全 文 ：把定性评价转化为定量评价, 即用模糊数学对受到
多种因素制约的事物或对象做出一个总体的评
价[ 8]。具体表现为通过精确的数字手段处理模糊的
评价对象, 对蕴藏信息作出比较科学、合理、贴近实
际的量化评价。
从本实验来看,基于模糊数学理论的模糊综合
评价法理论清晰,结果直观,且在评价过程中考察了
各指标对总体效果的综合贡献, 因此认为该法基本
上能客观、公正、科学地评价促透剂的促透效果, 期
望能为促透剂的研究和筛选提供一定的理论依据。
参考文献:
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超高效液相色谱法测定脑外伤患者口服大黄后尿液中蒽醌类成分
王 杨1 ,黄 熙1* ,梁清华1 , 秦 锋1 , 刘昭前2 ,周宏灏2
( 11 中南大学湘雅医院中西医结合研究所 国家中医药管理局脑病重点专科, 湖南 长沙 410008;
21 中南大学临床药理研究所,湖南 长沙 410008)
摘 要:目的 建立超高效液相色谱( UPLC)法同时测定脑外伤患者口服大黄后尿液中蒽醌类成分。方法 Wa-
ter s Acquit y UPLC BEH C18色谱柱( 100 mm @ 21 1 mm, 11 7Lm) ;流动相为甲醇-01 5%醋酸 ( 12B 82) ; 柱温 25 e ;
检测波长 254 nm;体积流量 01 5 mL / min; 进样量 5 LL。结果 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚
的尿中质量浓度分别在 01 198~ 61 333、01 42~ 131 429、01 285~ 91 107、01 386~ 121 321、01 134~ 41 286 Lg/ mL 线性
良好,方法回收率在 971 68% ~ 1081 85% ,日内、日间 RSD均小于 7%。结论 本法精密度好, 回收率高,操作简便、
无毒、重现性好, 可用于大黄蒽醌类成分在脑外伤病人体内的代谢组学研究。
关键词:大黄; 蒽醌;尿液; 超高效液相色谱
中图分类号: R2861 02 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 07-1103-04
大黄始载于5神农本草经6, 已成为使用最频繁
的中药之一。现代研究证明大黄具有泻下清热、抗
菌、抗肿瘤、护肝、松弛肠道、改善血液循环等药理作
用[ 1~ 3]。蒽醌类成分作为大黄药理相关有效活性成
分,被认为大黄质量控制的基础[ 3~ 5] 。国内外已有
学者对健康人血浆, 对健康大鼠血浆及尿液蒽醌类
成分进行测定[ 6~ 8] 。对人服用大黄汤剂后尿液中蒽
醌类成分进行测定尚未见报道。顾建文等[ 9, 10] 报道
大黄通过多靶点药理作用具有抗颅脑损伤的效应,
但颅脑损伤患者服用大黄后吸收的蒽醌类成分未见
报道。本实验室建立了超高效液相色谱法对脑外伤
患者服用大黄汤剂尿液蒽醌类成分的测定,为将吸
收的抗颅脑损伤蒽醌类成分作为大黄质量控制标
准, 为大黄在脑病中代谢学研究,为脑外伤患者的
大黄治疗提供了依据。
1 材料
超高效液相色谱仪:液相色谱仪为Waters Acquity
UPLC system,包括二元泵处理器、样品处理器、柱温
#1103#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 2009- 12-23 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30572339)作者简介:王 杨( 1984 ) ) ,男,住院医师,硕士,主要从事心脑血管病的中西医结合防治基础与临床工作。
T el/ Fax: ( 0731) 84327222 E-m ail : xiaoyan gge02@ 1261 com
* 通讯作者 黄 熙 E- mail : t cm huangx59@ 1631 com
箱、PDA检测器以及 Empower 色谱工作站。
大黄购于中南大学湘雅医院中药房,由西北大
学生物解剖学教研室胡正海教授鉴定为蓼科植物药
用大黄 Rheum of f icinale Baill1 的干燥根及根茎,
样品凭证存于中南大学湘雅医院中药药理实验室。
芦荟大黄素 (批号 09102301)、大黄酸 (批号
09102302)、大黄素(批号 09102303)、大黄酚 (批号
09102304)、大黄素甲醚(批号 09102305)对照品均购
于中国药品生物制品检定所,质量分数均大于 98%;
醋酸、甲醇和乙醚均为 AR级,水为自制三蒸水。
2 方法与结果
21 1 脑外伤患者入选标准: 选择 2009 年 6 月 )
2009年 8月来源于中南大学湘雅医院神经外科病
