全 文 ：HPLC2系统内标法测定桂枝汤中芍药苷、甘草苷、
肉桂酸、桂皮醛和甘草酸
柏 　冬1 ,3 ,范 　斌2 ,牛晓红2 ,宋剑南3 3 ①
(11 北京中医药大学 ,北京 　100029 ; 21 中国中医科学院医学实验中心 ,北京 　100700 ;
31 中国中医科学院中医基础理论研究所 ,北京 　100700)
摘 　要 :目的 　建立同时测定桂枝汤中多个有效成分的系统内标方法 ( SIS) 。方法 　以桂枝汤中芍药苷为内标 ,测
定芍药苷与甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸之间的相对校正因子 ,利用该相对校正因子计算甘草苷、肉桂酸、桂皮
醛和甘草酸 ,并与外标一点法 (ACV)测定结果进行比较 ,以验证方法的准确性和可行性。结果 　ACV 与 SIS 测定
5 批桂枝汤中的 5 种成分的结果无显著差异 ( P > 0. 05) ,可以准确测定桂枝汤中 5 种成分。结论 　SIS 方法既能同
时测定中药中多个成分的量 ,又能简化实验操作 ,有望成为适合中药特点的多指标质量评价新模式。
关键词 :桂枝汤 ;系统内标法 (SIS) ;高效液相色谱法 ;多指标测定
中图分类号 :R286. 02 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0320387204
Determination of paeoniflorin , l iquiritin , cinnamic acid , cinnamic aldehyde , and glycyrrhizic
acid in Guizhi Decoction by HPLC mehod with sample’s internal standard
BA I Dong1 ,3 , FAN Bin2 , N IU Xiao2hong2 , SON G Jian2nan3 3
(1. Beijing University of Traditional Chinese Medicine , Beijing 100029 , China ; 2. Medical Experiment Center , China
Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences , Beijing 100700 , China ; 3. Institute of Basic Theory ,
China Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences , Beijing 100700 , China)
Abstract : Objective 　To establish a new content determination met hod , sample′s internal standard ,
based on simultaneous determination of five component s in Guizhi Decoction by H PL C under multiple UV
wavelengt hs1 Methods 　Peoniflorin in Guizhi Decoction was chosen as t he internal standard , and t he relat2
ed correction factors of liquiritin , cinnamic acid , cinnamic aldehyde , and glycyrrhizic acid compared wit h
peoniflorin were measured. The content s of t hese four component s could be calculated by t he related
correction factors. This met hod was named to be‘sample′s internal standard’( SIS) . The met hod was
evaluated by comparison of t he quantitative result s between angle cosine value (ACV) and SIS met hod1
Results 　No significant differences were found in t he quantitative result s of t he five component s in five
batchs of Guizhi Decoction by ACV and SIS met hods ( P > 0. 05)1 Conclusion 　The SIS method not only
can determine multiple index in Chinese materia medica ( CMM) simultaneously , but also be simple and
