全 文 ：胶囊及两药合用均可改善 DN 大鼠蛋白尿和肾功
能 ,减轻肾脏胶原沉积 ,且两药合用较单用洛汀新可
以更好控制 DN 大鼠蛋白尿。DN 大鼠肾皮质组织
胞液 P KC 活性较正常大鼠下降 ,胞膜的 P KC 活性
明显增高 ,胞液 P KC 活性与胞膜 P KC 活性之比显
著下降 ,提示 DN 大鼠肾皮质细胞有 P KC 由胞浆
向胞膜转移的过程 ,与文献报道一致[5 ] 。洛汀新与
六味地黄加味胶囊都能提高胞液 P KC 活性 ,降低
胞膜 P KC 活性 ,使胞液 P KC 活性与胞膜 P KC 活
性比显著提高 ,降低血清 T GF2β1 水平和肾皮质
CT GF 表达 ,且两药合用可以更加显著降低 DN 大
鼠肾皮质胞膜 P KC 活性 ,提高胞液 P KC 活性与胞
膜 P KC 活性比 ,两药合用较单用洛汀新更显著降
低血清 T GF2β1 水平和肾皮质 CT GF 的表达 ,说明
洛汀新与六味地黄加味胶囊合用可以更有效抑制肾
脏 P KC 活化 ,降低 T GF2β1 水平和 CT GF 的表达。
综上结果 ,六味地黄加味胶囊对 DN 大鼠肾脏有明
显的保护作用 ,其作用机制与抑制肾脏 P KC 激活、
降低细胞因子 T GF2β1 及抑制肾皮质 CT GF 的表
达有关 ,并且与洛汀新合用有协同保护肾脏的作用 ,
对临床应用六味地黄加味胶囊治疗 DN 有指导
意义。
参考文献 :
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双氢青蒿素诱导前列腺癌 PC23 细胞凋亡及其机制研究
高小玲1 ,罗子国1
①
,王丕龙2 ,李庆春1
(11 重庆医科大学生命科学研究院 ,重庆 　400016 ; 21 重庆医科大学附属第一医院 消化内科 ,重庆 　400016)
摘 　要 :目的 　研究双氢青蒿素对前列腺癌 PC23 细胞的凋亡诱导作用 ,并探讨其可能的机制。方法 　M TT 法测
定不同浓度双氢青蒿素对 PC23 细胞增殖的影响 ,流式细胞仪 ( FCM) 、透射电镜 ( TEM) 观察双氢青蒿素对 PC23
细胞的凋亡诱导作用 ,免疫组化 (SP) 检测双氢青蒿素对 PC23 细胞内 Bax、Bcl22 蛋白阳性表达的影响。结果 　双
氢青蒿素对 PC23 细胞有明显增殖抑制效应 ,能诱导 PC23 细胞凋亡且具有浓度2时间依赖性 ,导致 PC23 细胞线粒
体肿胀、核碎裂、凋亡小体形成 ;随着双氢青蒿素浓度的增加 ,Bcl22 蛋白阳性表达降低 ,而 Bax 蛋白阳性表达增加。
结论 　双氢青蒿素可能通过上调 Bax ,下调 Bcl22 蛋白表达诱导前列腺癌 PC23 细胞凋亡。
关键词 :双氢青蒿素 ; 前列腺癌 ; 细胞凋亡
中图分类号 :R97911 ; R73712 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 01 - 0081 - 05
·18·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
①　　收稿日期 :2009203216
　　作者简介 :高小玲 (1970 —) ,女 ,重庆人 ,主治医师 ,博士在读 ,主要从事抗肿瘤机制研究。
Tel : (023) 68485838 　E2mail : ling2high @163. com
　　3 通讯作者　罗子国　Tel : (023) 68485838 　E2mail : luoliangwen @yahoo. com. cn
Induction of dihydroartemisinin on prostate cancer PC23 apoptosis and its mechanism
GAO Xiao2ling1 , L UO Zi2guo1 , WAN G Pi2long2 , L I Qing2chun1
(11 Institute of Life Science , Chongqing Medical University , Chongqing 400016 , China ; 2. Department of Gast roenterology ,
The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University , Chongqing 400016 , China)
Abstract : Objective 　To study t he induction of dihydroartemisinin (D HA) on prostate cancer PC23
apoptosis and it s possible mechansim. Methods 　M T T was employed for cellular viability measurement ,
flow cytomet ry ( FCM) and t ransmission elect ron microscopy ( TEM) for observation of apoptosis , and im2
munocytochemical staining (SP) for analyzing the exp ression of Bcl22 and Bax proteins in PC23 cells t reated
wit h D HA of different concent ration. Results 　D HA Significantly inhibited t he proliferation of PC23 cells ,
induced t heir apotosis in a time2concent ration dependent manner , and led to mitochondrial swelling , nucle2
ar f ragmentations and apoptosis body formation , down2expression of Bcl22 protein , and over2exp ression of
Bax protein correspondence wit h D HA concent ration. Conclusion 　D HA could induce t he apoptosis in
PC23 cells by up2regulating Bax protein and down2regulating Bcl22 protein.
