全 文 ：性。这也与目前对阿霉素心脏毒性机制的认识
相符。
理想的心脏保护剂应该在减轻阿霉素心脏毒性
的同时 ,并不削弱后者的抗肿瘤活性。为此对上述
化合物的抗肿瘤活性进行了测试。实验表明 ,只有
异甘草素在测试浓度范围内能抑制肿瘤细胞生长。
考虑到此前在心肌细胞 H9c2 上进行测试的结果 ,
推测异甘草素的细胞毒性并无选择性[ 16 ] 。有趣的
是 ,芹糖基甘草苷和芹糖基异甘草苷对肿瘤细胞的
生长没有任何影响 ,也不显示心肌细胞的保护效果 ,
却在高浓度时拮抗阿霉素的抗肿瘤作用。从理论上
来说 ,阿霉素是通过抑制 DNA 和 RNA 合成发挥抗
肿瘤作用的 ,因此推测上述化合物的拮抗效应可能与
阻碍此过程有关 ,其确切机制也有待进一步研究。
综上所述 ,清除 O -·2 的活性并不是甘草黄酮发
挥心肌保护效应的前提 ,但拥有较强自由基清除能
力的查耳酮较二氢黄酮显示更强的心肌细胞保护作
用。对这两种黄酮来说 ,如果 A 环被芹糖2葡萄糖
取代 ,不但会失去心肌细胞保护活性 ,而且有可能拮
抗阿霉素的抗肿瘤作用。这说明甘草黄酮化合物在
化学结构上的微小差异会对活性造成重大影响 ,理想
的心脏保护剂必须在心肌保护和抗肿瘤两方面都满
足要求 ,因此结构优化问题更具挑战性。研究结果还
提示 ,可通过工艺措施改变黄酮类化合物的类型的比
例 ,从而使甘草提取物发挥最佳的减毒增效作用。
参考文献 :
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茶多酚对 H2 O2诱导 PC12 细胞损伤的保护作用
邓凤君 , 徐江平 ,杨迎暴
①
,李茹冰 ,周 　丹
(南方医科大学药学院 药理学系 ,广东 广州 　510515)
摘 　要 :目的 　研究茶多酚 (tea polyphenols , TP) 对 H2 O2所致大鼠嗜铬细胞 PC12 细胞损伤的保护作用。方法
PC12 细胞用 TP 及 H2 O2处理 ,M T T 法观察细胞活力 ,乳酸脱氢酶 (LD H) 法检测细胞膜通透性及完整性 ,流式
细胞术测定细胞周期分布 ,BrdU 免疫荧光法检测细胞周期相 S 期 DNA 合成。结果 　500μmol/ L H2 O2 作用
PC12 细胞 2 h ,细胞出现明显损伤 ,细胞活力下降 ,培养上清液中 LD H 量增加 ,DNA 合成减少 ;5、10、20μmol/ L
TP 预处理可有效提高细胞存活率 ,减少 LD H 渗漏 ,提高 S 期 DNA 合成。结论 　TP 对 H2 O2所致的 PC12 细胞
损伤有保护作用。
关键词 :茶多酚 ; PC12 细胞 ; H2 O2 ; 乳酸脱氢酶 (LD H)
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 06 - 0945 - 05
·549·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
①收稿日期 :2009211212　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :邓凤君 (1973 —) ,女 ,湖南益阳市人 ,博士 ,讲师 ,主要从事神经药理学研究工作。
Tel : (020) 61648235 　E2mail : hhdsf @tom. com 　329746828 @qq. com3 通讯作者　杨迎暴　Tel : (020) 62789417 　E2mail : yangyb @fimmu. com
　　茶多酚 ( tea polyp henols , TP) 是从绿茶中提
取的主要活性成分之一 ,是一种抗氧化剂 ,有显著的
抗氧化、抗炎、抗癌等作用[1～4 ] 。实验表明 TP 可经
消化道吸收 ,在体内分布非常广泛 ,可进入全身各种
组织 ,包括脑、脊髓等[5～7 ] ,能透过血脑屏障 ,清除自
由基 ,提高 Aβ损伤的神经细胞的存活率 ,维持细胞
内线粒体功能和结构的完整 ,保护脑细胞免受神经
毒素损伤[7 ] 。本实验采用 H2 O2 诱导 PC12 细胞损
伤作为体外模型 ,从细胞线粒体、膜通透性、细胞周
期、DNA 增殖 4 个方面研究了 TP 对 H2 O2诱导的
PC12 细胞损伤的保护作用 ,为 TP 应用于神经损伤
性疾病提供实验依据。
1 　材料与方法
111 　主要仪器与试剂 :酶标仪 ( Model 680 , Bio2
