全 文 ：地方。从虚拟评价结果来看, 黄酮苷类化合物的结
果更接近于文献报道,表明药物在体内的代谢是导致
虚拟评价存在差异的主要因素,提示在可能的情况下
尽量考虑代谢的因素。尽管虚拟评价预测出的其他
作用还需要进一步的研究和探索,虚拟评价的技术对
中药复杂作用系统的研究显示了较大的实用性。
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苦荞麦黄酮对人食管癌细胞 EC9706 增殖的影响
闫斐艳,崔晓东, 李玉英,王转花*
(山西大学生物技术研究所 化学生物学和分子工程教育部重点实验室, 山西 太原
030006)
摘
要:目的
研究苦荞麦黄酮在体外对 EC9706 细胞增殖的影响。方法
M TT 法观察苦荞麦黄酮对 EC9706 细
胞的毒性,荧光染色法观察细胞核的改变, 流式细胞术观察细胞周期和细胞内活性氧水平, Western blott ing 分析凋
亡蛋白表达。结果
苦荞麦黄酮明显抑制 EC9706 细胞的增殖, 其抑制率与药物浓度和作用时间呈正相关。经
DAPI 染色,电镜观察细胞核,可见多个凋亡小体的形成。流式细胞仪检测发现, 苦荞麦黄酮使细胞发生 G2 / M 期
周期停滞,细胞内活性氧水平明显增加, 且呈浓度依赖效应。Western blot ting 分析表明,苦荞麦黄酮能上调细胞内
的促凋亡蛋白 Bax ,并下调抗凋亡蛋白 Bcl2 的表达量。结论
苦荞麦黄酮对人食管癌细胞株 EC9706 增殖具有
明显的抑制作用,使细胞发生周期阻滞, 并能通过调节活性氧水平及改变凋亡蛋白的表达量诱导其发生凋亡。
关键词:苦荞麦; 黄酮; 人食管癌细胞 EC9706; 细胞增殖
中图分类号: R286
91


文献标识码: A


文章编号: 02532670( 2010) 07114204


苦荞麦 Fagopy r um tatar icum ( L . ) Gaer tn.
属于双子叶蓼科荞麦属作物, 在我国种植广泛,是一
种药食两用植物 [ 1]。本草纲目 记载苦荞麦能够:
!降气宽肠,磨积滞, 清热毒风痛∀。现代研究结果表
明,苦荞麦具有防治心脑血管疾病、糖尿病,抗菌, 抗
炎,抗乙肝表面抗原等作用 [ 2]。近年来,苦荞麦的抗
癌作用也越来越为研究者所关注[ 3]。苦荞麦中含有
丰富的黄酮, 黄酮类化合物的抗肿瘤作用已成为人
们研究的热点之一, 其研究主要表现在对细胞的增
殖抑制、诱导凋亡、阻断周期和调控蛋白表达等方
面[ 4~ 6] 。前期研究初步表明, 苦荞麦黄酮可抑制白
血病细胞株 HL60 的生长并诱导其凋亡[ 7]。本实
验拟研究苦荞麦黄酮在体外对人食管癌 EC9706 细
胞增殖的影响,为新一代抗肿瘤药物的研发提供实
#1142# 中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 20091028





















