全 文 ：究还发现 ,随处理时间延长 ,5 种化感物质对 3 种酶
活性的影响也有变化 ,但酶活性与处理时间无明显
相关性 ,笔者研究还发现 ,对照处理 3 种酶活性也随
处理时间的延长而变化。张国华等[28 ] 和吴凤芝
等[ 31 ]的研究结果均表明 ,对照组的保护性酶活性会
随处理时间延长而发生明显改变。
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明党参内生真菌种群的生态分布及其诱导子活性研究
江 　曙 ,段金廒 ,陶金华 ,严 　辉 ,郑建兵
①
(南京中医药大学 ,江苏 南京 　210046)
摘 　要 :目的 　研究不同产区、不同生长期明党参内生真菌的种群结构与生态分布 ,以及内生真菌诱导子对明党参
细胞生长与多糖积累的影响。方法 　采用微生物分离、培养与鉴定等生物学方法、植物细胞悬浮培养方法以及统
计分析方法。结果 　从 4 个产地明党参植株中共分离到 8 属 116 株内生真菌 ,其中镰孢属 ( Fusari um L K1 ex
FR1 ) 、地霉属 ( Geot richum L K1 )和链格孢属 ( A lternaria Nees) 为优势种群。随着明党参生长期的不同 ,内生真菌
种群结构出现明显的动态变化。在苗期和孕蕾期 ,内生真菌种群丰富 ,数量较多 ,尤其是在孕蕾期 3 种优势种群的
分离率和分离频率分别达到 30 %和 19 %以上。部分内生真菌种群还具有明显的区域专一性和组织专一性。此
外 ,内生真菌 Fusari um sp1 3 诱导子处理组 ,明党参细胞生长量和多糖量分别比对照提高了 31. 86 %和 38. 01 %。
结论 　明党参内生真菌具有丰富的生物多样性 ,种群结构及分布与其生态环境具有密切的相关性 ,且部分明党参
·121·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
①　　收稿日期 :2009203210
　　基金项目 :江苏省自然科学基金 (B K2007241) ;南京中医药大学青年科学基金 (09XZR19) ;江苏省方剂研究重点实验室资助项目
　　作者简介 :江　曙 ,男 ,博士 ,副教授 ,主要从事微生物与中药品质的相关研究。　E2mail :jiangshu1970 @yahoo. com. cn
内生真菌诱导子对其细胞生长和多糖积累均具有显著的促进作用。
关键词 :明党参 ;内生真菌 ;生态分布 ;诱导子
中图分类号 :R282115 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 01 - 0121 - 05
Ecological distribution and elicitor activities of endophytic f ungi in Cha ngium smyrnioides
J IAN G Shu , DUAN Jin2ao , TAO Jin2hua , YAN Hui , ZH EN G Jian2bing
(Nanjing University of Traditional Chinese Medicine , Nanjing 210046 , China)
Abstract : Objective 　The pop ulation st ructure and ecological dist ribution of endop hytic f ungi in
Changi um sm y rnioi des f rom t he different habitat s and growing p hases , and t he effect s of f ungal elicitor on
the cell biomass and polysaccharide accumulation were st udied in t his paper1 Methods 　The isolation , cul2
t ure , and identification of microorganism , and plant cell suspension cult ure technology were adopted ; And
relative data were analyzed by t he statistical met hods1 Results 　In four p roducing areas , 116 st rains were
isolated and classified into eight genera1 The dominant pop ulations were Fusari um L K1 ex FR1 , Geot ri2
chum L K1 , and A lternari a Nees1 The pop ulation st ruct ure of endop hytic f ungi obviously changed at the
different growing p hases1 Species and quantity of endop hytic f ungi were plentif ul at t he seedling stage and