RAD ,美国) ,流式细胞仪 ( FACSCalibur , Becton2
Dickinson , San Jose , CA , 美国) ,倒置相差显微镜
( XDS —1B ,Olymp us ,日本) ,奥林巴斯倒置荧光显
微镜 (CL MS FV300 ,日本) 。TP (质量分数 98 % ,
江西绿康天然产物有限责任公司) , H2 O2 (汕头市光
华化学厂) 。高糖 DM EM 培养基 ( Gibco 公司 ,美
国) ,胎牛血清 ( FBS ;杭州四季青生物公司) 。M T T
(Sigma2Aldrich ,美国) ,二甲基亚砜 (DMSO ; UN I2
CH EM 公司) ,乳酸脱氢酶 (LD H) 试剂盒 (南京建
成生物工程研究所) ,碘化丙啶 (Sigma2Aldrich) ,核
糖核酸酶 ( RNase A ; Sigma2Aldrich) ,52溴脱氧尿
嘧啶核苷 (BrdU ; Sigma2aldrich) ,鼠抗 BrdU 单克
隆抗体 ( Sigma2aldrich) ,山羊抗小鼠 Ig G/ TRITC
(北京中杉金桥生物技术有限公司) ,山羊血清
(BSA ,广州斯佳生物科技有限公司) 。
112 　细胞培养和处理 : PC12 细胞购自中国科学院
上海细胞生物学研究所细胞库 ,源于大鼠肾上腺嗜
铬细胞。细胞 2 ×105 / mL 接种于 50 mL 培养瓶
中 ,含体积分数 10 % 胎牛血清、100 U/ mL 青霉素、
100 μg/ mL 链霉素的 DM EM 高糖培养基 , 置
37 ℃、5 % CO2饱和湿度的恒温培养箱内常规培养 ,
24 h 换培养液 1 次 ,48 h 约 80 % 满瓶时传代。
取对数生长期 PC12 细胞 ,以每孔 2 ×105 / mL
分别接种在 96 孔板或 6 孔板中 ,于 37 ℃、5 % CO2
培养箱中进行孵育 ,24 h 内细胞达到 80 %～90 %
融合后 ,用含体积分数 0101 % FBS 的 DM EM 孵育
细胞 24 h ,使细胞同步化。TP (M T T 实验中终浓
度为 215～30μmol/ L ,其他实验中终浓度为 5～20
μmol/ L) 预处理细胞 1 h ,加入 H2 O2 (终浓度 500
μmol/ L) 共同孵育 2 h。
113 　H2 O2 损伤 PC12 细胞模型的建立 :用 M T T
实验确立 PC12 细胞损伤模型。取对数生长期细
胞 ,如 112 所述接种、孵育、同步化。加入 H2 O2 (终
浓度 100～600μmol/ L) 孵育 2 h ,对照组加入等量
的培养液 ,每个浓度及对照组均设 6 个平行孔。吸
弃培养液 ,加终浓度 1 g/ L M T T 液 ,孵育 4 h ,吸弃
上清后每孔加 DMSO 150μL ,平板震荡仪轻轻震荡
5 min ,在 570 nm 酶标仪测定吸光度 ( A) 值。细胞
存活率按公式计算 :细胞存活率 = A 570 (处理组) /
A570 (对照组) ×100 %。
114 　PC12 细胞活力的测定 :取对数生长期细胞 ,
如 112 所述接种、孵育、同步化。加入 TP 使终浓度
为 215、5、10、20、30μmol/ L 预孵育 1 h ,再加终浓
度 500μmol/ L H2 O2 共同孵育 2 h ,对照组加入等
量的培养液 ,每个浓度及对照组均设 6 个平行孔。
按照 113 方法测定细胞的 A 值。各组 A 值和对照
组 (即没有加入 TP 和 H2 O2 组) A 值的比值进行
统计分析。
115 　细胞外 LD H 水平的检测 :按照 LD H 试剂盒
方法检测。取对数生长期细胞 ,如 112 所述接种、孵
育、同步化。加入 TP 使终浓度 5、10、20 μmol/ L
预孵育 1 h ,再加终浓度 500μmol/ L H2 O2 共同孵
育 2 h ,对照组加入等量的培养液 ,每个浓度及对照
组均设 6 个平行孔。收集细胞培养液 ,根据试剂盒
说明检测细胞外 LD H 水平。
116 　流式细胞术测定细胞周期 : 细胞用 TP 和
H2 O2处理后 ,分别收集细胞 , 70 % 冷乙醇固定过
夜。加终质量浓度 1 mg/ mL RNase A 200 μL ,
37 ℃孵育 30 min ,避光加终质量浓度 50μg/ mL
碘化丙啶染液 200μL ,室温放置 30 min ,用流式细
胞仪检测细胞周期相分布 ,用 ModFit L T 分析软件
