全 文 ：含羞草碱可与脱氧胸苷三磷酸在 DNA
复制点直接竞争
刘 力　王树蕙
(中国医学科学院基础医学研究所 , 中国协和医科大学基础医学院病毒组 ,北京 100005)
摘要　含羞草碱 , 一种植物氨基酸 , 是一种可逆的细胞周期抑制物.生物化学研究发现 ,含
羞草碱可以在靠近G1/S 交界的多种水平上起作用.用微注射方法证实 ,含羞草碱对未孵化
非洲爪蟾卵核糖体DNA(rDNA)的复制有可逆性抑制作用.此外 , 含羞草碱与胸腺嘧啶化学结
构的高度相似性说明 ,含羞草碱很有可能在 DNA复制过程中直接与胸腺嘧啶进行竞争以阻止
DNA复制起始及(或)链延伸.这一结果对进一步确立含羞草碱的作用机制具有重要意义.
关键词　含羞草碱　rDNA　DNA 复制　胸腺嘧啶
最近含羞草碱(mimosine)已被定性为一种可逆性细胞周期抑制物 ,作用于哺乳动物细胞的
G1/S阶段[ 1 ,2] .实验数据已经显示 ,含羞草碱可以通过抑制脱氧核糖核酸的代谢影响 DNA复
制的起始及链延长的过程[ 3～ 5] .Lin等人用光联的技术发现一个 50 ku大小的蛋白质在体内
及体外条件下可特定地与3H标记的含羞草碱反应[ 6] , 并且发现这个 50 ku的蛋白质与兔线粒
体丝氨酸的羟甲基转移酶(mSHMT)有高度同源性.这种酶作用于胸腺嘧啶脱氧核苷的合成
过程 , 而且 , 含羞草碱可以与吡哆醛磷酸竞争 mSHMT 的酶活性位点.然而 , 体外功能性分
析却发现含羞草碱并没有抑制 mSHMT 的活性[ 6] .因此 , 目前仍然缺少一种结论性证据支持
脱氧核糖核酸库的假说.
在研究DNA复制中 , 非洲爪蟾卵是一种很理想的模型系统.将质粒 DNA微注射到蟾卵
后 , 人们发现质粒 DNA的复制是跟随蟾卵细胞复制周期而进行的:在一个细胞周期中每个质
粒DNA只复制一次.哺乳类动物的 DNA复制起始于特定的染色体基因座 , 然而在蟾卵中多
数的 DNA序列都可以作为 DNA复制的起始点.Mahbubani等人[ 7]曾报道说 ,用无细胞爪蟾卵
提取液做试验发现 rDNA有多个潜在的 DNA复制起始点.为了测定含羞草碱对 rDNA复制的
体内效应 , 我们将 rDNA微注射到未孵化爪蟾卵中进行观察.结果显示 ,含羞草碱对 rDNA的
复制也有可逆性抑制作用 , 并且含羞草碱与胸腺嘧啶的化学结构的相似性显示它们很有可能
相互间在 DNA复制的起始点或(和)链的延伸过程中进行竞争.这一研究对进一步探讨含羞
草碱在细胞周期上的作用位点及机制具有重要意义.
1　材料与方法
　　(1)未孵化爪蟾卵的微注射及含羞草碱实验.未孵化卵是在向背侧的淋巴囊注射 600IU
的人绒毛膜性腺激素 12 ～ 18 h后从非洲爪蟾取得的.卵是排在OR-2培养基中(82.5 mmol/L Na-
Cl , 2.5 mmol/L KCl , 1.0 mmol/L CaCl2 , 1.0 mmol/L MgCl2 , 1.0 mmol/L Na2HPO4 , 5.0 mmol/L
HEPES , pH=7.8)并需在1 h内使用.注射激素前先用2%的半胱氨酸(pH=7.5 ～ 8.0)去除蟾
卵的胶冻.在每一个实验阶段需在 30 min 内注射 20 ～ 30个具有清晰动物极帽蟾卵 , 注射总
量为每卵 50 nL ,内含有 3.5 ng的 pXlr101A质粒 rDNA.注射的蟾卵被放在 400 μmol/L 的含羞
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草碱或没有任何药物的OR-2培养基中 , 在 23℃下分别培养 1 ,2 , 3和 4 h.在培养过程中 ,一
些颜色完全变白并胀大的蟾卵被认为坏死蟾卵.存活的蟾卵可以用微离心管收集并存放在-
20 ℃.为了试验含羞草碱的可逆性抑制效应 , 将在 400μmol/L 含羞草碱溶液中已培养了4 h
的注射卵转移到(0.5×)OR-2的培养基中再培养 1 h , 最后对存活的蟾卵进行收集.