房重型脑外伤患者 5 名, 纳入标准: ¹ 外伤后昏迷
时间> 6 h 或格拉斯哥评分( GCS 评分) < 8分; º
脑损伤患者均经 CT 扫描或 MRI检查证实; »患者
病情稳定, 意识清楚; ¼无因先天或年幼疾病导致学
习困难造成言语功能缺陷; ½ 未给予系统的认知知
觉训练。排除标准: ¹ 既往有颅脑外伤史及脑血管
意外史或其他颅内占位病史、脑炎史等; º外伤前有
精神病史或吸毒、长期嗜酒史; »外伤时年龄< 16
岁或> 65 岁; ¼ 外伤后昏迷时间< 6 h 或格拉斯哥
评分( GCS 评分) > 8分; ½意识不清; ¾ 精神躁动或
因其他原因而无法配合评定; ¿脑外伤后所致的构
音障碍; À独特临床综合征的纯词聋及纯词哑。本
实验已经中南大学湘雅医院医学伦理委员会批准,
实验前均签署知情同意书。
21 2 色谱条件: Waters Acquity U PLC BEH C18色
谱柱( 100 mm @ 21 1 mm, 11 7 Lm) ; 流动相甲醇-
01 5%醋酸( 12B 82) ;柱温 25 e ;检测波长 254 nm;
体积流量 01 5 mL/ min; 进样量 5 LL。
21 3 对照品溶液的配制:精密称定芦荟大黄素、大
黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量, 以
甲醇溶解定容到 25 mL 量瓶中,摇匀, 即得芦荟大
黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品
溶液质量浓度分别为 01 266、01 075、01 255、01 207、
01 090 mg/ mL。
21 4 大黄煎液的制备:取大黄 30 g ,常水洗净 2 遍
后,水浸 30 min,煎煮至沸,持续 20 min。U PLC 测
定 3次,测得大黄汤剂中芦荟大黄素、大黄酸、大黄
素、大黄酚和大黄素甲醚的质量浓度分别为
( 561 98 ? 21 26)、( 1011 12 ? 31 54)、( 481 93 ? 11 51)、
( 151 50 ? 01 84)、( 271 03 ? 11 61) Lg/ mL。
21 5 给药及尿液采集:患者于实验前 3d不得饮用啤
酒、茶、咖啡及其他饮料;实验前 8h不准进水和食物。
实验当天测定其空腹体质量及心率、脉搏、血压;每位
志愿者在服用汤剂前均采集服药前尿液,作为空白对
照。采集尿液后按 01 5 g/ kg 口服一次大黄汤剂。服
药后收集患者 36 h 尿液。取患者待测尿液 5 mL 置
于灭菌试管中, 4 e 下冷冻离心 15 min,取尿液上清
液迅速入冻干机制成冻干粉- 20 e 冰箱保存。
21 6 患者尿液预处理方法:将制成冻干粉的尿液分
别加入 6 mL 乙醚及 50 LL 1 mmo l/ L HCl, 摇匀 1
m in, 15 000 @ g 离心 15 min。取上清液在常温下挥
发干,加入 100 LL 甲醇, 15 000 @ g 离心 15 min。
取上清液用 01 22 Lm混合纤维素脂微孔滤膜滤过,
即得,取 5 LL 滤液进样。
21 7 干扰性试验:在选定的色谱条件下,空白尿液、
空白尿液加对照品、脑外伤患者口服大黄汤剂后尿
液的色谱图见图 1。结果显示空白尿液加对照品及
脑外伤患者口服大黄汤剂后尿液芦荟大黄素、大黄
酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚分离良好。
1-芦荟大黄素 2-大黄酸 3-大黄素 4-大黄酚 5-大黄素甲醚
1- aloe- emodin 2-rhein 3- emodin
4- chrys ophan ol 5-ph yscion
图 1 空白尿液(A)、空白尿液加入蒽醌类对照品( B)
和含药尿液(C)的 UPLC图
Fig. 1 UPLCChromatograms of blank urine ( A) , blank
urine with anthraquinones refernces substance
(B) , and urine with sample (C)
21 8 标准曲线的绘制: 取 6份 3 mL 人空白尿,加
入不同体积的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚
和大黄素甲醚对照品溶液,使芦荟大黄素在尿中的
质量浓度分别为 01 198、01 396、01 792、11 584、
#1104# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
31 167、61 333 Lg/ mL; 大黄酸的质量浓度分别为