accurate. It will be a good quality evaluation pat tern for CMM1
Key words : Guizhi Decoction ; sample′s internal standard (SIS) ; H PL C ; multiple index determination
　　中药成分测定发展的趋势是多指标测定[1 ,2 ] ,
但传统多指标测定方法存在着对照品消耗量大 ,操
作复杂、繁琐、易导致误差的缺陷。为此 ,本实验在
前期建立的多波长 HPL C 法同时测定桂枝汤中 5
种有效成分的基础上 ,参考“一测多评”[ 3～5 ] 和内标
多控[ 6 ] 测定方法 ,建立了使用一种对照品同时测定
样品中多个有效成分的“系统内标”(SIS)测定方法。
本法改进了“一测多评”法的不足之处 ,且在本实验
中对该方法的系统适应性进行了探讨 ,尝试建立一
种既能反映中药有效成分多样化 ,又能降低对照品
的使用数量 ,减少误差 ,提高测定结果准确性的测定
方法。
·783·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
①收稿日期 :2009206218　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30572334)
作者简介 :柏　冬 (1983 —) ,男 ,安徽人 ,博士研究生 ,研究方向为药物分析。Tel : (010) 6401441122505 　E2mail :abai2000 0 @163. com3 通讯作者　宋剑南　E2mail :sjn2003 @sina. com
1 　仪器与试药
　　Agilent 1100 HPL C (四元泵、自动进样器、
DAD 检测器) ; Agilent 1200 H PL C 高效液相色谱
仪 (四元泵、自动进样器、DAD 检测器 ) ; MILL I2
PORE Simplicity 超纯水器。
　　乙腈为色谱纯 ,其他试剂均为分析纯。芍药苷、
甘草苷、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸对照品均购至中国
药品生物制品检定所 ,供定量测定用。桂枝、炒白
芍、炙甘草、大枣、生姜均购自北京同仁堂药店 ,由北
京中医药大学刘春生教授鉴定 ,符合《中国药典》
2005 年版规定。
2 　方法和结果
2. 1 　系统内标法 (SIS) 计算方法[7 ] :利用成分 A 对
照品溶液获得质量浓度 CA 与检测器的响应信号
(峰面积或峰高) Y 之间的回归方程 Y = KA ×CA 及
其线性范围 ( r > 0 . 999 5) , KA 即成分 A 的校正因
子 ,同法获得成分 B 的校正因子 KB 。计算成分 A
与成分 B 之间相对校正因子 : f = KB / KA (公式 1) 。
利用外标法测定样品中成分 A 的质量浓度 Ca (成分
A 为内标) ;通过测定样品中成分 A 与成分 B 的峰
面积 ( A a 、A b ) ,利用校正因子 f 测定样品中成分 B
的质量分数 Cb : Cb = A b / A a ×Ca / f 　(公式 2) 。
2. 2 　系统内标法 (SIS)方法学考察
2. 2. 1 　色谱条件 :色谱柱 Diamond C18 (250 mm ×
4. 6 mm ,5μm) ;流动相 0. 1 %磷酸溶液 ( A)2乙腈
(B) ,梯度洗脱程序依次为 : (0～34 min) A2B (85 ∶
15) , (35～54 min) A2B (62 ∶38) ;体积流量 1. 0
mL/ min ;柱温 25 ℃;检测波长 :230 nm (检测芍药
苷) 、250 nm (检测甘草酸) 、280 nm (检测甘草苷、肉
桂酸、桂皮醛) ,记录全部光谱数据。
2. 2. 2 　对照品溶液的制备 :精密称取对照品芍药苷
12. 5 mg、甘草苷 7. 5 mg、肉桂酸 3. 0 mg、桂皮醛 30
mg、甘草酸 6 mg ,置于同一 50 mL 量瓶中 ,用甲醇
定容 ,配成混合对照品储备液。将储备液用甲醇稀
释成含芍药苷 0. 15 mg/ mL 、甘草苷 0. 09 mg/ mL 、
肉桂酸 0. 036 mg/ mL 、桂皮醛 0. 36 mg/ mL 、甘草酸
0. 072 mg/ mL 的混合对照品溶液。
2. 2. 3 　供试品溶液的制备 :根据处方分别称取炒白
芍 9 g、桂枝 9 g、炙甘草 6 g、生姜 9 g、大枣 3 枚加入
8 倍量的水 ,浸渍 30 min ,煎煮 30 min ,滤过 ,滤液浓
缩定容至 250 mL ,取溶液过 0. 45μm 微孔滤膜 ,作
为供试品溶液。
2. 2. 4 　色谱图 :分别精密吸取混合对照品溶液、供
试品溶液各 10μL 进样 ,在上述的色谱条件下进样
测定 ,色谱图见图 1。芍药苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮
醛和甘草酸分离良好 ,不受其他成分的干扰。
