regulated. Conclusion
NCT D could interfere w ith cancer cell cy cle thr ough inhibit ing DNA replication and deregulating cel-l cycle-
regulat ion protein.
Key words: norcantharidin ( NCTD) ; DNA r eplicat ion; HL-60; cell cycle
去甲斑蝥素 ( norcantharidin, NCT D) 是斑蝥
素的衍生物,与斑蝥素构型相似, 唯 1、2 位无甲基。
去除两个甲基后, N CT D 的泌尿系刺激作用基本消
失, 而且保留了抗癌活性 [ 1]。研究表明, NCTD 可
以有效抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋
亡[ 2-4] 。NCT D 目前临床主要用于治疗原发性肝
癌、食道癌和胃癌等, 但是 NCTD 的抗肿瘤作用机
制尚不明确[ 5] 。
1315中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 2009- 11-03 基金项目:国家自然科学基金青年科学基金资助项目 ( 30901822)作者简介:李金龙( 1975 ) ,男,山东人,博士,讲师,研究方向为肿瘤药理。T el: ( 020) 62789135 E-mail: lijinlon g75@ sina. com
细胞周期调控异常是肿瘤细胞恶性增殖的重要
环节,目前关于 NCT D的抗肿瘤机制的研究认为主
要是诱导肿瘤细胞 G2 / M 期阻滞, 使肿瘤细胞分裂
增殖受阻并诱发凋亡。如 N CT D 作用于人乳腺癌
MDA-MB-231 细胞 48 h 后[ 6] 、作用于肝癌 HepG 2
细胞 48 h 后[ 7]、作用于人胃癌 SGC-7901 细胞 48 h
后[ 8]、作用于人白血病 K562 细胞 24 h 后 [ 9] , 均出
现 G 2 / M 期细胞累积和细胞凋亡。上述研究认为
NCT D 主要通过诱导凋亡产生抗肿瘤作用,且凋亡
与 G 2 / M 期阻滞相关。这些研究所观察到的细胞
周期的变化皆为 N CT D 作用时间较长的结果,细胞
已经出现凋亡改变, 不能全面反应 NCTD 对细胞周
期的影响。
前期研究发现 NCT D 可以降解 DNA 复制起
始蛋白 Cdc6, 且此降解作用在 NCTD 作用早期就
可出现 ( 12 h) [ 10]。Cdc6 是起始真核细胞 DNA 复
制的重要调节因子, 抑制 Cdc6 功能将有效抑制细
胞的 DNA 复制。因此 N CT D 通过降解 Cdc6、抑
制 DNA 复制,必将首先对反映 DNA 复制的 S 细
胞周期产生影响,本研究旨在明确 NCTD 在作用早
期对体外培养的 H L-60 细胞周期的影响,并初步研
究其作用机制。
1 材料与方法
1 1 主要材料:去甲斑蝥素由北京双鹤高科药业惠
赠,质量分数 99 5% ,生理盐水溶解; RPM I 1640 培
养基及小牛血清均为 Gibco 公司产品; 鼠抗人
GAPDH、CDK1、CyclinB1、Cdc25c 单抗及相应羊抗
鼠二抗均为 Santa Cruz 产品; CO 2培养箱系 HERA
cell产品; 流式细胞仪为 Beckman coulter 产品。
1 2 细胞培养: 人急性早幼粒细胞白血病细胞
HL-60 (本实验室保存) , 在含 10% 小牛血清、100
U/ mL 青霉素和 100 g/ mL 链霉素的 RPM I 1640
培养液中, 37 、5% CO2条件下培养。
1 3 3H-TdR 掺入实验: 取对数生长期的 HL-60
细胞接种于 96孔培养板 ( 2 105个/孔) , 根据前期
实验结果 NCTD 对 HL-60 的 IC50值为 50 mol/
L[ 9] ,选取不同浓度的 NCTD ( 0~ 128 mol/ L ) 作
用于 HL-60 细胞, 结束前 4 h 加入 3H- TdR ( 1
kBq/孔)。自动细胞收集器收集细胞于滤膜上,
80 烤干滤膜, 液闪仪 ( Beckman, Fullerton,
CA, 美国) 计数。实验结果以每分钟计数次数
( cpm) 表示,重复 3次。
1 4 流式细胞术检测:选取不同浓度的 NCT D ( 0、
8、16、32、64、128 mol/ L ) 作用 12 h 后, 测定 HL-
60 细胞周期的变化。收集细胞, PBS 洗涤两次,