bud stage , and especially at t he bud stage t he isolation rate and isolation f requency were more t han 30 %
and 19 % , respectively1 Some endop hytic f ungi had the obvious area and tissue specificity1 Compared wit h
the cont rol by adding t he elicitor of Fusari um sp13 , t he yields of cell biomass and polysaccharide were in2
creased to 31. 86 % and 38. 01 % , respectively1 Conclusion 　Endop hytic f ungi in C1 sm y rnioi des have abun2
dant biodiversity1 And t here is close relationship between t he pop ulation st ruct ure and dist ribution of en2
dop hytic f ungi wit h ecological conditions1 And f ungal elicitors could obviously enhance t he yields of cell bi2
omass and polysaccharide of C1 sm y rnioi des1
Key words : Changi um sm y rnioi des Wolff ; endop hytic f ungi ; ecological dist ribution ; elicitor
　　明党参是我国特有的伞形科明党参属的单种属
植物 ,属于国家三级重点保护植物 ,始见于《本草纲目
拾遗》。其药材是《中国药典》收载的常用中药 ,18 世
纪以后逐步形成为江苏道地药材。我国华东地区的
浙、皖、苏为其主产区 ,明党参以根入药 ,具有益气、生
津、润肤、祛痰之功效 ,并有滋补强壮作用 ,现代研究
表明明党参多糖是其主要活性成分之一[1 ] 。近年来 ,
由于人为过度采挖及对生境的破坏 ,使明党参的分布
区和个体数量日益减少 ,其种群呈现明显衰退倾向。
此外 ,明党参自身的生物学特性如种子产量少、幼苗
成活率低、种群自身恢复能力差等原因 ,也是明党参
种群难以扩大而导致濒危的重要原因之一[2 ] 。目前
国内外对于明党参的研究大多集中于生物学特性、遗
传多样性、系统进化、药理药效分析以及外部环境 (气
候因子、光照、土壤、水分)等方面 ,而忽视了明党参植
物体内环境的作用 ,尤其是明党参内生真菌种群结构
与功能的研究均未见报道[3 ,4 ] 。通过研究内生真菌在
明党参植株中的种群结构与生态分布 ,以及内生真菌
诱导子对明党参悬浮培养细胞生长及其多糖积累的
影响 ,从而为后续深入研究内生真菌与明党参的相互
作用奠定基础 ,并为明党参野生种质资源的保护及其
可持续利用探索新的途径。
1 　材料
1. 1 　明党参新鲜植株 :明党参采自江苏南京、江苏
句容、安徽安庆、浙江杭州等地区 ,经南京中医药大
学药学院陈建伟教授鉴定为伞形科植物明党参
Changi um sm y rnioi des Wolff 的新鲜植株。
1. 2 　培养基 :PDA 培养基[5 ] ,内生真菌发酵培养基[6 ] 。
1. 3 　仪器与设备 :培养箱 (BMJ 100 ,上海博讯实业
有限公司) ,高压蒸气灭菌器 ( ML S —3750 ,日本三
洋) ,单人水平垂直两用净化工作台 (SW2CJ21FB ,苏
州净化设备有限公司) 。
2 　方法
2. 1 　内生真菌的分离与纯化 :采集明党参新鲜植株
外植体 (根、茎、叶等) ,用自来水反复冲洗后 ,切割成
小段 ,按下列程序进行表面消毒 : 0. 1 %升汞消毒
5～8 min ,无菌水冲洗 3 次后 ,再用 75 %酒精消毒
20 s ,无菌水冲洗 3 次后 ,将消毒后的外植体剪切成
0. 3～0. 5 cm 小片 ,接种于 PDA 平皿上 ,28 ℃培养
8～10 d ,待样品边缘有菌丝长出 ,切取组织块边缘
·221· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
菌丝继续培养 ,不断转接分离 ,直至纯化。
2. 2 　内生真菌的鉴定 :采用插片培养和点植法 ,对
分离获得的明党参内生真菌进行菌落形态、显微形
态特征的观察、分类鉴定[7 ] 。
2. 3 　统计分析 :选取明党参不同部位的组织块各
200 个 ,进行内生真菌的分离、鉴定和统计分析 ,并
按照以下方法计算分离率和分离频率[ 8 ,9 ] 。
2. 3. 1 　分离率 (isolation rate , IR) :是指某一类型
内生真菌菌株数占分离样品总数百分率。
2. 3. 2 　分离频率 (isolation f requency , IF) :是指某
一类型内生真菌的菌株数占分离得到的总内生真菌