Key words : dihydroartemisinin (D HA) ; p rostate cancer ( PC) ; apoptosis
　　前列腺癌 (p rostate cancer) 是男性泌尿生殖系
统常见肿瘤之一 ,在美国占男性肿瘤发病率第 1 位、
死亡率第 2 位[1 ] 。近年来 ,国内前列腺癌的发病率
和死亡率上升趋势明显 ,且尚无有效的治疗措施 ,因
此寻求高效低毒的治疗用药具有重要意义。青蒿素
(artemisinin) 是从菊科蒿属黄花蒿茎叶中提取的
一种含过氧基团的倍半萜内酯 ,其衍生物有青蒿琥
酯 (artesunate) 、双氢青蒿素 ( dihydroartemisinin ,
D HA) 及蒿甲醚 (artemet her) 等[2 ] ,由于其高效低
毒 ,能杀灭多重耐药疟原虫 ,世界卫生组织推荐使用
以青蒿素为基础的联合治疗对抗耐传统单一疗法的
疟疾[3 ] 。近年来 ,青蒿素抗肿瘤细胞增殖、诱导细胞
凋亡以及对活体移植瘤的抑制作用日益受到关
注[ 4～7 ] 。研究表明 ,青蒿素及其衍生物除对多种肿
瘤细胞有抑制作用外 ,对前列腺癌细胞也呈中度抑
制作用[8 ] ,然而 ,对前列腺癌细胞的抑制作用机制尚
未见相关报道。由于青蒿素类药物吸收后主要通过
转化为双氢青蒿素活性成分而发挥药理作用[9 ] ,故本
实验采用酶联免疫法、流式细胞仪、透射电镜、免疫组
化法检测双氢青蒿素对前列腺癌 PC23 细胞的增殖活
性、凋亡及凋亡相关基因 bcl22、bax 表达的影响 ,为寻
求新型高效低毒抗前列腺癌药物提供参考。
1 　材料
111 　药物 :双氢青蒿素由重庆医科大学附属第一医
院薛斌博士馈赠 ,质量分数为 9915 % ,以少量二甲
基亚砜 (DMSO) 溶解配成浓度为 200 mmol/ L 的
母液 ,超声波助溶。4 ℃保存。实验前用 HamF12
培养 基 稀 释 至 所 需 浓 度 ( DMSO 终 体 积 分
数 < 011 %) 。
112 　细胞株 :人前列腺癌 PC23 细胞株购自中国科
学院上海细胞生物学研究所细胞库。
113 　主要试剂 : HamF12 培养基 , Gibco 公司 ;胎牛
血清 ( FBS) ,杭州四季青生物制品有限公司 ;M T T ,
Sigma 公司 ;Annexin2V2Flous 试剂盒 ,晶美生物工
程有限公司 ; SP 试剂盒、Bcl22 鼠抗人单克隆抗体、
Bax 鼠抗人单克隆抗体、DAB 显色剂 ,北京中杉金
桥生物技术有限公司。
114 　主要仪器 : CW —CJ —2FO 超净工作台 ,苏净
集团安泰空气技术有限公司 ; YCP —200 全自动
CO2孵箱 ,上海易亮医疗器械有限公司 ; TDV5 —WS
离心机 ,长沙湘仪离心机仪器有限公司 ; ST/ TC 酶
联免疫检测仪 , Tecan Aust ria Gmb H ; FACS Cali2
bur 流式细胞仪 ,BD 公司 ; TE2000 —U 倒置显微
镜 ,日本尼康 ; H7500 透射电子显微镜 , HITACH I。
2 　方法
211 　细胞培养 :人前列腺癌 PC23 细胞接种于含
10 % (体积分数) FBS、双抗溶液 (青霉素 G 100
IU/ mL 、链霉素 100 IU/ mL ) 的 HamF12 培养基
中 ,置于 37 ℃、5 % CO2 、95 % 饱和湿度条件下的孵
箱中常规培养 ,细胞贴壁生长 ,每 2～3 天换液 1 次 ,
当细胞生长汇合时 ,按 1 ∶3 传代 ,每周传代 1～2
次。用 0125 % 胰蛋白酶/ 0102 % ED TA 混合消化