70% 乙醇固定过夜, 2 000 r/ m in,离心 10 min, 弃去
乙醇,再次悬浮于 PBS, 细胞经碘化丙啶 ( P I, 10
g/ mL) 染色 5 min, 4 避光 30 m in后, 在流式细
胞仪上用 488 nm 激发光激发, 吸收波长 610 nm,
检测细胞 DNA 水平。
1 5 Western blot t ing 检测: 32 mo l/ L NCTD 作
用 HL-60细胞 12、24、48 h 后, 收集细胞, 加入预冷
的 PBS 洗涤两遍。以 1 107个/ mL 加入细胞裂解
液[ 50 mmol/ L Tris-HCl ( pH 7. 5) , 150 mmo l/ L
NaCl, 1% NP-40, 1 mmo l/ L PM SF, 10 U/ mL 抑
肽酶]置冰上 20 min。13 000 r/ min, 4 离心 10
m in,取上清。蛋白样品行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电
泳后,转移至 PVDF 膜, 含 5% 脱脂奶粉的 T BST
封闭后,加入鼠抗人 GAPDH ( 1 1 000)、鼠抗人
CDK1 ( 1 400)、鼠抗人 Cyclin B1 ( 1 400) 或鼠
抗人 Cdc25C ( 1400) 单抗, 37 孵育 2 h, T BST
清洗后加入兔抗鼠二抗, 37 孵育 2 h, TBST 清
洗后显影曝光。结果采用 Ge-l pro 4. 0 图像分析软
件进行分析, 得出每个蛋白条带累积吸光度值, 并与
加样对照 GAPDH 条带累积吸光度 ( A ) 值进行比
较,得出比值。
1 6 统计学处理: 采用 SPSS 10 0 版软件包进行
统计学处理,数据以 x s 表示,统计检验采用单因
素方差分析。
2 结果
2 1 NCT D 对 HL-60 细胞 DNA 复制的影响: 根
据 NCTD 对 HL-60 的 IC50值为 50 mol/ L [ 9] , 选
取不同浓度的 NCT D ( 0、16、32、64、128 mol/ L )
作用于 HL-60 细胞后, 3H-TdR 掺入实验检测其
DNA 复制。结果显示不同浓度的 N CT D 作用于
HL- 60细胞后,其3H-T dR掺入量明显降低 (图 1)。
图 1 NCTD 对 HL-60 细胞 DNA 复制的影响 (x s, n= 3)
Fig. 1 Inhibition of NCTD on DNA replication
in HL-60 cells ( x s, n= 3)
1316 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
在 12 h 时 未 加药 对照 组 cpm 值最 高, 为
13 402 00 194 21,随着作用时间的延长掺入量有
所降低;加药组的 cpm 值在 NCTD 作用 12 h 后明
显下降,且随作用时间的延长而逐渐下降。结果表
明 NCT D 可明显抑制 HL-60 细胞 DNA 的合成,
并呈现时间、剂量依赖性。
2 2 NCT D 对 H L-60 细胞周期的影响: 根据3H-
TdR掺入实验结果, 选取不同浓度 NCTD ( 0、8、
16、32、64、128 mol/ L ) 作用后,测定 HL-60 细胞
周期的变化。结果显示, NCT D 作用 12 h 后 HL-
60 细胞出现 S 期的阻滞, 并呈现剂量依赖性趋势。
128 mol/ L N CT D 可使约 80% 细胞阻滞于 S 期,
同时观察到 G 2 / M 期细胞的累积, 但缺乏剂量依赖
趋势,在 32 mol/ L (低于 IC50 ) 下 G 2 / M 期阻滞最
为明显 (图 2、表 1) ,药物浓度升高后 G 2 / M 期细胞
比例反而下降。说明 NCTD 作用于 HL-60 后, 细
胞不能有效地进行 DNA 的复制以完成 S 期,导致
S 期阻滞;同时细胞的 G 2 / M 进程也受到干扰。
图 2 不同浓度 NCTD 作用 12 h后 HL-60 细胞周期分布
Fig. 2 Distribution of cell cycle for HL-60 cells af ter treated with various concentrations of NCTD for 12 h
表 1 不同浓度 NCTD作用 12 h后 HL-60
细胞周期分布 ( x s, n= 3)
Table 1 Distribution of cell cycle for HL-60 cells
