全 文 ：桃儿七组织培养体系的建立及鬼臼毒素的检测
栗孟飞, 李 唯*
(甘肃农业大学生命科学技术学院, 甘肃 兰州 730070)
摘 要:目的 建立桃儿七组织培养体系及其鬼臼毒素的提取检测方法。方法 以桃儿七成熟分离胚为材料, 研
究了不同浓度激素、活性炭( AC)对无菌苗诱导的影响;以桃儿七无菌苗切除后约 2 0 cm 的根茎为材料, 考察不同
浓度激素对根继代及生长发育的影响,并定期对继代根、叶(叶柄)及培养基进行鬼臼毒素的提取及 H PLC 法检测。
结果 分离胚在 M S+ 2 0% 蔗糖+ 0 4% 琼脂+ 1 0 mg/ mL GA 3+ 1 0 g/ L AC 的培养基培养 20 d 后, 无菌苗诱
导率为 92 0% , 无菌苗生长发育良好; 切除后约 2 cm 的根茎接种在 MS + 2 0% 蔗糖+ 0 4% 琼脂+ 1 0 g/ L
AC+ 1 0 mg / mL IBA 继代 40 d 后,根长 11 59 cm,植株生长发育良好; 对继代根、叶(叶柄)及培养基进行鬼臼毒
素的提取及 HPLC 法检测显示, 鬼臼毒素量大小依次为根> 培养基> 叶(叶柄) , 50 d 后分别为 33 17、12 97、4 55
g / mL。结论 本研究建立了桃儿七组织培养体系,证明了利用桃儿七根培养生产鬼臼毒素的可行性。
关键词:桃儿七; 根继代; 鬼臼毒素; HPLC
中图分类号: R286 1 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 08136605
Establishment of tissue culture system of Sinopodophy llum emodi
and identification of podophyllotoxin
LI M engfei, L I Wei
( Colleg e o f L ife Science and T echnolo g y, Gansu Agr icultural Univer sity, Lanzhou 730070, China)
Abstract: Objective T o establish the tissue cul ture system of S inopodophy llum emodi and the ext rac
t ion and ident ificat ion methods of podophyllotox in. Methods The effects o f seedling induced rate by
different concentr at ions of hormones and activ ated charcoal ( AC) w er e studied, taking the separated ma
ture embryo as material; Then the ef fect of grow th and development of ex cised rhizome ( 2. 0 cm) of the
seedling subcultur ed w ere conducted by dif ferent concentr at ions o f hormones; In addit ion, the contents of
podophy llotox in in rhizome, cultured media, and leaf ( leafstalk) w ere ext racted and ident if ied by HPLC at
regular stag es. Results After 20 d the seedling induced rate reached 92. 0% w ith bet ter grow th and deve
lopment w ith the separated mature embryo of S. emodi seeds cultured on the Murashige and Skooge medi
um ( M S) supplemented w ith 2. 0% sugar, 0. 4% agar, 1. 0 mg/ mL GA 3 , and 1. 0 g/ L act iv ated charcoal
( AC) ; A fter 40 d subculture of ex cised r hizome ( 2. 0 cm ) , the subcultured plant lets show ed bet ter
grow th and development w ith ro ot leng th 11. 59 cm and the cultured medium was M S supplemented w ith
2. 0% sugar, 0. 4% agar, 1. 0 mg/ mL IBA, and 1. 0 g/ L A C, In addit ion, the podophyl lotoxin in differ ent
parts of S. emodi including cultured media at dif ferent g row th stages w as ex t racted and identif ied by
HPLC. T he results indicated that the content of podophy llotox in w as rhizome > cultur ed media > leaf
( leafstalk) w ith 33. 17, 12. 97, and 4. 55 g/ mL, respect iv ely af ter 50 d. Conclusion The tissue culture
system of S. emodi could be established and the method of product ion podophyl lotoxin by r oot culture of