01 42、01 84、11 679、31 358、61 68、131 429 Lg/ mL; 大
黄素的质量浓度分别为 01 285、01 570、11 139、
21 277、41 554、91 107 Lg/ mL; 大黄酚的质量浓度分
别为 01 386、01 771、11 541、31 081、61 100、121 321
Lg/ mL; 大黄素甲醚的质量浓度分别为 01 134、
01 268、01 536、11 072、21 143、41 286 Lg/ mL。按脑外
伤患者尿液样品的处理方法进行处理, 测定。以峰
面积为纵坐标, 质量浓度为横坐标, 绘制标准曲线,
拟合线性方程, 结果见表 1。当信噪比 ( signa-l to-
no ise, S/ N)为 3时确定芦荟大黄素、大黄酸、大黄
素、大黄酚和大黄素甲醚的最低检测限。
21 9 精密度和回收率的测定: 于空白尿液样品中
分别加入低、中、高 3 种质量浓度的芦荟大黄素、大
黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚混合对照品溶
液,按脑外伤患者尿液样品的处理方法进行处理, 记
录峰面积。重复上述实验过程, 5次/ d,使用相同的
表 1 线性范围和回归方程
Table 1 Linear ranges and regression equations
成 分 回归方程 相关系数 线性范围/
(Lg # mL- 1)
芦荟大黄素 Y= 22 961 X + 8881 87 01 998 6 01 198~ 61 333
大黄酸 Y= 19 932 X - 1 4761 7 01 999 9 01 42~ 131 429
大黄素 Y= 20 370 X + 2 6251 1 01 998 4 01 285~ 91 107
大黄酚 Y= 21 760 X - 3 8551 3 01 999 6 01 386~ 121 321
大黄素甲醚 Y= 15 388 X - 1 7431 8 01 996 4 01 134~ 41 286
样品与方法连续测定 5 d。以加入尿中芦荟大黄素、
大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的量为标准
值,实际测得的峰面积比值代入回归方程计算值,计
算值与标准值相比求得回收率和日内精密度,并计
算出相对 标准差 ( r elat ive standar d deviat ion,
RSD)。结果见表 2。
回收率= (计算值/标准值) @ 100%
精密度= (计算值的平均值/加入标准浓度) @ 100%
RSD= (标准差/平均值) @ 100%
表 2 精密度和回收率检测
Table 2 Precision and recovery test
成 分 空白尿液中加入药物量/ (Lg # mL- 1)
日 内
测得量/ (Lg # mL- 1) RSD/ %
日 间
测得量/ ( Lg # mL- 1 ) RSD/ % 回收率/ %
芦荟大黄素 01 198 01 201 41 3 01 221 21 3 1011 68
01 792 01 791 51 1 01 801 31 2 991 95
31 167 31 169 31 6 31 168 21 8 1001 21
大黄酸 01 420 01 461 31 2 01 426 41 4 1081 85
11 679 11 677 21 8 11 681 51 2 991 92
61 680 61 710 41 6 61 920 51 2 1021 21
大黄素 01 285 01 290 21 3 01 299 31 1 1011 75
11 139 11 135 31 8 11 089 51 3 991 76
41 554 41 559 41 9 41 601 41 5 1001 19
大黄酚 01 386 01 388 61 2 01 368 21 4 1001 53
11 541 11 544 31 7 11 533 31 5 1001 26
61 100 51 925 41 4 51 899 41 2 971 68
大黄素甲醚 01 134 01 133 51 4 01 128 41 8 1001 12
01 536 01 559 41 9 01 533 31 9 1041 32
21 143 21 196 21 8 21 161 21 7 1021 54
21 10 样品测定: 收集 5名重型脑外伤病人的 36h
新鲜尿液样品, 预处理后进样测定大黄蒽醌类成分
质量浓度, 结果见表 3。
表 3 口服大黄脑外伤患者尿液中蒽醌类成分测定结果
Table 3 Determination of anthraquinones in urine