af ter treated with various concentrations
of NCTD for 12 h ( x s, n= 3)
组别 C/
( mol L- 1 )
细胞周期/ %
G1 S G2/ M
对照 0 47 0 2 3 44 0 4 3 8 0 0 5
NCT D 8 46 0 1 9 43 0 2 9 10 0 0 7
16 37 0 3 2 49 0 3 1 13 0 1 1
32 4 0 0 2 61 0 3 2 34 0 2 3*
64 3 0 0 1 69 0 4 3 26 0 2 4
128 11 0 0 6 84 0 4 8* * 4 0 0 9
与对照组比较: * P< 0 05 * * P< 0 01
* P< 0 05 * * P < 0 01 vs cont rol group
2 3 NCT D 对肿瘤细胞周期调节蛋白的影响: 鉴
于 NCT D ( 32 mol/ L ) 作用后 HL-60 细胞出现
G2 / M 期阻滞的现象, 本实验检测了 32 mol/ L
NCT D 对 G2 / M 期调控蛋白表达的影响。Wester n
blo tt ing结果显示 , NCTD可下调G2 / M期调控蛋
白 Cdc25c、Cdk1 和 CyclinB1 的蛋白表达水平, 随
着作用时间的延长下调作用更加明显(图 3)。
3 讨论
本研究中, 3H-T dR 实验结果证实, NCT D可以
抑制 HL-60 细胞 DNA 的复制。对照组在 12 h 时
间点的 3H-T dR 掺入量最大,说明此时细胞增殖状
态最佳,随着培养时间延长细胞增殖活力下降, 其
3
H-TdR 掺入量也下降。NCT D 作用后, 在各种剂
量及各个时间点下, 其 3H- T dR 掺入量均明显下
降,表明 NCT D 可有效地抑制 HL-60 细胞 DNA
的复制,并呈现时间、剂量依赖性。这一结果与前期
研究结果相吻合 [ 10] ,即 NCTD确实因为对 DNA 复
制起始蛋白 Cdc6 的降解而抑制了 DNA 的复制。
与 3H-TdR 实验相符的是细胞周期结果, NCTD 作
用 12 h 后,细胞出现 S 期的阻滞,且其阻滞效果呈
现剂量依赖性, 最高药物浓度下可使 80% 以上的
细胞阻滞于 S 期。综合上述两项实验结果可以认
为,在 NCTD 作用下 DNA 复制从起始阶段就受到
抑制, 使细胞不能完成 DNA 的复制而停滞于 S 期。
实验中还观察到 NCT D 作用于 HL-60 后, 出
现 G 2 / M 期细胞累积的现象, Western blo tt ing 结
果显示 NCTD 可下调 Cdc25c、Cdk1 和 CylinB1 的
蛋白水平。Cdk1/ cyclinB 复合物是调控细胞进入
有丝分裂的关键激酶, Cdc25c 可去除 Cdk1 和
T hr 14 和 Tyr 15 的抑制性磷酸化, 从而激活 Cdk1。
在本实验体系中 N CT D 一方面下调 Cdk1、Cy-
clinB1 的蛋白水平,另一方面又下调 Cdc25c间接抑
制 Cdk1 的活化, 从而从整体上抑制了 Cdk1/ Cy-
clinB1 复合物的激酶活性, 使细胞阻滞于有丝分裂
前期。但 Chen等[ 7] 的 研究发现 NCT D作用于
1317中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
图 3 NCTD 对 HL-60 细胞 G2 /M 期调控蛋白表达的影响 ( x s, n= 3)
Fig. 3 G2 /M Regulation proteins in HL-60 cell after treatment with NCTD ( x s, n= 3)
HepG2、Hep3B 后, Cdk1 表达水平不受影响,
Cdc25c 表达反而升高,而且 Cdk1/ CyclinB1 复合物
的激酶活性也增强。之所以会出现这种差异, 首先
与实验体系所采用的不同细胞有关,其次也暗示了
Cdk1和 Cdc25c 并不是 NCT D的直接作用靶点。
总结上述结果, NCTD 作用于 HL-60 细胞后,
DNA 的复制被有效抑制, 使细胞不能完成 DNA 复
制阻滞于 S 期,同时启动检测点机制使细胞阻滞于
有丝分裂前期。但在药物高剂量作用下, NCTD 主
要是表现为抑制肿瘤细胞 DNA 的复制, 使细胞的
S 周期进程受阻。
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