(version 2. 0 Becton —Dickinson) 对 DNA 细胞周
期拟合分析 ,计算出 DNA 组方图各时相分布百分
比 ,以增殖指数 ( PI) 表示细胞增殖率 , PI = ( S +
G2 / M) / ( G0 / G1 + S + G2 / M) ×100 %[9 ] 。
117 　BrdU 法测定细胞 S 期 DNA 合成 :将对数生
长期 PC12 细胞以 2 ×105 / mL 接种于内有盖玻片
的 6 孔培养板 ,如 112 所述孵育、同步化。用 TP 和
H2 O2处理后 ,吸弃上清液 ,每孔加入 10μmol/ L Br2
dU 液 1 mL ,孵育 24 h [19 ] 。移除中介液 ,每孔加入
4 % 冷多聚甲醛 1 mL ,固定 20 min ,012 % Triton ×
100 室温透化 20 min ,2 mol/ L HCl 变性 30 min ,
5 % 正常山羊血清室温封闭 1 h ,丢液不洗 ,加鼠抗
BrdU 单克隆抗体 (1 ∶100) 滴于盖玻片上覆盖整
·649· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
个玻片 ,放在湿盒里 4 ℃过夜 , PBS 洗后加山羊抗
小鼠 Ig G/ TRI TC (1 ∶100) 覆盖整个玻片 ,室温放
置 60 min ,PBS 洗后 80 % 甘油封片 ,倒置荧光显微
镜观察 BrdU 阳性标记细胞。取每张玻片中互不重
叠的 7 个视野 ,用 IPP 软件 ( Image Pro Plus , 6. 0)
测定平均吸光度值。
118 　统计学方法 :所有实验数据以 x ±s 表示 ,采
用 SPSS 1310 软件完成统计处理 ,数据分析采用单
因素方差分析 (One2way ANOVA) ,各组之间多重
比较采用 L SD 或 Dunnett′s 多重比较法。
2 　结果
211 　H2 O2对 PC12 细胞活力影响 :由图 1 可见 ,对
照组细胞体积饱满 ,而损伤组 PC12 细胞体积明显
缩小 ,突起消失 ,表面变光滑 ,细胞间隙增大 ,出现明
显损伤形态。损伤程度以 600μmol/ L 最严重。由
图 2 数据统计分析显示 , H2 O2 孵育 2 h 能损伤
PC 1 2细胞 ,造成细胞活力下降 ,与对照组相比 ,
图 1 　H2 O2诱导 PC12 细胞形态学改变
Fig. 1 　Morphological changes of H2 O22induced PC12 cells
与对照组比较 : 3 3 P < 01013 3 P < 01 01 vs cont rol group
图 2 　H2 O2诱导 PC12 细胞活力改变 ( x ±s , n = 6)
Fig. 2 　Cellular viability changes of H2 O22induced
PC12 cells ( x ±s , n = 6)
100～300μmol/ L 浓度能降低细胞活力 ,但没有统
计学意义 ,400～600μmol/ L 浓度能降低细胞活力 ,
且具有显著统计学意义 ( P < 0101) 。
212 　TP 对受损 PC12 细胞活力的影响 : TP 10、
20、30μmol/ L 浓度能明显改善 500μmol/ L H2 O2
所致的 PC12 细胞损伤 ,能显著增加受损细胞的活
力 ( P < 0105) 。见图 3。
与对照组比较 : # # P < 0101 ; 与 H2O2组比较 : 3 P < 01 05
# # P < 0101 vs cont rol group ; 3 P < 01 05 vs H2O2 group
图 3 　TP 对受损 PC12 细胞活力的影响 ( x ±s , n = 6)
Fig. 3 　Effects of TP on cellular viability in damaged
PC12 cells ( x ±s , n = 6)
213 　TP 对受损 PC12 细胞细胞膜通透性的影响 :
TP 预处理 1 h , 10、20 μmol/ L 浓度组细胞膜外
LD H 水平明显下降 ( P < 0101) ,说明 TP 能有效拮
抗 H2 O2导致的膜损伤。见图 4。
与对照组比较 : # # P < 0101 ; 与 H2O2组比较 : 3 3 P < 0101