12芍药苷　22甘草苷　32肉桂酸　42桂皮醛　52甘草酸
12paeoniflorin 　22liquiritin 　32cinnamic acid
42cinnamic aldehyde 　52 glycyrrhizic acid
图 1 　混合对照品( A)和桂枝汤( B)的色谱图
Fig. 1 　HPLC Chromatograms of mixed reference
substances ( A) and Guizhi Decoction ( B)
2. 2. 5 　相对校正因子的测定 :将混和对照品储备液
用甲醇稀释 ,得到分别含芍药苷 0. 05、0. 10、0. 15、
0. 20、0. 25 mg/ mL ,甘草苷 0. 03、0. 06、0. 09、0. 12、
0. 15 mg/ mL ,肉桂酸 0. 012、0. 024、0. 036、0. 048、
0. 060 mg/ mL ,桂皮醛 0. 12、0. 24、0. 36、0. 48、0. 60
mg/ mL 和甘草酸 0. 024、0. 048、0. 072、0. 096、0. 12
mg/ mL 的系列质量浓度混合对照品溶液 ,分别进样
10μL ,记录 5 种成分峰面积。利用峰面积对进样量
做直线回归 ,求得芍药苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和
甘草酸线性回归方程 (L 1 、L 2 ) 、相关系数及线性区
间 ,结果见表 1。
表 1 　回归方程、相关系数及线性范围
Table 1 　Regression equation , correlation coeff icient , and linearity range
成 分 　　回归方程 L 1 ( Y = a X + b) 　　回归方程 L 2 ( Y = a X) 线性范围/ ng
芍药苷 Y = 1 . 233 X + 24 . 02 , r = 0 . 999 9 Y = 1 . 238 X , r = 0 . 999 6 500～2 500
甘草苷 Y = 1 . 490 X + 10 . 19 , r = 0 . 999 6 Y = 1 . 503 X , r = 0 . 999 6 300～1 500
肉桂酸 Y = 8 . 833 X - 7 . 63 , r = 0 . 999 9 Y = 8 . 830 X , r = 0 . 999 9 120～600 　
桂皮醛 Y = 2 . 823 X + 1 . 395 , r = 0 . 999 9 Y = 2 . 823 X , r = 0 . 999 9 1 200～6 000
甘草酸 Y = 0 . 865 X - 5 . 924 , r = 0 . 999 9 Y = 0 . 862 X , r = 0 . 999 9 240～1 200
·883· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
　　利用公式 1 计算各成分的 k 及 f (芍药苷为内
标) ,结果见表 2。
表 2 　5 种成分的校正因子及相对校正因子
Table 2 　Correlation factors and related correction
factors of f ive components
成 分 k f
芍药苷 1. 238 1
甘草苷 1. 503 1. 214 1
肉桂酸 8. 830 7. 132 5
桂皮醛 2. 823 2. 280 3
甘草酸 0. 862 0. 696 3
2. 2. 6 　f 的重现性考察 :取 5 种成分的混合对照
品 ,分别考察了两种液相色谱仪 ( Agilent 1100
H PL C 及 Agilent 1200 HPL C) 测定的 f 在同一仪
器、同一天内测定结果 ,不同日期测定结果及不同仪
器之间的重现性 ,结果见表 3。结果表明 , f 在不同
仪器中的重现性良好 (RSD < 3. 0 %) 。
2. 2. 7 　待测成分色谱峰的判断 :系统内标法 ( SIS)
需解决在不使用对照品时如何判断样品中其他 4 个
成分色谱峰的保留时间及该色谱峰是否与其他色谱
峰完全分离。对此本研究通过以下方法解决。
(1)利用各成分的保留时间进行判断 :取同一桂
枝汤供试品溶液 ,考察供试品中 5 种成分在同一色
谱柱 Diamonsil2C18 (250 mm ×4. 6 mm ,5μm) 不同
液相色谱仪 ( Agilent 1100 H PL C 及 Agilent 1200
HPL C)中保留时间及分离度的变化 ,结果见表 4。
结果表明在相同色谱条件下 ,同一色谱柱 ,在不同型
号色谱仪中 5 种成分均得到良好分离 ,且相对保留
时间 tR 基本稳定。
　　取同一桂枝汤供试品溶液 ,比较不同色谱柱
Kromasil C18 (250 mm ×4. 6 mm ,5μm) 、Diamonsil
C18 (250 mm ×4. 6 mm ,5μm) 、Agilent Zorbax SB
C18 (250 mm ×4. 6 mm ,5μm) 在同一色谱仪中 ,该