液消化 ,收集对数生长期细胞进行实验。
212 　M T T 法检测细胞增殖活性 :用 0125 % 胰蛋
白酶/ 0102 % ED TA 混合消化液消化处于对数生长
期的 PC23 细胞 ,离心收集后 ,台盼蓝计数 ,用含 5 %
FBS 的 HamF12 培养基调整细胞悬液浓度为
215 ×104 / mL ,均匀接种于 3 块 96 孔培养板中 ,每
孔 200μL ,常规培养 24 h ,细胞贴壁后 ,将每一块板
上的细胞分为双氢青蒿素 1215、25、50、100、200
·28· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
μmol/ L 5 个浓度组 ,以及对照 HamF12 组 (用含
5 % FBS 的 HamF12 培养基培养细胞) 。每一浓度
组设 4 个重复孔及一个空白调零孔。37 ℃、5 %
CO2 、95 % 饱和湿度条件下 ,分别培养 24、48、72 h
后 ,每孔加 M T T (5 mg/ mL ) 20μL ,继续培养 4 h
后 ,小心吸弃孔内上清 ,每孔加 DMSO 200μL ,均匀
振荡 10 min 至结晶溶解 ,比色 ,在酶联免疫检测仪
上测定 540 nm 波长处各孔吸光度值 ( A 540 ) ,记录
实验结果 ,计算细胞生长抑制率[抑制率 = (1 - 实验
组 A 540 / 对照组 A 540 ) ×100 %]。实验重复 3 次取平
均值。
213 　流式细胞仪分析细胞凋亡 :用 0125 % 胰蛋白
酶/ 0102 % ED TA 混合消化液消化处于对数生长期
的 PC23 细胞 ,离心收集 ,在含 5 % FBS 的 HamF12
培养液中培养。将细胞分为双氢青蒿素 1215、50、
200μmol/ L 3 个浓度组 ,细胞贴壁后 ,各浓度组分
别作用 48、72 h ,消化细胞 ,吹打成单细胞悬液 ,台
盼蓝计数细胞 ,使收集细胞总数 1 ×106 以上 , PBS
洗涤 2 次 ,单细胞悬液在室温下 1 400 r/ min 离心 5
min 后弃上清 ,按照 Annexin2V2FITC 凋亡试剂盒
提供的方法检测暴露在细胞表面的磷脂酰丝氨酸
( PS) ,进行细胞凋亡与死亡的检测。实验重复 3 次
取平均值。
214 　透射电镜观察细胞超微结构改变 :取对数生长
期 PC23 细胞在含 5 % FBS HamF12 培养液中培
养。细胞贴壁后 ,分别以 0、1215、50、200 μmol/ L
双氢青蒿素作用 48 h ,以 0125 % 胰蛋白酶/ 0102 %
ED TA 混合消化液消化细胞 ,吹打成单细胞悬液 ,
台盼蓝记数细胞 ,使收集细胞总数为 1 ×106 以上 ,
将单细胞悬液在室温下离心 ,1 500 r/ min 离心 20
min ,弃上清 ,经 4 % 戊二醛及 1 % 锇酸 (磷酸盐配
制) 预固定和后固定 (p H 7. 2～7. 4) 各 2 h ,酒精
和丙酮梯度脱水 ,环氧树脂 618 浸透、包埋 ,65 ℃
聚合 24 h ,超薄切片机制备 50 nm 超薄切片 ,经枸
橼酸铅电子染色 ,透射电镜观察。
215 　免疫组化检测细胞 Bcl22、Bax 蛋白阳性表达 :
免疫组化采用 SP 法进行 Bcl22、Bax 检测。取对数
生长期细胞以 0125 % 的胰蛋白酶/ 0102 % ED TA
混合消化液消化 ,用含 5 % FBS 的 HamF12 培养基
制成浓度为 215 ×104 / mL 的细胞悬液 ,接种于放有
无菌盖玻片的 24 孔培养板中 ,每孔 1 mL ,常规培