# # P < 01 01 vs cont rol group ; 3 3 P < 01 01 vs H2O2 group
图 4 　TP 对受损 PC12 细胞 LDH释放的影响 ( x±s , n = 6)
Fig. 4 　Effects of TP on LD H release in damaged
PC12 cells ( x ±s , n = 6)
214 　TP 对受损 PC12 细胞周期相分布的影响 : TP
预处理 1 h ,各剂量组能明显降低细胞周期 G0 / G1
相细胞分布百分率 ( P < 0101) ,而 10、20μmol/ L
能明显升高细胞周期 S 相细胞分布百分率 ( P <
0101) ,并且各剂量组均能明显升高细胞的 PI 值
( P < 0101) 。见图 5。
·749·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
与对照组比较 : # # P < 0101 ; 与 H2O2组比较 : 3 3 P < 01 01
# # P < 01 01 vs cont rol group ; 3 3 P < 01 01 vs H2O2 group
图 5 　TP 对受损 PC12 细胞周期 G0 / G1 ( A) 与 S 期 ( B) 细胞分布百分率及 PI ( C) 的影响 ( x ±s , n = 6)
Fig. 5 　Effects of TP on percentage in G0 / G1 ( A) and S phase ( B) of cell cycle and PI ( C) in damaged PC12 cells ( x±s , n = 6)
215 　TP 对受损 PC12 细胞周期 S 期中 DNA 增殖
的影响 : TP 预处理 1 h ,各剂量组能明显升高 BrdU
阳性细胞数 ( P < 0105) 。见图 6。
与对照组比较 : # # P < 0101
与 H2O2组比较 : 3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01
# # P < 01 01 vs cont rol group3 P < 0105 　3 3 P < 0101 vs H2O2 group
图 6 　TP 对受损 PC12 细胞 BrdU 标记阳性细胞的影响
( x ±s , n = 3)
Fig. 6 　Effects of TP on BrdU2label positive cells
in damaged PC12 cells ( x ±s , n = 3)
3 　讨论
　　茶在世界各地广泛使用 ,其作为药用已有千年
历史 ,潜在的药用价值已经得到公认。其中最关键
的活性成分 TP 是一种良好的天然抗氧化剂。近年
关于 TP 的研究尤为迅速 ,尤其因具有显著抗氧化
作用 ,拮抗氧自由基介导的疾病是目前医学研究的
活跃领域。而且 TP 能透过血脑屏障 ,清除自由基 ,
缓解脂质过氧化状态[11 ] ,因此推测其可能成为治疗
神经损伤性疾病的备选药物。
本研究采用 H2 O2 诱导的氧化应激损伤的
PC12 细胞作为神经损伤的体外模型。H2 O2能够穿
透并且损伤生物膜、线粒体 ,因而 H2 O2常常作为毒
性物质来模拟氧化应激体外模型。PC12 细胞为大
鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株 ,被广泛
用来研究多种神经系统疾病 ,如帕金森病、阿尔茨海
默病等[12 ] 。因而 ,本研究使用 H2 O2 诱导的 PC12
细胞损伤作为神经损伤体外模型来评价 TP 的神经
保护效果。
本研究结果显示 TP 能减少 H2 O2 诱导的细胞
线粒体损伤 ,增加细胞活力。另外 ,细胞膜通透性变
化是细胞损伤的一个共同特点。LD H 是细胞质膜
标记酶 ,是反映细胞死亡常用的生化指标 ,膜外
LD H 水平高 ,则细胞膜受损程度高。故测定培养液
中 LD H 活性是反映细胞损伤的一种敏感且较为简
便的指标。本实验结果表明 ,模型组 PC12 细胞培
养液中 LD H 漏出率明显高于对照组 ,而给予 TP
后 ,细胞上清液中的 LD H 减少显著 ,提示 TP 可减
轻 H2 O2所致的神经元细胞膜损伤 ,对神经元具有
保护作用。
TP 对受损细胞的保护作用中 ,DNA 增殖是其
重要标志。细胞周期中 , G0 / G1 期的细胞数量百分