(2)DNA的提取.注射卵被放在每卵 30 μL 的溶液中进行同质化 , 这一溶液含有 30
mmol/L Tris-HCl , pH=7.4 , 20 mmol/L EDTA , 1%SDS 和0.75 mg/mL蛋白酶K.样品用酚/氯
仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提 2次 , 得到的 DNA再用乙醇在-20℃中过夜沉淀.沉淀后用每卵
1 μL的 TE(10 mmol/L Tris-HCl , pH=8.0 , 1 mmol/L EDTA)去溶解 DNA.
(3)琼脂糖凝胶电泳及Southern印迹分析.DNA 在(2/3×)TPE缓冲液中用 1%的琼脂糖
凝胶电泳分离 3 ～ 4 h.每个孔载有 10个卵的 DNA的样品.碱性处理后 , 按照 Southern 的方
法DNA被转移到硝酸纤维素滤膜上[ 8] .滤膜与随机引物洋地黄毒苷标记的脱氧尿苷三磷酸
(Dig-dUTP)的 rDNA探针进行杂化.对洋地黄毒苷标记探针的测定是按照Genius非射线标记
及测试诊断盒的说明所进行的 (Boehringer Mannheim Corporation).
2　结果与讨论
2.1　含羞草碱在非洲爪蟾卵内对 rDNA质粒有可逆性作用
非洲爪蟾卵可以允许多种微注射 DNA分子在染色体外进行复制.研究已经显示质粒
pXlr101A含有单一拷贝的爪蟾 rDNA转录重复单位(图 1)[ 9] ,具有多个 DNA 复制的起始点.
可是 , 对于每一次DNA复制 , 只有一个单一的和随机的点被选用[ 7] .质粒pXlr101A的复制是
随着蟾卵的细胞周期而进行的.在一个细胞周期中质粒 DNA只复制一次.基于这些结果我
们力图运用微注射的方法来测定是否含羞草碱在体内对 rDNA复制也有可逆性抑制效应 , 并
以此为模型来探讨含羞草碱在 DNA复制中的普遍性作用机制.
为此在每个实验点收集 10个存活卵经同质化后提取其总DNA ,在有或无含羞草碱培养的
条件下 ,观察质粒 rDNA的复制情况.如果含羞草碱对质粒 rDNA 的复制有可逆性抑制作用 ,
那么随着培养时间的延长质粒 rDNA聚积量将呈递减状态.当将其重新放入无含羞草碱的培
养液中 ,受抑制的状态就会被解除.图 2显示含羞草碱对 rDNA的复制有可逆性抑制效应.
在缺少含羞草碱的情况下 , rDNA的复制随着培养时间的延长而趋于增加(图 2 ,比较 1 , 3 ,5 , 7
行).可是 ,经过 400μmol/L 含羞草碱培养 2 h后 , rDNA的复制被明显地抑制住了 ,这种抑制
作用使得 rDNA的复制从第 2 小时起每个时间点较前一个时间点的复制量至少递减 50%～
60%(图 2 ,比较2 ,4 ,6 ,8行).为了证明含羞草碱的作用效应是可逆性的 , 我们将已经在含羞
草碱中培养了 4 h的注射卵释放到 0.5×OR-2培养基中.结果发现解除含羞草碱对 rDNA复
制的抑制是发生在放入OR-2培养液后 1 h内(图 2 ,比较8和 9行).这说明含羞草碱对于蟾
卵 rDNA的复制确实是一种可逆性抑制剂.
2.2　含羞草碱对 DNA复制可逆性抑制作用原理
那么 ,这种可逆性抑制到底是由什么机制所引起的 ?在几个已提出的解释模型中 ,很多人
倾向于含羞草碱是通过影响脱氧核糖核酸代谢-胸苷生物合成通路来抑制 DNA 复制的[ 3 , 6] .