养 24 h 后 ,经过 0 (对照组) 、1215、50、200μmol/ L
双氢青蒿素作用 48 h 后 ,终止培养 ,PBS 洗 3 次 ,用
95 % 乙醇固定 20 min ,取出细胞爬片 ,根据 SP 试
剂盒说明书操作 ,最后苏木素衬染、梯度酒精脱水、
二甲苯透明、中性树胶封片。阳性对照参照已知阳
性标本 ,阴性对照用 PBS 代替一抗。SP 实验结果
采用北航真彩色医学图像处理系统软件进行平均吸
光度值的图像分析。
216 　统计学分析 :实验结果以 x ±s 表示 ,应用
SAS911 统计软件 ,数据采用析因设计方差分析及
SN K 法两两比较进行统计学处理。
3 　结果
311 　双氢青蒿素对 PC23 细胞增殖活性的影响 :以
HamF12 为对照组 ,比较不同浓度双氢青蒿素对
PC23 细胞增殖的影响。各组、各时间点 PC23 细胞
增殖活性见表 1。经统计学分析 ,各浓度组与对照
组比较差异有统计学意义 ( P < 0105) ;1215 与 25
μmol/ L 组的差异没有统计学意义 ,各时间点组及
50、100、200μmol/ L 浓度组两两比较差异有统计学
意义 ( P < 0105) ,PC23 细胞的增殖活性与双氢青蒿
素浓度和作用时间呈负相关。
表 1 　双氢青蒿素对前列腺癌 PC23 细胞增殖的影响
( x ±s , n = 12)
Table 1 　Effect of D HA on proliferation of PC23 cells
( x ±s , n = 12)
组　别
C/
(μmol ·L - 1 )
A540值 (抑制率/ %)
24 h 48 h 72 h
对照 - 0172 ±0111 ( - ) 1135 ±0121 ( - ) 2101 ±0118 ( - )
双氢青蒿素 1215 0164 ±0111 (10130) 3 1102 ±0118 (24154) 3 1108 ±0117 (46115) 3
25 0160 ±0107 (15150) 3 0198 ±0118 (27143) 3 0197 ±0114 (51178) 3
50 0154 ±0107 (24139) 3 0189 ±0116 (34172) 3 0171 ±0110 (56102) 3
100 0148 ±0106 (32166) 3 0180 ±0114 (40181) 3 0188 ±0115 (64166) 3
200 0140 ±0106 (43152) 3 0160 ±0101 (55192) 3 0171 ±0110 (75132) 3
　　与对照组比较 : 3 P < 01 05
　　3 P < 01 05 vs cont rol group
312 　双氢青蒿素对 PC23 细胞凋亡的影响 :流式细
胞仪分析各组 PC23 细胞凋亡率 ,见表 2。双氢青蒿
素对前列腺癌 PC23 细胞凋亡的影响具有浓度2时间
相关性。经统计学分析 ,各浓度组与对照组比较及
时间组两两比较 ,差异有统计学意义 ( P < 0105) ,当
双氢青蒿素 200 mmol/ L 时 ,48、72 h 诱导凋亡率分
别达 (22106 ±2115) %、(28191 ±1173) %。
313 　双氢青蒿素对 PC23 细胞超微结构的影响 :对
照组 PC23 细胞 ,直径 8～14μm 大小不一 ,形态呈
圆形或椭圆形 ,较规则 ,细胞表面有微绒毛 ,细胞核
较大 ,核仁明显 (1～2 个) ,常染色质丰富 ,胞浆呈
均匀中等的电子密度 ,散在分布有粗面内质网和线
粒体 ,含有丰富的游离多聚核糖体 ,可见核分裂相 ,