S. emodi is feasible.
Key words: Sinop od op hy l lum emodi ( W al l. ) Ying; roo t subculture; podophyl lotoxin; H PLC
桃儿七 Sinopodop hy l lum emodi ( Wall. )
Ying 是小檗科桃儿七属多年生草本植物, 主要分布
在我国西部 [ 1] ,为我国民间中草药,主要用于痛疖肿
毒、风湿性骨痛、气管炎等症[ 2] , 近年来研究发现, 桃
儿七的根及根茎中主要含有木脂素类、黄酮类、皂
苷、多糖等, 其中木脂素类鬼臼毒素 ( podophyllo
tox in) 量最高 ( 2 7~ 4 2% ) [ 3]。自 King 和 Sulli
van 报道鬼臼毒素具有类似于秋水仙碱作用之后,
引起了人们的普遍关注,并导致一系列医学、生物学
和化学的研究 [ 4]。研究证明鬼臼毒素具有广泛的药
1366 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 20091115 基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金 ( 20096202110006)作者简介:栗孟飞( 1980 ) ,助教,主要从事植物细胞工程及天然药物化学教学与研究。Em ail : lm f@ gsau. edu. cn
学活性, 如 0 5% 鬼臼毒素酊在治疗尖锐湿疣方面
具有起效快、治愈率高、安全性好等特点 [ 5] , 1990 年
世界卫生组织推荐其为一线药物, 1994 年我国!国
家基本药物∀皮肤类抗病毒唯一入选药物 [ 6] ;鬼臼毒
素还是合成抗癌药物 GP7、VP16、VM26、NK611
等[ 7]及抗艾滋病 [ 8]药物的前提物质。由于鬼臼毒素
独特的药理作用及近年来药用市场需求的逐渐增加,
加剧了桃儿七自然资源的开发与利用,使得其自然资
源已面临匮乏与濒危[ 9] , 1992年已被列入!中国珍稀
濒危植物名录∀,并被!中国植物红皮书∀收录。
为了解决桃儿七资源匮乏问题, 国内外学者通
过细胞组织培养 [ 1011]、化学合成[ 12] 等方法进行生产
鬼臼毒素的大量研究,从目前研究看,还不能通过化
学方法大量合成鬼臼毒素。而细胞组织培养多集中
在利用愈伤组织、细胞悬浮培养进行鬼臼毒素的生
产,存在着愈伤组织易褐化、增殖缓慢及鬼臼毒素量
低的特点。目前,尚无关于利用桃儿七根培养生产
鬼臼毒素的报道。本实验以桃儿七成熟胚为材料,
建立了桃儿七组织培养体系及其鬼臼毒素的
HPLC 检测方法。
1 材料
桃儿七成熟种子, 采自甘肃省渭源县会川镇山
区林地自然生长的桃儿七植株。由甘肃省农业科学
院漆燕玲研究员鉴定后确认为桃儿七 Sinopodo
p hy l lum emodi ( Wall. ) Ying 种子。
2 方法
2 1 无菌苗诱导: 首先将种子冲洗干净, 洗去表面
黏液,用 70% 酒精漂洗 10 s,无菌水冲洗 4~ 5 次,
再用 0 1% 的升汞灭菌 20 m in, 无菌水冲洗 4~ 5
次;然后将种子用 0 5 mg / mL GA 3浸泡 36 h。接
种前按照上述灭菌方法对浸泡后的种子进行灭菌,
后用解剖刀取种子成熟胚, 接种在 MS+ 2 0% 蔗
糖+ 0 4% 琼脂附加不同浓度激素 GA 3、NAA、6
BA 及活性炭 ( A C) 的培养基上, pH ( 5 5~ 6 0) ,
每处理接种胚数为 30 个, 重复 3 次。置于温度
( 21 # 1) ∃ ,光照强度 1 000 lx 的条件下进行无菌苗
的诱导。培养 20 d后,目测法统计无菌苗诱导率和
生长势。生长势分为:优+ + + ,良+ + , 中+ ,差- 。
无菌苗诱导率= (无菌苗诱导数/接种成熟胚总数) %
100% ,除去由于解剖损伤的胚,余下完整的为接种成
熟胚总数。
2 2 无菌苗的继代:将生长 40 d 后的桃儿七无菌
苗 (基部已丛生出抱窝的鳞茎) 除去子叶及茎, 根
截取至约 2 cm , 转接到 MS+ 2 0% 蔗糖+ 0 4%
琼脂+ 1 0 g/ L AC 附加不同浓度激素 NAA、GA 3、
IBA 的培养基上进行继代培养, 并分别在接种后
10、20、30、40 d 测量无菌苗的根长。
2 3 鬼臼毒素标准曲线的制作:用电子天平精密称
取鬼臼毒素对照品 10 00 mg (质量分数&98%,