比减少 ,S 期细胞数量百分比增加反映了 DNA 增
殖[9 ] 。本实验结果表明 , TP 预处理能使 G0 / G1 期
的细胞数量百分比减少 ,S 期细胞数量百分比以及
PI 增加 ,提示 TP 能使受损 PC12 细胞停留在 S 期 ,
从而导致细胞 DNA 合成增加。为进一步验证细胞
DNA 的增殖情况 ,S 期 DNA 合成多少通过 BrdU
标记实验来检测。BrdU 实验结果显示 TP 能显著
增加 BrdU 阳性细胞数。通过流式细胞术及 BrdU
免疫荧光染色实验 ,说明 TP 能延长细胞周期相的
S 期 ,提高该期 DNA 合成 ,从而促进了受损细胞
增殖。
综上所述 , TP 能增加细胞活性 ,保护受损细胞
膜 ,延长细胞周期的 S 期及促进该期 DNA 合成 ,增
·849· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
加受损细胞的 PI。由此可见 TP 对 H2 O2 所致
PC12 细胞损伤具有保护作用。但是 TP 抑制
H2 O2诱导 PC12 细胞损伤的机制尚需进一步研究。
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咖啡酸在大鼠体内两个葡萄糖醛酸结合物的分离与鉴定
魏 　玲1 ,3 ,周茂金2 ,4 ,张铁军3 ,侯文彬3 ,王丽莉3 ,许 　浚3
①
(11 天津医科大学 ,天津 　300070 ; 21 天津药物研究院 药效与药代动力学国家重点实验室 ,天津 　300193 ;
31 天津药物研究院 ,天津 　300193 ; 41 山东省泰安市中心医院 ,山东 泰安 　271000)
摘 　要 :目的 　研究咖啡酸在大鼠体内的代谢 ,并对咖啡酸在大鼠尿中两个葡萄糖醛酸结合物进行分离及结构鉴
定。方法 　大鼠按 100 mg/ kg ig 给予咖啡酸后收集尿样 ,以 LC2MS/ MS 方法分析追踪代谢产物 ,采用大孔树脂、
ODS 开放柱、Sephadex L H220 和制备型高效液相色谱分离代谢产物。结果 　给药后尿样中检测到 4 种二相代谢
产物 ,分别为 2 个咖啡酸葡萄糖醛酸结合物和 2 个咖啡酸硫酸结合物。结论 　咖啡酸在大鼠体内广泛代谢 ,首次
采用分离方法获得 2 个咖啡酸葡萄糖醛酸结合物 ,并对其结构进行了鉴定。
关键词 :咖啡酸 ; 代谢 ; 咖啡酸232O2β2D2葡萄糖醛酸 ; 咖啡酸242O2β2D2葡萄糖醛酸
中图分类号 :R285151 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 06 - 0949 - 04
　　咖啡酸 (caffeic acid , 3 ,42二羟基肉桂酸) 属于
酚酸类化合物 ,存在于小蓟、金银花、杜仲、牛至、茵
陈、蒲公英等多种药用植物中。研究表明咖啡酸具
有广泛生物学活性 ,如抗氧化[1 ,2 ] 、抗病毒[3 ] 、降血
压[ 4 ] 、降血糖[5 ]等。由于其多效低毒的特性 ,在医药
领域受到越来越多的关注。国内外关于咖啡酸代谢
方面的研究也日趋增多。已有学者[6 ,7 ]给大鼠 ig 咖
啡酸后通过 L C/ MSn方法在尿样中检测到了咖啡酸
葡萄糖醛酸结合物、咖啡酸硫酸结合物、咖啡酸甲基
化代谢产物 (阿魏酸和异阿魏酸) 及其葡萄糖醛酸
和硫酸结合物等。Azuma 等[8 ] 测定酶水解前后大
鼠血浆中咖啡酸的浓度 ,结果表明咖啡酸主要以葡
萄糖醛酸和硫酸结合物形式存在 ,其中葡萄糖醛酸
结合物的浓度最高。但已有的研究[6 ,7 ] 只是根据质
谱断裂规律推测了这些代谢产物的结构 ,并没有对
这些代谢产物的结构进行确认。为进一步研究咖啡
酸在大鼠体内的代谢 ,本研究采用 L C2MS/ MS 分
析追踪主要代谢产物 ,用大孔树脂、ODS 等开放柱
色谱及制备型高效液相色谱对其进行分离 ,从大鼠
尿中获得两个葡萄糖醛酸结合物 ,并通过波谱学手
·949·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
①收稿日期 :2009212229　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :魏　玲 (1984 —) ,女 ,天津人 ,硕士 ,研究方向为天然药物体内代谢研究。
Tel : 15902262960 　E2mail : sincereweiling @163. com