见图 12a。双氢青蒿素各浓度组可见数量不等、程度
·38·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
不同的凋亡和坏死细胞 ,浓度越高 ,凋亡和坏死细胞
数量越多 ;早期凋亡细胞表现为细胞基质电子密度
变深 ,细胞核异染色质边集 ,质膜表面呈泡状外突 ,
见图 12b ;晚期凋亡细胞基质进一步浓缩 ,电子密度
更深 ,少数凋亡细胞可见线粒体呈不同程度内室肿
胀、核碎裂成许多小块 ,直至细胞凋亡成许多凋亡小
体 ,凋亡小体大小不等 ,其内核碎片可有可无 ,其膜
表 2 　双氢青蒿素对前列腺癌 PC23 细胞凋亡的影响
( x ±s , n = 3)
Table 2 　Effect of D HA on apoptosis of PC23 cells
( x ±s , n = 3)
组　别
C/
(μmol ·L - 1)
凋亡率/ %
48 h 72 h
对照 - 11 32 ±01 38 31 20 ±01 31
双氢青蒿素 1215 41 70 ±11 07 3 61 48 ±01 66 3
50 51 63 ±01 63 3 81 95 ±11 16 3
200 221 06 ±21 15 3 281 91 ±11 73 3
　　与对照组比较 : 3 P < 01 05
　　3 P < 0105 vs cont rol group 完整 ,见图 12c、d。早期坏死细胞表现为细胞核异染色质边集、核轻度溶解 ,细胞质呈灶性和成片的溶解 ,粗面内质网扩张 ,线粒体内室肿胀 ,核糖体减少 ,但核膜和质膜均完整 ;晚期坏死细胞可见胞浆电子密度明显降低 ,细胞核溶解破裂 ,线粒体进一步肿胀 ,伴有膜破裂 ,部分细胞可见质膜破裂 ,胞浆外溢。见图 12e、f 。314 　双氢青蒿素对 PC23 细胞 Bcl22 和 Bax 蛋白阳性表达的影响 :Bcl22 蛋白反应产物为棕色 ,位于细胞膜及细胞浆。对照组 ,细胞膜及细胞浆内呈深棕色 ,双氢青蒿素浓度越高 ,颜色越浅。Bax 蛋白反应产物为棕色 ,位于细胞浆。对照组 ,胞浆内呈浅棕色弱阳性 ,双氢青蒿素浓度越高 ,颜色越深 ,见图 2 ;阴性对照组无特异性染色。图片经图像体视分析平均吸光度值见表 3 ,经统计学分析不同浓度双氢青蒿素之间 Bcl22 与 Bax 表达平均吸光度值差异有统计学意义 ,Bcl22 ( P < 01001) ,Bax ( P < 01001) 。
a2正常形态的 PC23 细胞　b2早期凋亡的 PC23 细胞　c2中期凋亡的 PC23 细胞　d2晚期凋亡的 PC23 细胞　e、f2坏死的 PC23 细胞
a2normal PC23 cells 　b2apoptotic PC23 cells in earlier stage 　c2apoptotic PC23 cells in intermediate stage
d2apoptotic PC23 cells in advanced stage 　e、f2necrotic PC23 cells
图 1 　透射电镜下双氢青蒿素对 PC23 细胞超微结构的影响 ( 48 h)
Fig. 1 　Effects of D HA on ultrastructure of PC23 cells by TEM ( 48 h)
图 2 　双氢青蒿素对 PC23 细胞 Bcl22 和 Bax 蛋白阳性表达的影响 ( 48 h)
Fig. 2 　Effects of D HA on Bcl22 and Bax protein positive expression in PC23 cells ( 48 h)