from patients with cerebral traumatic injury
after oral rhubarb decoction
样品
编号
芦荟大黄素/
(Lg# mL- 1)
大黄酸/
(Lg# mL - 1 )
大黄素/
(Lg# mL- 1 )
大黄酚/
(Lg# mL- 1 )
大黄素甲醚/
(Lg # mL - 1)
1 01 83 61 65 01 52 11 71 01 37
2 01 49 81 78 01 32 31 22 01 26
3 01 74 71 41 01 41 11 41 01 39
4 01 62 91 15 01 74 01 90 01 36
5 01 87 71 73 01 83 11 37 01 71
3 讨论
大黄用于脑外伤治疗机制逐渐清晰, 但对大黄
进入脑外伤患者体内后的代谢研究并不清楚。蒽醌
类成分作为大黄的主要有效成分,本实验以/生物方
剂分析中医药学0思想作为理论指导基础, 应用
U PLC法分析了脑外伤患者口服大黄汤剂后尿中的
蒽醌类成分的检测, 为蒽醌类成分在脑外伤病人体
内的代谢组学研究奠定了基础[ 11] 。
本实验建立了脑外伤患者尿液中蒽醌类成分的
U PLC方法,本法精密度好,回收率高, 操作简便、无
毒、重现性好。考虑到脑外伤患者同时需接受其他
标准化的治疗,且在生物样品的测定中干扰成分较
多,但由图 1 可知, 运用 UPLC 法对脑外伤患者尿
#1105#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
液中蒽醌类成分检测与尿中其他成分分离良好。本
实验方法适用于脑外伤患者口服大黄汤剂后蒽醌类
成分尿中浓度的测定, 为进一步研究大黄在颅脑损
伤患者尿中蒽醌类药动学, 进一步阐明其在脑外伤
患者体内的代谢情况, 为将吸收的抗颅脑损伤蒽醌
作为大黄质量控制标准奠定了基础。
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大孔吸附树脂纯化红茶中茶黄素的研究
贾振宝, 陈文伟,关荣发,黄光荣, 蒋家新*
(中国计量学院生命科学学院, 浙江 杭州 310018)
摘 要: 目的 研究大孔吸附树脂纯化红茶中茶黄素的工艺。方法 通过静态吸附实验比较不同树脂对茶黄素的
吸附和解吸能力,考察 H PD-300 树脂对茶黄素的吸附性质, 比较不同溶液的动态解吸效果。结果 H PD-300 树脂
具有较高的吸附和解吸能力, 在25 e 和 45 e 下 H PD-300 树脂对茶黄素的吸附等温线符合 F reundlich 方程。经过
动态吸附解吸后茶黄素由 181 4%提高到 671 2% , 回收率达到 731 7%。结论 H PD-300 树脂对茶黄素具有良好的
分离能力,为茶黄素的大规模制备提供了科学参考。
关键词:茶黄素; 大孔吸附树脂;纯化
中图分类号: R2841 2; R2861 02 文献标识码: B 文章编号: 0253-2670( 2010) 07-1106-04
茶黄素是红茶发酵过程中形成的一类具有苯骈
草酚酮结构特征, 易溶于醋酸乙酯的橙黄色物质。
茶黄素在抗氧化、抗癌、改善和治疗心脑血管疾病等
方面具有的重要生理功能, 在某些方面甚至强于儿
茶素,其在医药领域有着广泛的应用前景 [ 1]。目前
茶黄素的分离方法主要有 Sephadex LH-20凝胶柱
色谱法和高速逆流色谱法, 但上述两种方法处理量
小、成本高,不适合工业化生产应用[ 2, 3]。大孔吸附
树脂是一种具有大孔结构的高分子材料, 具有吸附
容量大、吸附速度快、选择性好、再生处理简单、使用
成本低等优点, 特别适合大批量样品的分离制
备[ 4, 5] 。因此本实验对茶黄素的大孔吸附树脂纯化
工艺进行研究。
1 仪器与材料
UV ) 2501PC 紫外-可见分光光度计(日本岛津
公司) ; ZHWY ) 110X50 水浴摇床(上海智城分析
仪器制造有限公司) ; RE ) 52A旋转蒸发仪(上海亚
荣生化仪器厂)。
红碎茶购于杭州福海堂茶业有限公司, 经浙江
省农业科学院陈文烜副研究员鉴定为红茶 Camel-
#1106# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 2009- 10-15 基金项目:杭州市科技发展计划项目( 20062413B25)作者简介:贾振宝 ( 1976 ) ) ,男,山东莱阳人,讲师,博士,主要从事天然产物化学研究工作。
T el: ( 0571) 87676258 E-mail: zhenbaojia@ cjlu1 edu1 cn
* 通讯作者 蒋家新 T el: ( 0571) 86836007 E- mail : jjx@ cj lu. edu . cn