基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30870525, 30671084) ; 山西省自然科学基金资助项目 ( 2007011077)作者简介:闫斐艳( 1983 ∃ ) ,女,山西临汾人,硕士研究生。研究方向:蛋白质化学与工程。
T el: ( 0351) 7019371
Email: yz2003529@ 163. com
* 通讯作者
王转花
T el: ( 0351) 7019371
Email: Zhw ang@ sxu . edu. cn
验和理论依据。
1
材料
1
1
药品与试剂:苦荞麦 (贵州威黑荞, 山西省农
业科学院农作物品种资源研究所提供) 经乔治军研
究员鉴定。RPMI 1640 培养液 (美国 Hyclone) ; 小
牛血清 (杭州四季青公司) ; M T T ( Sigma 公司) ; 二
甲基亚砜 ( DM SO, 北京夏新生物公司 ) ; DAPI
( Sigma 公司) ; PI 试剂盒、活性氧检测试剂盒 (上海
碧云天生物技术有限公司) ;兔
actin 抗体 (博士
德生物公司) ; 鼠抗 Bcl2 抗体、兔抗 Bax 抗体、兔抗
羊辣根过氧化物酶 ( HRP) 标记二抗 ( Stanta Cruz
公司) ;其余试剂均为分析纯。
1
2
细胞:人食管癌细胞 EC9706 (中国医学科学
院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室
惠赠)。
1
3
主要仪器: HetoHo lten A/ S CO 2细胞培养箱
( Denmark) ; BIORAD 酶联免疫检测仪; Elite ESP
流式细胞仪 ( Coulter ) ; BX ∃ 51 荧光显微镜、U
SPT 倒置显微镜 ( Olympus) ; D ∃ 37520 离心机
( Bio fuge str atos, Osterode) ; Labo Auto clave 高温
灭菌箱 ( SANYO) ; SW ∃ CJ ∃ 1F 超净台 (苏净集
团苏州安泰空气技术有限公司) ; FA1004A 型电子
天平 (上海天平仪器厂)。
2
方法
2
1
苦荞麦黄酮样品制备:苦荞麦黄酮样品制备按
照文献方法 [ 8]进行,提取的黄酮化合物进一步处理
后经 HPLC 分析证明, 其中的主要成分为槲皮素
( 60
12%) 和芦丁 ( 1
65% )。
2
2
细胞培养:人食管癌细胞 EC9706在含体积分
数为 10% ~ 15% 小牛血清的 RPM I 1640的全培养
基中,于 37 % 、5% CO2孵育箱中培养, 细胞呈贴壁
生长, 2~ 3 d 传代 1次。取对数生长期的细胞进行
实验。
2
3
MT T 法检测 EC9706 细胞生长情况: 取处于
对数生长期的 EC9706 细胞,经胰蛋白酶消化后, 调
细胞浓度 1 & 106 / mL, 96 孔细胞培养板每孔接种
100 L 细胞液, 37 % 、5% CO 2过夜培养。加入用
DMSO 溶解 ( DM SO 体积分数 ∋ 0
1% ) 的不同质
量浓度的苦荞麦黄酮 ( 0、10、30、60 g/ mL) 100
L, 设 3个复孔, 分别培养 24、48、72 h 后, 每孔加
入 20 L MTT ( 5 mg/ mL) , 继续培养 4 h。加入
150 L DMSO 孵育 10 m in 溶解, 于酶标免疫测定
仪测定 490 nm 处的吸光度 ( A ) 值, 各组实验重复
3次。计算细胞增殖抑制率。
增殖抑制率= (对照组 A 值- 处理组 A 值 ) /对照组 A
值& 100%
2
4
EC9706 细胞核的形态学观察: EC9706 细胞
在 96 孔板 (每孔细胞浓度为 1 & 106 / mL, 100 L
细胞液) 中经 0
1% DMSO (对照组, 下同) 和终质
量浓度为 30 g / mL 的苦荞麦黄酮处理 48 h 后,收
集细胞,用预冷的磷酸缓冲溶液洗涤后重悬于固定
液 ( 4% 多聚甲醛) 中。10 m in 后, 悬液 1 000 r/
m in 离心,收集沉淀, 用同样缓冲溶液洗涤两次。将
细胞悬液滴到载玻片上,用 0. 1 g/ mL DAPI 染色
5 min,在荧光显微镜下观察细胞核的形态学变化。
2
5
细胞周期的检测:将接种于 6孔细胞培养板中
的 EC9706 细胞无血清培养 36 h,使细胞同步于 G0
期。分别经 0
1% 的 DMSO,终质量浓度为 30、60
g/ mL 的苦荞麦黄酮处理 48 h 后, 收集细胞,制备
成单细胞悬液, 将细胞悬液移入 50 mL 试管中,
1 000 r/ min 离心 6 min, PBS 清洗 3 次, 再离心。
用 70% 乙醇于 4 % 固定。加 RNase A, 37 % 水
浴 30 min, PI 染色,用流式细胞分析仪进行细胞周
期分析,实验平行重复 3次。
2
6
Western blot t ing 分析: 将细胞接种于 6孔细
胞培养板, 经 0
1% DMSO 和苦荞麦黄酮 30 g/
mL 作用 24 h 后, PBS 洗涤 3 次, 加入冷的细胞裂
解液冰上作用 30 min, 刮取细胞于微量离心管中。
4 % , 10 000 r/ m in 离心 15 min 后, 吸取上层澄清
液。紫外分光光度计测定各样品总蛋白浓度,并调
节浓度一致。样品在 12
5% SDSPAGE 上进行电
泳后,转印于硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜经封
闭液 ( 5% 脱脂乳, 0
05% 聚山梨酯 20, pH 7. 6)
封闭 2 h 后, T BST ( 20 mmo l/ L , pH 7. 6) 洗涤 3
次,于第一抗体工作液中孵育 2 h。TBST 洗涤 3
次,第二抗体工作液中孵育 30 min, TBST 洗涤 3
次, DAP 显色液显色, 感光 X 光片后, 显影定影,