色谱条件下 5 种成分保留时间及分离度的变化 ,结
果见表 5。结果表明 Kromasil 及 Agilent Zorbax
SB 均能将桂枝汤中 5 种成分良好分离 ,且保留时间
变化不大。但 Kromasil 色谱柱在相同色谱条件下 ,
未能将样品中 5 种成分良好分离。这是因为不同色
谱柱对化合物的分离能力不完全相同 ,因此实验时
需对色谱柱进行考察 ,选择合适的色谱柱[8 ] 。
表 3 　相对校正因子的重现性考察( x ±s , n = 5)
Table 3 　Reproducibility of related correction factors ( x ±s , n = 5)
　　　　　仪　器 f 甘草苷/芍药苷 f 肉桂酸/ 芍药苷 f 桂皮醛/ 芍药苷 f 甘草酸/芍药苷
日内 f 1. 213 ±0. 017 7. 133 ±0. 079 2. 274 ±0. 025 0. 692 ±0. 008
Agilent 1100 RSD/ % 1. 4 1. 1 1. 3 1. 2
日间 f 1. 214 ±0. 021 7. 127 ±0. 091 2. 275 ±0. 031 0. 692 ±0. 013
RSD/ % 1. 7 1. 3 1. 4 1. 9
日内 f 1. 213 ±0. 016 7. 119 ±0. 078 2. 272 ±0. 034 0. 688 ±0. 013
Agilent 1200 RSD/ % 1. 3 1. 1 1. 5 1. 9
仪器之间 RSD/ % 1. 3 1. 1 1. 2 1. 5
表 4 　不同仪器中 5 种成分的保留时间和分离度( x ±s , n = 5)
Table 4 　Relative retention time and resolution of f ive components measured by different instruments ( x ±s , n = 5)
仪　器 芍药苷 甘草苷 肉桂酸 桂皮醛 甘草酸
　　　　　　　tR/ min 16. 1 ±0. 2 31. 7 ±0. 2 44. 1 ±0. 1 48. 4 ±0. 5 54. 4 ±0. 3
Agilent 1100 　分离度 > 3. 2 > 4. 8 > 3. 2 > 2. 8 > 1. 8
　　　　　　　tR/ min 15. 6 ±0. 3 31. 1 ±0. 3 43. 7 ±0. 4 47. 1 ±0. 4 53. 3 ±0. 4
Agilent 1200 　分离度 > 3. 1 > 4. 7 > 3. 0 > 2. 6 > 1. 7
表 5 　不同色谱柱中 5 个成分的保留时间和分离度( x ±s , n = 5)
Table 5 　Relative retention time and resolution of f ive components measured by different columns ( x ±s , n = 5)
色谱柱 芍药苷 甘草苷 肉桂酸 桂皮醛 甘草酸
　　　　　　tR/ min 16. 1 ±0. 1 31. 7 ±0. 12 44. 1 ±0. 1 48. 4 ±0. 2 54. 4 ±0. 3
Diamonsil 　分离度 > 3. 2 > 4. 8 > 3. 2 > 2. 8 > 1. 8
　　　　　　tR/ min 16. 8 ±0. 2 32. 6 ±0. 2 45. 7 ±0. 1 49. 5 ±0. 4 56. 1 ±0. 3
Agilent 　分离度 > 3. 5 > 4. 8 > 3. 8 > 3. 4 > 2. 5
　　(2) 利用各成分色谱峰的紫外吸收光谱进一步
确认 :通过 (1)初步确定各成分的 tR ,再利用各色谱
峰的紫外吸收光谱图进一步确认 ,并判断该色谱峰
是否有其他色谱峰的干扰[9 ] ,见图 2。甘草苷色谱
峰的 tR 为 30～33 min ,通过甘草苷色谱峰不同时间
点紫外光谱图 ,进一步确认 ,且色谱峰质量分数较
好 ,无干扰。桂皮醛、肉桂酸和甘草酸的色谱峰位置
判断及峰纯度检测同甘草苷。
·983·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
图 2 　甘草苷( A) 、肉桂酸( B) 、桂皮醛( C)和甘草酸( D)
色谱峰不同时间点紫外吸收光谱图
Fig. 2 　UV Absorption spectra of liquiritin ( A) , cinnamic
acid ( B) , cinnamic aldehyde ( C) , and
glycyrrhizic acid ( D) at various time points
2. 2. 8 　样品测定 :分别精密吸取供试品溶液、对照
品溶液 10μL 注入高效液相色谱仪测定 ,分别采用
外标一点法 ( ACV) (测定法) 和系统内标法 ( SIS)
(计算法)测定桂枝汤中芍药苷、甘草苷、肉桂酸、桂
皮醛、甘草酸 ,结果见表 6。
　　利用配对 t 检验比较 SIS 和 ACV 实验测定的
结果 ,统计结果表明 , P = 0. 31 > 0. 05 ,两种方法测