Sigma, CAS: 518285) , 用无水乙醇溶解并定容至
10 mL, 充分摇匀, 即得浓度为 1 0 mg/ mL 的对照
品母液, 然后利用梯度稀释法分别配制不同浓度
( 0 000 1, 0 001, 0 01, 0 10, 1 00 mg / mL) 的鬼臼
毒素对照品溶液。利用 HPLC 法进行回归曲线的
制作。H PLC 色谱条件: 紫外检波长 292 nm ,流动
相甲醇水 ( 90∋ 10) , 体积流量 1 0 mL/ m in, 进样
量 20 L,柱温 20 ∃ 。色谱柱为安捷伦 ZORBAX
Eclipse XDBC18 ( 150 mm % 4. 6 mm , 5 m)。得到
回归曲线方程 Y = 11 914. 571 6X + 87. 169 916,
r= 0 999 66。说明鬼臼毒素在 0 000 1~ 1 00 mg/
mL 线性关系良好。
2 4 鬼臼毒素的提取与检测: 取桃儿七无菌苗根、
叶(叶柄) ,分别放置在烘箱中 110 ∃ 杀青 30 min,
后再 60 ∃ 下烘干 6 h,准确称取根、叶柄干质量各
2 0 g ,研磨成粉末, 用滤纸盒包好后分别放置在索
氏提取器中, 先用醋酸乙酯冷浸 6 h,然后连续回流
提取 8 h,提取液待用;准确称取桃儿七继代培养后
的培养基 50 0 g, 加适量蒸馏水加热溶化后用醋酸
乙酯进行萃取 (连续萃取 3 次) , 萃取液待用;将桃
儿七根、叶柄提取液及培养基萃取液分别在 80 ∃
下进行减压浓缩去除醋酸乙酯, 待浓缩至少许棕色
液体时,用中压柱色谱进行洗脱,洗脱液经浓缩后用
无水乙醇定容至 10 mL, 利用 HPLC 法在 292 nm
处检测。
3 结果与分析
3 1 桃儿七无菌苗的诱导
3 1 1 不同激素对无菌苗诱导的影响:在利用桃儿
七成熟胚进行无菌苗诱导过程中, 通过在 MS+
2 0% 蔗糖+ 0 4% 琼脂基本培养基上分别添加不
同浓度 0 2、0 6、1 0 mg/ mL 的 GA 3、NAA、6BA,
以不添加激素作为对照,考察其对成熟胚无菌苗诱
导的影响,结果见图 2,在成熟胚培养 20 d 后,对照
的诱导率为 32 99% ;添加 GA 3的诱导率随着浓度
的增加而提高,在 1 0 mg/ mL 时诱导率达到最大,
86 73% ;添加 NAA 的诱导率在 0 6 mg/ mL 时相
对于 0 2、1 0 mg / mL 处理显著提高, 为 62 65%;
添加 6BA 的诱导率随着浓度的增加而降低, 在
0 2 mg/ mL 时诱导率仅 46 95%。以上表明,添加
1367中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
适当外源激素对于提高成熟胚无菌苗的诱导率具有
促进作用, 在 GA 3、NAA、6BA 3 种激素处理中,
GA 3对于提高无菌苗诱导率效果较好, 以 1 0 mg/
mL 最为显著。
不同字母表示 Duncan(s新复极差检验在 0 05水平上差异显
著;下同
Dif ferent let ters represent sign ificant diff erence at P < 005
by Dun can(s test ; Same as below
图 1 不同激素对桃儿七无菌苗诱导率的影响
Fig. 1 Effect of diff erent hormones on induction
rate of S. emodi seedling
3 1 2 活性炭对无菌苗诱导及生长的影响: 在
MS+ 2 0% 蔗糖+ 0 4% 琼脂+ 1 0 mg / mL GA 3
的培养基上,通过添加不同浓度 A C 0 1、0 5、1 0、
2 0、4 0 g/ L ,以不添加作为对照, 考察 AC 对无菌
苗诱导及生长的影响。在成熟胚培养 20 d 后,进行
观察统计, 结果见图2, 在0 1~ 2 0g/ L ,无菌苗的
诱导率随着 AC 浓度的增加而逐渐提高, 为
88 67%~ 96 59% ,相对于对照 86 73% 均有所提
高, 其中以 1 0、2 0 g/ L 诱导率较高, 分别为
92 00%、96 59%, 但是 2 0 g / L 的 AC 不利于无菌
+ + + 、+ + 、+ 、- 分别代表无菌苗的生长势优、良、中、差
+ + + , + + , + , - repres ent seedling grow th potent ial