act in 作为内参蛋白。
2
7
细胞内活性氧测定: 分别经 0
1% DMSO 和
30、60 g/ mL 苦荞麦黄酮处理细胞 48 h后,离心收
集各组细胞, 用无血清培养基悬浮, 将细胞稀释到
DCFHDA 中, 浓度调节为 1 & 106 / mL。37 % 细
胞培养箱内孵育 20 min, PBS洗涤 3 次。重复 3次
实验,流式细胞仪检测细胞荧光强度 (激发波长为
488 nm,发射波长为 525 nm )。
2
8
统计学分析:采用 SPSS 12
0 软件, 进行统计
分析,组间比较采用 t 检验。
3
结果
#1143#中草药
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第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
3
1
对 EC9706 细胞生长的影响: 结果见图 1, 苦
荞麦黄酮对 EC9706细胞增殖抑制率具有时间和剂
量依赖性。10~ 60 g/ mL 苦荞麦黄酮能明显抑制
EC9706 细胞的增殖,随药物质量浓度的增加, 抑制
作用逐渐增强。60 g/ mL 苦荞麦黄酮体外诱导
EC9706 细胞 24 h 后,抑制率达到 55%。作用 24、
48、72 h 的 IC50值分别为 ( 42
90 ( 1
27)、( 35
07 (
1
72)、( 24
50 ( 1
41) g/ mL。苦荞麦黄酮各组抑
制率与对照组比较, 均呈现显著差异 ( P< 0
05、
0
01)。
图 1
苦荞麦黄酮对 EC9706 细胞的生长抑制作用
F ig. 1
Inhibition of flavonoids in [ WTHX] F. tataricum[ WTHZ]
on growth in EC9706 cells
3
2
EC9706 细胞核的形态学观察:荧光显微镜下
观察, EC9706 细胞经 30 g/ mL 苦荞麦黄酮处理
48 h 后,可见细胞核的形态发生了明显变化, 出现
了凋亡信号,与对照组相比,细胞核出现碎裂, 形状
变得不规则,少量伴有凋亡小体。结果表明, 经苦荞
麦黄酮处理的 EC9706 细胞出现了凋亡信号。结果
见图 2。
3
3
对 EC9706 细胞周期的影响: 结果见图 3。
EC9706 细胞经不同质量浓度的苦荞麦黄酮作用 48
h 后, G0 / G1期的细胞数量逐步下降, S 期细胞数量
无明显变化 , 而G2 / M期细胞数量明显上升。6 0
图 2
苦荞麦黄酮作用于 EC9706 细胞 48 h 后的
荧光显微镜观察
Fig. 2
Fluorescent micrographs of EC9706 cells
treated with f lavonoids for 48 h
g/ mL 苦荞麦黄酮处理后, G 0 / G 1期细胞数量由
69
47% 减少为 49
79%, 而 G2 / M 期数量由
7
69% 增加到 21
53%。初步推断苦荞麦黄酮可
使 EC9706 细胞周期阻滞于 G 2 / M 期。
3
4
Western blot t ing 分析: EC9706 细胞经 30
g/ mL 苦荞麦黄酮作用 48 h 后, Western blot t ing
检测结果显示, 抗凋亡蛋白 Bcl2 表达水平明显下
降,促凋亡蛋白 Bax 表达水平上升。初步分析判
断,苦荞麦黄酮抑制肿瘤细胞生长,促使其凋亡与线
粒体上的 Bcl2 家族凋亡蛋白的调控有关。结果见
图 4。
3
5
对 EC9706 细胞内活性氧的影响: 30、60 g/ mL
图 3
苦荞麦黄酮对 EC9706 细胞生长周期的影响
Fig. 3
Effects of flavonoids in [WTHX] F. tataricum[WTHZ] on growth cycle in EC9706 cells
苦荞麦黄酮作用 EC9706 细胞 48 h 后,活性氧的量
升高,峰值明显右移。对照组和苦荞麦黄酮 ( 30、60
g/ mL) 组的荧光强度分别为 ( 28
26 ( 2
16) %、
( 58
25 ( 0
91) %、( 67
77 ( 4
78) %。药物处理组
与对照组比较差异显著 ( P< 0
05)。见图 5。
4
讨论