得的结果没有显著性差异 ,SIS 可准确测定样品中 5
种成分。
3 　讨论
　　SIS 需要解决两个关键问题 :1) 如何获得稳定、
可靠的 f ;2) 如何对测定成分的峰进行确认。内标
物的选择应符合以下条件 : ①内标物性质稳定 ,容易
获得 ; ②该成分在样品较难以分离 ,尤其是干扰成分
表 6 　外标一点法( ACV)和系统内标法( SIS)测定桂枝汤中 5 种成分的结果
Table 6 　Determination of f ive compounds in Guizhi Decoction detected by ACV and SIS methods
样品
芍药苷/
(mg ·mL - 1)
甘草苷/ (mg ·mL - 1)
ACV SIS
肉桂酸/ (mg ·mL - 1)
ACV SIS
桂皮醛/ (mg ·mL - 1)
ACV SIS
甘草酸/ (mg ·mL - 1)
ACV SIS
1 0. 064 5 0. 065 2 0. 065 2 0. 033 5 0. 033 5 0. 304 6 0. 304 6 0. 055 7 0. 055 7
2 0. 067 7 0. 062 0 0. 061 2 0. 035 2 0. 035 8 0. 309 8 0. 309 6 0. 054 6 0. 054 2
3 0. 065 1 0. 068 4 0. 067 9 0. 032 3 0. 032 1 0. 302 5 0. 302 8 0. 056 3 0. 057 2
4 0. 061 3 0. 062 6 0. 061 5 0. 031 8 0. 032 9 0. 299 4 0. 299 7 0. 053 4 0. 055 1
5 0. 063 2 0. 063 9 0. 063 7 0. 033 8 0. 033 4 0. 300 4 0. 300 5 0. 058 5 0. 059 1
的紫外吸收光谱与其相似 ,如果不使用对照品 ,较难
分辨。文献报道中多采用不同质量浓度对照品溶液
所测得的峰面积与成分质量比值的算术平均值作为
k[3～5 ] 。但由文献可以看成分在不同质量浓度计算
所得的 k 之间有一定误差。本实验利用“最小二乘”
法通过计算回归方程的方法求出 k ,且要求其 r >
01999 5 ,较文献中方法更为合理 ,同时可以限定 k
的使用范围。
对于测定成分色谱峰的判断 ,本方法通过各成
分保留时间初步判断各色谱峰位置 ,再根据各峰的
DAD 紫外吸收光谱图进一步确认。
通过与外标法测定结果相比较 ,证明本方法测
定结果准确 ,既能反映中药有效成分多样化 ,可以降
低对照品的使用数量 ,减少误差 ,提高测定结果的准
确性 ,有望成为适合中药特点的多指标质量评价新
模式。
参考文献 :
[ 1 ] 　丰加涛 ,金　郁 ,王金成 ,等. 基于定量指纹图谱技术的中药质
量控制[J ] . 色谱 ,2008 ,26 (2) :1802185.
[ 2 ] 　中国药典[ S] . 一部. 2005.
[ 3 ] 　王智民 ,高慧敏 ,付雪涛.“一测多评”法中药质量评价模式方法
学研究[J ] . 中国中药杂志 ,2006 ,31 :192521930.
[ 4 ] 　匡艳辉 ,朱晶晶 ,王智民. 一测多评法测定黄连中小檗碱、巴马
汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱含量[J ] . 中国药学杂志 ,2009 ,44
(5) :3902394.
[ 5 ] 　朱晶晶 ,匡艳辉 ,王智民. 一测多评法同步测定人参和三七药材
中多种人参皂苷的含量 [J ] . 药学学报 ,2008 , 43 ( 12) : 12112
1216.
[ 6 ] 　王跃生 ,饶　毅 ,魏惠珍 ,等1 HPLC2“内标”多控法测定四逆散
中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸和新橙皮苷 [ J ] . 中草药 ,
2008 ,39 (9) :131621319.
[ 7 ] 　Sun P , Wang X D , Alquier L , et al . Determination of relative
response factors of impurities in paclitaxel wit h high perform
ance liquid chromatography equipped wit h ult raviolet and
charged aerosol detectors [J ] . J Chromatogr A , 2008 , 1177 :
87291.
[ 8 ] 　谢培山. 中药色谱指纹图谱[ M] . 北京 :人民卫生出版社 ,2005.
[ 9 ] 　李博岩 ,梁逸曾 ,谢培山. 光谱相关色谱及在中药色谱指纹图谱
分析中的应用[J ] . 分析化学 ,2003 ,31 (7) :7992801.
·093· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月