全 文 ：3, 5二硝基水杨酸比色法测定猕猴桃根提取物中多糖
吴瑾瑾1 , 朱雨晴2 , 章德军2 ,石森林2 *
( 1 杭州第四医院,浙江 杭州 310005; 2. 浙江中医药大学,浙江 杭州 310053)
摘 要:目的 建立猕猴桃根提取物中多糖的测定方法。方法 葡萄糖为对照品, 3, 5二硝基水杨酸比色法测定,
显色剂用量为 1. 5 mL , 显色时间为 60 min,测定波长为 480 nm。结果 线性范围为 18. 05~ 72. 18 g mL - 1 ; 还
原糖加样回收率为 97. 86% ( RSD为 1. 50% ) ,总糖加样回收率为 97. 29% ( RSD 为 1. 76% )。结论 本方法精密度
高,稳定性、重复性好,可以用于测定猕猴桃根提取物中多糖。
关键词:猕猴桃根; 多糖; 3, 5二硝基水杨酸;比色法
中图分类号: R286 02 文献标识码: B 文章编号: 02532670( 2010) 10164902
猕猴桃根为猕猴桃科植物中华猕猴桃 Acti
nidia chinensi s Planch的根或根皮,也叫藤梨根, 性
寒,味苦, 涩,具清热解毒,活血消肿, 祛风利湿等功
效[ 1]。猕猴桃根具有抗肿瘤、抗病毒等作用,其药效
物质基础主要为多糖[ 13] 。目前植物多糖的测定方
法主要有硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法,但这两种方法
只能测定总糖, 不能测定还原糖。为准确测定多糖
含量,便于猕猴桃根多糖提取物的工艺优化与质量
控制,本实验采用 3, 5二硝基水杨酸( DN S)比色
法,建立了猕猴桃根提取物中多糖的测定方法。
1 仪器与试药
UV ! 2450紫外分光光度计, 日本岛津; WH !
861 型涡旋混合仪, 太仓市科教器材厂; KH !
520DB型超声波清洗器, 昆山市禾创市超声仪器有
限公司; XS105 Dual Range 电子分析天平,梅特勒
托利多仪器(上海)有限公司。
猕猴桃根多糖提取物( A PPS) ,自制; D无水葡
萄糖对照品(批号 110833200503) , 中国药品生物
制品检定所; 3, 5二硝基水杨酸( DNS)试剂,国药集
团化学试剂有限公司; 其他所用化学试剂均系
分析纯。
2 方法与结果
2. 1 溶液的配制
2. 1. 1 显色液的配制[ 45] : 配制 4. 5%的 NaOH 溶
液与 1. 0%的 DNS溶液适量,取 4. 5% NaOH 溶液
300 mL,加入 1. 0% DNS溶液 880 mL 及酒石酸钾
钠 255 g, 使溶解, 得试液 A。配制 10% NaOH 溶
液,量取 22 mL, 加入还原的结晶苯酚 10 g, 加水使
之溶解, 定容至 100 mL, 量取 69 mL 加入 6. 9 g
Na2SO 3 使之溶解, 得试液B。将试液 B注入试液 A
中,使之完全溶解后,储于棕色试剂瓶中; 在室温下,
放置 7~ 10 d,即得。
2. 1. 2 对照品溶液的配制:精密称定 105 ∀ 干燥至
恒重的无水葡萄糖对照品约 50 mg ,置 50 mL 量瓶
中,蒸馏水溶解完全后,稀释定容,混匀(质量浓度约
1. 0 mg/ mL) ,置 4 ∀ 冰箱保存备用。
2. 1. 3 还原糖供试品溶液的配制:精密称定 APPS
粉末约 30 mg,置 25 mL 量瓶中,加适量蒸馏水使其
溶解完全,并用蒸馏水稀释定容,摇匀,滤过,弃初滤
液,取续滤液,备用。
2. 1. 4 总糖供试品溶液的配制:精密称定 APPS粉
末约 20 mg, 置 50 mL 磨口三角瓶中, 加盐酸溶液
13. 5 mL,置沸水浴中 60 min,取出自然冷却后, 加
40% NaOH 溶液调 pH 值至 7. 0,移入 50 mL 量瓶
中,加蒸馏水稀释定容,摇匀, 滤过, 弃初滤液,取续
滤液,备用。
2. 2 标准曲线的绘制: 精密移取 2. 0、3. 0、4. 0、5.