·48· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
表 3 　双氢青蒿素对 PC23 细胞 Bcl22 和 Bax 表达的影响
(平均吸光度值) ( x ±s , n = 3)
Table 3 　Effects of D HA on Bcl22 and Bax protein positive
expression in PC23 cells ( average optical value)
( x ±s , n = 3)
组别 C/ (μmol ·L - 1) Bcl22 Bax
双氢青蒿素 121 5 01208 ±01 015 01063 ±01 005
50 01075 ±01 021 01088 ±01 010
200 01083 ±01 010 01243 ±01 010
4 　讨论
　　前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤 ,其
发病率与死亡率很高[ 10 ] ,目前尚无有效的治疗手
段[ 11 ,12 ] ,因此 ,寻求一种高效低毒的治疗用药具有
深远意义。肿瘤的发生是一个复杂过程 ,其中细胞
增殖与凋亡失衡是重要因素之一。抑制肿瘤细胞的
增殖、诱导凋亡是探索抗肿瘤药物的重要思路之一。
本实验表明双氢青蒿素对 PC23 细胞有明显增殖抑
制效应 ,能有效诱导 PC23 细胞凋亡且具有浓度2时
间依赖性 ,对 PC23 细胞超微结构的观察也进一步
证明双氢青蒿素的凋亡诱导作用 ;在对双氢青蒿素
诱导凋亡机制的研究中 ,发现随着双氢青蒿素浓度
的升高 ,凋亡相关基因 Bcl22 在 PC23 细胞胞浆与胞
膜内的表达降低 ,而 Bax 在胞浆表达却显示增加。
bcl22 是从滤泡性 B 淋巴细胞中分离出来的一
种癌基因 ,bcl22 基因家族是重要的细胞凋亡调节因
子 ,分抑凋亡基因 (如 bcl22、bcl2xL 、bcl2w 等) 及促
细胞凋亡 (如 bax、bad、bik 等) [13 ,14 ] 。bcl22 通过 C
末端疏水性氨基酸锚定于线粒体外膜 ,而 bax 则散
布于基质中 ,激活后移位至线粒体表面与 bcl22 作
用通过调控线粒体膜电位及通透性转换通道 ,释放
线粒体膜间隙的促凋亡蛋白 ,如 : 细胞色素 C、
Smac/ DIABLO、A IF 和 endonuclease G (endo G)
等 ,后者激活半胱氨酸蛋白酶 (caspase) 家族引发
caspase 级联反应并最终引起膜泡形成 ,核碎裂和细
胞凋亡[15 ,16 ] 。同时 ,Bcl22 与 Bax 也存在于内质网
膜 ,通过与 IP3R 作用调节并细胞内钙离子信号启
动凋亡途径[17 ] 。Bax 与 Bcl22 的比值调节细胞增殖
和凋亡的平衡 ,当胞浆内 Bax 水平及 Bax/ Bcl22 比
率增大时 ,促进细胞的凋亡[18 ] 。
结合本实验中免疫组化结果及电镜显示双氢青
蒿素作用 PC23 细胞后线粒体内室肿胀 ,凋亡小体
形成 ,推测双氢青蒿素可能通过某种机制下调 Bcl2
2 ,上调 Bax ,使二者比例失衡 ,通过构像变化及蛋白
质间相互作用调节内质网钙离子通道及线粒体膜通
透性转换通道 ,最后通过线粒体释放凋亡物质 ,诱导
了 PC23 细胞的凋亡。
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·58·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月