遗憾的是目前只有间接的体内实验数据支持这一假说 ,而直接的体外实验数据却与这一模型
相抵触[ 6] .因此 ,含羞草碱真正的作用机制仍然是一个迷.由于含羞草碱对 DNA 复制的抑制
效应是可逆的 ,并且这种抑制效应是作用于G1/S交界阶段并与 DNA复制的起始以及链的延伸
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图 1　非洲爪蟾卵 rDNA 以及质粒 pXlr101A 的结构
用微注射的方法将质粒的DNA注射到未孵化蟾卵中.每个并列重复单位是由一个 7.7 kb的 rDNA转录单位
以及一个 3.8 kb的间隔区所组成.E和 R分别代表 EcoRⅠ和 HindⅢ限制内切酶点.质粒 pXlr101A含有一个
完整的 pBR322(4.3 kb)的 HindⅢ切割片段
图 2　DNA杂化分析含羞草碱对 pXlr101A质粒
DNA复制的可逆性抑制
第 1 , 3 ,5 , 7行代表每组 10个未注射卵在没有含羞草碱的OR-
2溶液中分别培养 1 ,2 , 3 , 4 h后从中所提DNA;第 2 , 4 , 6 , 8行
代表每组 10个未注射卵在有含羞草碱的OR-2溶液中分别培
养 1 ,2 , 3 ,4 h后从中所提 DNA;第 9行代表经过 4 h含羞草碱
培养后将注射卵再放到没有含羞草碱的 OR-2中 1 h后提取
的 DNA.Ⅰ =超螺旋 DNA , Ⅱ =环状 DNA
有关系 , 一种简单的模型可以解释这些现象就
是含羞草碱与脱氧核糖核酸三磷酸在 DNA 复
制点进行竞争 ,从而抑制 DNA的复制.
为此 ,我们将含羞草碱的化学结构与 4
种脱氧核苷三磷酸(dNTP)的氮碱基团进行比
较 , 结果发现含羞草碱与脱氧胸苷三磷酸
(dTTP)的胸腺嘧啶团有极其相似的结构 ,并
且它们都可以在 DNA模板上与嘌呤中的腺嘌
呤形成完美的氢键(图 3).由于氧的电负性
比氮的要高 ,所以含羞草碱杂环 3 号位的羟
基中的氧对氢的电子的吸引力强于胸腺嘧啶
3号位上的氮对氢的吸引力 , 从而使含羞草
碱芳香环 3号位的羟基上氢所具有的正电性
大于胸腺嘧啶 3号位上的氢原子 , 进而导致
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含羞草碱与腺嘌呤间所形成的氢键强于胸腺嘧啶与腺嘌呤间所形成的氢键.因此 ,含羞草碱
在DNA复制的起始以及链的延伸过程中将是 dTTP 的胸腺嘧啶团强有力的竞争者.
图 3　含羞草碱可以与胸腺嘧啶在 DNA复制过程中竞争
含羞草碱与胸腺嘧啶化学结构的高度相似性或许是含羞草碱对DNA复制有可逆性抑制作用的原因
当把在含羞草碱中培养的蟾卵释放到OR-2培养基中 ,DNA复制恢复了 ,这种可逆性效应
是与含羞草碱从细胞内到细胞外的扩散直接相关的.这是由于含羞草碱沿着它的浓度梯度不
断地从细胞内到细胞外流动 ,而细胞内合成 dNTP 的机器却在不停地运转 ,从而导致细胞内
dTTP的局部浓度逐渐地高于含羞草碱 ,最终通过竞争解除含羞草碱对 DNA复制的抑制作用.
总之 ,用微注射未孵化爪蟾卵的方法我们首次证实含羞草碱可以在体内对爪蟾 rDNA的
复制进行可逆性的抑制.我们认为这种可逆性抑制作用主要是由于含羞草碱与胸腺嘧啶之间
竞争性地与腺嘌呤在 DNA复制点形成氢键所至.这一结果对揭示含羞草碱的作用机制及研
究细胞周期的控制都提供了有价值的信息.
致谢　非常感谢沈 教授对本文给予的指导 ,也非常感谢依阿华州立大学动物与遗传系的 Dr.Benbow 、王
庸和方晶等人多方面的帮助.
参　考　文　献
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