0、6. 0、7. 0、8. 0 mL 对照品浓溶液至 25 mL 量瓶,
加蒸馏水稀释定容,再分别精密移取 2. 0 mL 置 10
mL 量瓶中,加 DNS 试液 1. 5 mL, 沸水浴 60 min,
自然冷却,定容;另取蒸馏水 2 0 mL 置 10 mL 量瓶
中,同上操作,为空白对照,在 480 nm 处测定吸光度。
以葡萄糖质量浓度对相应的葡萄糖显色后的吸光度
值进行线性回归, 结果回归方程为 A = 2286 C-
0 276, r= 0 999 8。结果表明葡萄糖在18 05~ 72 18
g/ mL 线性关系良好。
1649 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20091212 基金项目:浙江省自然科学基金资助项目 ( 300431 ) ; 浙江省科技厅重点项目 ( 2008C23068 ) ; 浙江省中医药管理局项目 ( 2003KF001,
2007CA114)作者简介:吴瑾瑾( 1973 ! ) ,女,浙江义乌人,副主任中药师,研究方向:中药制剂新技术与医院制剂研究。Em ail: h zbjw jj@ 163. com
* 通讯作者 石森林 T el: 057186613524 Em ail : pjstone@ 163. com
2. 3 精密度试验:精密移取 5. 0 mL 对照品浓溶液
至 25 mL 量瓶,加蒸馏水稀释定容, 再分别精密移
取 2. 0 mL 置10 mL 量瓶中, 加 DNS试液 1. 5 mL,
沸水浴 60 min, 自然冷却, 定容, 在 480 nm 处测定
吸光度, 依法重复测定 6次。记录吸光度, 计算得
RSD为 0. 20%。精密移取还原糖和总糖供试品溶
液 2. 0 mL 置 10 mL 量瓶中, 同上操作, 结果 RSD
分别为 0. 07%、0. 15%。
2. 4 稳定性试验: 精密移取还原糖供试品溶液、总
糖供试品溶液各 2. 0 mL 置 10 mL 量瓶中, 按照以
上显色操作, 分别在 0、20、40、60、80、100、120 m in
测定吸光度,计算得 RSD分别为 2. 01%、0. 57%。
2. 5 重现性试验:精密量取 APPS粉末 6份(约 30
mg) ,置 25 mL 量瓶中, 加适量蒸馏水使其溶解完
全,并用蒸馏水稀释定容,摇匀,滤过,弃初滤液, 取
续滤液,按照以上还原糖显色操作,在 480 nm 测定
吸光度,计算还原糖的质量分数为 6. 04%, RSD 为
0. 56%。
精密称定 APPS样品粉末 6 份(约 20 mg ) , 按
总糖供试品溶液的配制项下配制溶液, 精密称取
2 0 mL 置 10 mL 量瓶中, 以上总糖显色操作, , 计
算得总糖的质量分数为 55. 52% , RSD为 1. 00%。
2. 6 回收率试验: 精密称定 APPS 样品粉末 9 份
(约 20 mg) ,置 25 mL 量瓶, 分成 3组后按多糖量的
80%、100%、120% 分别加入葡萄糖对照品 8. 0、
10 0、11 5 mg,加适量蒸馏水使其溶解完全, 并用
蒸馏水稀释定容, 摇匀, 滤过, 弃初滤液, 取续滤液,
按照以上还原糖显色操作,计算,结果平均回收率为
97 86%, RSD为 1. 50%。
精密称定 APPS样品粉末 9 份(约 10 mg ) , 置
50 mL 量瓶, 分成 3组后按多糖量的 80%、100%、
120%分别加入葡萄糖对照品 8. 1、10. 0、12. 6 mg,
按照以上总糖显色操作, 计算, 结果平均回收率为
97. 29%, RSD为 1. 76%。
2. 7 样品测定:取 3批 APPS 适量,精密称定,配制
还原糖供试品溶液和总糖供试品溶液, 精密移取溶
液 2. 0 mL 分置 10 mL 量瓶中, 显色,在 480 nm 测
定吸光度,同时按标准曲线的绘制项操作, 测定, 以
标准曲线法定量,计算 APPS 粉末中的总糖、单糖,
结果见表 1。
表 1 猕猴桃根中多糖的测定结果( n= 3)
Table 1 Polysaccharides in Actinidia Chinensis Radix
(n= 3)
批次 总糖/ % 单糖/ % 多糖/ %
1 58. 75 6. 94 51. 81
2 58. 31 7. 02 51. 29
3 58. 07 6. 81 51. 26
3 讨论
植物多糖常用苯酚硫酸法与硫酸蒽酮法测
定,但该两种方法均不能排除单糖的干扰,而且浓硫
酸遇水剧烈放热, 从而导致显色条件难以控制, 影响
测定结果,浓硫酸具有严重的腐蚀性, 不便操作[ 6] ,
因此本实验采用 DN S法测定猕猴桃根中多糖。
由于单糖是还原糖,还原糖在碱性条件下加热
被氧化成醛酸等产物, DNS 则被氧化成棕红色的产
物。在一定的浓度范围内,还原糖的质量浓度与棕
红色物质的颜色深浅成正比,在一定波长条件下测
定吸光度,根据标准曲线计算还原糖;然后用酸水解
法使其降解成还原性单糖, 再测定样品中总糖, 总糖
的量减去还原糖的量即得多糖。
实验考察了猕猴桃根多糖的水解条件、DN S用
量与检测波长, 结果发现, APPS 量与盐酸量按照
1 mg #1 5 mL比例, 加热 (沸水浴)时间 60 min较
好; DNS用量以 1. 5 mL 为宜, 480 nm 作为检测波长。
参考文献:
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