ex cel lent , good, moderate, and poor, respect ively
图 2 活性炭对桃儿七无菌苗诱导率及生长势的影响
Fig. 2 Ef fect of diff erent AC concentration on induction
rate and growth potential of S. emodi seedling
苗的生长,其生长势中等,而 1 0 g / L 的呈现出优秀
的生长势; 当 AC 浓度为 4 0 g/ L 时,无菌苗诱导率
显著下降, 仅为 82 32%, 且生长势差。以上表明,
在 1 0 mg/ mL GA 3的基础上,添加 1 0 g / L AC 不
仅有利于提高无菌苗的诱导率, 而且有利于无菌苗
的生长发育 (图 3)。
3 2 桃儿七无菌苗的继代中不同激素对根生长的
影响:在 MS+ 2 0% 蔗糖+ 0 4% 琼脂+ 1 0 g / L
AC 的培养基上, 通过添加不同浓度 ( 0 1、0 5、1 0、
2 0 mg/ mL) 激素 NAA、GA 3、IBA, 以不添加外源
激素作为对照,考察外源激素对继代桃儿七生长和
发育的影响。结果见图 4。不同浓度激素处理相对
于对照对继代桃儿七根的生长和发育均有不同程度
的促进作用。在不添加外源激素的培养基上培养
40 d 后,根在原来的基础上增长 1 63 cm; 在添加不
1~ 8分别表示桃儿七成熟胚在第 5、10、15、20、25、35、40、45 天的生长发育情况,图中箭头 7, 8分别表示
桃儿七根部抱窝鳞茎的膨大及鳞茎发育而来的幼苗
1 8sh ow ed gr ow th an d developm ent on day 5, 10, 15, 20, 25, 35, 40, and 45, respect ively
Black arr ow s in 7 and 8 show ed rhiz om e began to ex pand and th ree leaves plant let s indu ced f rom r hizome bu lbs
图 3 不同生长时期桃儿七生长发育情况
Fig. 3 Characteristics of growth and development of S. emodi in vitro at diff erent stages
1368 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
同浓度的 NAA 培养基上, 随着培养时间的延长,
低浓度处理对根的伸长( 0 1mg / mL、0 5mg / mL)
呈现出促进作用, 在培养 40 d 后, 根长分别为
6 23、6 85 cm, 而高浓度处理 ( 1 0、2 0 mg/ mL)
则呈现出一定程度的抑制作用;添加不同浓度 GA 3
的培养基, 随着浓度的增加,总体呈现出促进作用,
其中以添加 1 0 mg/ mL 效果较好, 40 d 后根长为
8 12 cm ;添加不同浓度 IBA 的培养基上,其促进根
伸长的趋势与 GA 3相似, 其中以添加 1 0 mg/ mL
效果最为显著, 1 0 mg/ mL IBA 在不同时期 ( 10、
15、20、25、30、35、40 d) 对继代桃儿七生长与发育
的状况见图 5。培养 40 d后,根长达 11 59 cm。综
上所述,在促进继代桃儿七根的生长和发育方面,添
加外源激素 IBA 较 GA 3、NAA 及对照效果显著,
其中以添加 1 0 mg/ mL 效果最为显著。
3 3 不同部位及不同时期鬼臼毒素量的变化
通过利用 H PLC 法测定继代桃儿七根在
MS+ 2 0% 蔗糖 + 0 4% 琼脂 + 1 0 mg / mL
IBA+ 1 0 g/ L AC 培养基中不同生长时期 10、20、
30、40、50 d 根、叶 (叶柄) 及培养基中鬼臼毒素的
量,结果见表 1。随着桃儿七的生长发育, 其根、叶
(叶柄) 及其培养基中的鬼臼毒素积累量逐渐增加,
鬼臼毒素积累量依次为根> 培养基> 叶 (叶柄) ; 在
所测定时期 10~ 50 d内,根、叶 (叶柄) 及其培养基
中的鬼臼毒素积累量均逐渐增加,培养 50 d 后, 鬼
臼毒素的量依次为 33 17、12 97、4 55 g/ mL。以
上表明,根最有利于次生代谢物质鬼臼毒素的积累;