本实验主要通过食管癌 EC9706 细胞来探讨苦
荞麦黄酮对肿瘤细胞增殖的影响。MT T 法检测结
果表明, 苦荞麦黄酮以浓度和时间依赖方式抑制
EC9706 细胞的增殖, 结果与大多植物来源的黄酮
的作用基本一致。
利用 DAPI 核染色技术, 在荧光显微镜下观察
到了细胞形态的不规则变化及细胞核的碎裂现象,
并同时伴有凋亡小体的出现。本实验同时运用流式
细胞仪分析了苦荞麦黄酮对 EC9706细胞周期及细
胞内活性氧水平的影响, 发现苦荞麦黄酮能诱发
EC9706 细胞在 G2 / M 期出现细胞阻滞效应, 并且
随着质量浓度的增加, 细胞内活性氧的量明显增加,
#1144# 中草药
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第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
这与显微镜下观察凋亡小体的形成结果相一致。
Bcl2 和 Bax 是重要的细胞凋亡调控蛋白, 二
者在体内可形成同源二聚体 Bax/ Bax, 也可形成异
源二聚体 Bax / Bcl2, 但生理作用相反, Bcl2 能抑
制多种因素引起的细胞凋亡,而 Bax 能促进细胞凋
亡, Bax 蛋白高表达可对抗 Bcl2 抑制作用。研究
表明[ 9] , Bcl2 和 Bax 的表达程度及其比例决定细
胞接受凋亡信号后的命运, Bcl2表达量较大时细胞
生存,细胞凋亡减少, 而 Bax 蛋白大量表达时形成
Bax 同源二聚体,加速细胞凋亡。可见抗凋亡蛋白
与促凋亡蛋白的比例在一定程度上决定了细胞是否
发生凋亡。本研究使用 Wester n blot ting 方法分析
了苦荞麦黄酮对凋亡相关蛋白的影响, 苦荞麦黄酮
能够调节相应蛋白的表达,使 Bcl2 表达量明显减
少,而 Bax 表达量增多,二者比例的相对减少导致
了 EC9706 细胞的凋亡。


活性氧是真核细胞有氧呼吸的产物, 是细胞增
殖的重要细胞内信号。已有研究证实, 低微水平的
活性氧升高可促进细胞增殖, 而较高水平的活性氧
则引发细胞凋亡, 更高水平的活性氧则直接导致细
胞坏死。本实验结果表明苦荞麦黄酮对 EC9706 细
胞的增殖具有抑制作用,发现其能在细胞内引发活
性氧的产生, 造成活性氧水平显著升高,并有效诱导
EC9706 细胞发生凋亡。因此, 引发活性氧并诱导
细胞凋亡,这可能是植物多酚化合物发挥抗肿瘤作
用的一个重要机制, 而其中涉及的分子信号机制有
待于进一步深入探讨。
综上所述, 本实验证实苦荞麦黄酮能抑制
EC9706 细胞增殖的同时, 用多种方法证实苦荞麦
黄酮作用后的 EC9706 细胞有典型的凋亡发生, 说
明苦荞麦黄酮可能通过诱导 EC9706细胞凋亡来发
挥其抑制细胞增殖的作用,这一研究结果为进一步
研究苦荞麦黄酮抑制其他肿瘤细胞的增殖提供了一
定的实验依据。
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