另外,尽管培养基中鬼臼毒素的量显著低于根, 但是
可以证明根在生长发育过程中也将鬼臼毒素释放到
培养基中,这可以在不损伤桃儿七植株的基础上,利
用桃儿七继代培养进行鬼臼毒素的提取。
4 讨论
对于桃儿七组织细胞培养等有关方面的研究,国
内外已有很多研究报道,但多集中在通过愈伤组织诱
导[ 10]、细胞悬浮培养等方法提取生物活性物质鬼臼
毒素[ 11, 13] ,达到解决桃儿七野生资源匮乏的目的。可
1369中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
表 1 不同生长时期桃儿七根、叶 (叶柄) 及培养基中
鬼臼毒素的量
Table 1 Content of podophyllotoxin in root, leaf ( leaf stalk) ,
and cultured medium of S. emodi at different stages
部 位
鬼臼毒素/ ( g mL- 1)
10 d 20 d 30 d 40 d 50 d
根 422# 0 25 a 7 52# 0 07 a 1236 # 023 a 2290 # 014 a 3317# 0 85 a
叶(叶柄) 102# 0 14 b 1 63# 0 23 b 323 # 032 c 402 # 022 c 455# 0 62 c
培养基 131# 0 11 b 3 22# 0 49 b 749 # 022 b 981 # 023 b 1297# 0 38 b
不同字母表示 Duncan(s 试验中的显著性 ( P< 0 05)
Different let ters represent signif icance at P< 0 05 by Duncan(s test
能由于桃儿七自身遗传特性或生长条件苛刻等原因,
使得其外植体在愈伤组织诱导、细胞悬浮培养等方面
存在着分化难度大、增殖缓慢、易褐化等困难,目前均
未获得增殖快、抗褐化和生长稳定的细胞系。
而通过利用桃儿七成熟胚进行无菌苗的诱导,
在无菌苗的基础上进行根茎的快速增殖, 进而利用
根茎及培养液进行鬼臼毒素提取这一途径的研究还
未见报道。本研究在前期桃儿七种子休眠特性 [ 14]
和桃儿七成熟胚分离培养 [ 15]研究的基础上,通过进
一步优化外源植物激素及 AC 的浓度,结果表明在
1 0 mg / mL GA 3的基础上,添加 1. 0 g / L AC 最有
利于提高无菌苗的诱导率及无菌苗的生长发育, 其
诱导率为 92 00%, 并且在培养 45 d 后, 无菌苗基
部抱窝鳞茎出能发育出无菌植株。这与 Rekha
等[ 16]研究发现的 GA 3在加速桃儿七栽培植株生长
发育方面的结果是一致的;另外,由于 AC 在培养过
程中能给特定的外植体提供一个比较适宜的环
境[ 1718] ,这也是桃儿七无菌苗诱导率高、根生长快的
又一重要因素。Yang 等 [ 19]、Ber ta 等 [ 20] 研究表明
IBA 有益于植株根茎增殖及生长发育,本实验通过
在桃儿七根切除后对根茎进行继代培养, 其中在培
养基中以添加 1 0 mg/ mL IBA 效果最好, 相对于
其他处理更有利于促进桃儿七根的生长和发育, 在
继代培养 40 d 后,其根长可达 11 59 cm,说明 IBA
在桃儿七根切除创伤后, 对于根茎的继续生长及植
株发育是有益的。
通过对桃儿七不同部位、不同培养时期进行鬼
臼毒素的提取及 HPLC 法检测,发现随着桃儿七的
生长发育, 其根、叶 (叶柄) 及其培养基中的鬼臼毒
素积累量逐渐增加, 培养 50 d 后,鬼臼毒素的量依
次为 33 17、12 97、4 55 g / mL。U den 等 [ 21]、
Chat topadhyay 等[ 11] 分别对桃儿七进行细胞悬浮培
养,在培养 15、21 d 后, 其鬼臼毒素的量分别为
24 3、48 8 g/ mL。Purohit 等[ 22] 对桃儿七野生植
株进行鬼臼毒素的提取与检测,其量在 4% ~ 6%。
尽管利用桃儿七组织细胞培养的方法获取鬼臼毒素
的量显著低于野生桃儿七植株, 但是相比桃儿七自
然条件下发育缓慢、资源匮乏而言,组织细胞培养具
有生长周期短、保护野生资源的优点。
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1370 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月