菌株数的百分率 ,用来判断该类型真菌是否为植物
内生真菌的优势菌群。
2. 4 　明党参细胞悬浮培养体系的建立[10 ] :选取生
长健壮的明党参幼嫩叶柄接种于含有不同植物激素
的 MS 培养基中 ,诱导愈伤组织的形成 ,并选取质地
疏松的愈伤组织约 2. 0 g ,接种于装有 300 mL MS
液体培养基的 1 000 mL 三角瓶中 ,25 ℃,120 r/ min
悬浮振荡培养。5 d 继代 1 次 ,连续继代 2～3 次 ,将
细胞悬浮培养物用 80 目镍网滤过 ,滤液分装后继续
培养 ,作为起始悬浮培养液。
2. 5 　内生真菌诱导子的制备及其对明党参悬浮培
养细胞生长与多糖积累的影响 :将内生真菌接入 50
mL 发酵培养液中 ,28 ℃、200 r/ min 振荡培养 7 d ,
发酵结束后 ,5 000 r/ min 离心 10 min ,分离菌体和
发酵液 ,菌体匀浆后 ,与发酵液混合 ,抽滤 ,将滤液减
压浓缩至 10 mL ,于 121 ℃灭菌 20 min ,得内生菌诱
导子粗提物。在 50 mL 明党参细胞悬浮培养液中
添加 3 mL 内生真菌诱导子粗提物 ,每种处理重复 5
次 ,同时设空白对照 (即添加相应体积的蒸馏水) ,培
养至 21 d 时 ,将细胞培养液进行离心 (5 000 r/ min ,
10 min)后 ,于 60 ℃烘干 ,测定细胞干质量 ;多糖量
测定采用蒽酮2硫酸比色法。对各组处理的细胞干
质量和多糖量分别进行 t 检验 ,确定各处理组与对
照之间是否存在显著或极显著性差异 ,试验结果以Šx ±s 的形式表示。
3 　结果与分析
3. 1 　明党参内生真菌的种群构成 :从明党参植株中
分离获得内生真菌 116 株 ,经菌落形态、显微形态观
察 ,鉴定为 2 纲 ,3 目 ,1 群 ,5 科 ,8 属。明党参内生
真菌的种群组成在目的分类水平上以丛梗孢目
(Moniliales)为优势种群 ,共 93 株 ,占总菌株数的
80. 2 % ; 在属的分类水平上以镰孢属 ( Fusari um
L K1 ex FR1 ) 、地霉属 ( Geot richum L K1 ) 和链格孢
属 ( A lternari a Nees) 为优势种群 ,分别占总菌株数
的 30. 2 %、22. 4 %和16. 4 %(表 1) 。
表 1 　明党参内生真菌的种群构成
Table 1 　Population composition of endophytic
fungi of C1 smyrnioides
纲 目 科 属 菌株数 IF/ %
半知菌 丛梗孢目 瘤座孢科 ( Tubereulariaceae) 镰孢属 35 30. 2
丛梗孢科 (Moniliaceae) 木霉属 8 6. 9
地霉属 26 22. 4
暗梗孢科 (Dematiaceae) 链格孢属 19 16. 4
葡柄霉属 5 4. 3
无孢菌群 丝核菌属 6 5. 2
子囊菌 多腔菌目 痂囊腔菌科 ( Elsinoaceae) 痂囊腔菌属 6 5. 2
曲霉目　 曲霉科 ( Eurotiaceae) 拟青霉属 11 9. 5
3. 2 　明党参不同部位内生真菌种群分析 :明党参不
同组织部位内生真菌的种群分布和数量等方面都存
在一定的差异 ,从其茎中分离到的内生真菌在种类
与数量上较为丰富。明党参根中分布 5 属 28 株内
生真菌 ;茎中分布 6 属 69 株内生真菌 ,叶片中分布
5 属 19 株内生真菌。虽然优势种群在各个部位都
有分布 ,但在不同组织中分布不平均 ,如镰孢属、地
霉属和链格孢属均集中分布于茎中。丝核菌属和拟
青霉属分别在明党参的根部和叶片中具有比较高的
分离率和分离频率 ,也分别是这两个组织部位的优
势种群之一。此外 ,有些种群还存在明显的组织特
异性 ,如丝核菌属 ( R hi z octoni a DC1 ex FR1 ) 仅分
布于根中 ,痂囊腔菌属 ( Elsi noe Racib1 ) 和葡柄霉属
( S tem p hy l i um Wallr1 ) 只在茎中分离得到 ,而拟青
霉属 ( Penici l l iopsis Solms Laubach) 仅存在于叶片
中 (表 2) 。
表 2 　明党参不同部位内生真菌种群分布
Table 2 　Population distribution of endophytic fungi
from different tissues of C1 smyrnioides
属 　名 根
IR/ % IF/ %
茎
IR/ % IF/ %
叶片
IR/ % IF/ %
镰孢属 21. 2 28. 6 58. 6 36. 2 19. 8 10. 5
木霉属 2. 3 7. 1 4. 5 7. 2 1. 6 5. 3
地霉属 11. 7 28. 6 38. 6 23. 2 8. 6 10. 5
链格孢属 10. 6 14. 3 43. 5 18. 8 7. 9 10. 5
葡柄霉属 - - 9. 6 5. 8 - -
丝核菌属 10. 8 21. 4 - - - -
痂囊腔菌属 - - 2. 1 8. 7 - -
拟青霉属 - - - - 36. 1 63. 2
3. 3 　明党参不同生长期内生真菌种群的动态变化 :
在明党参不同的生长期 ,内生真菌种类和数量出现
动态变化 ,分离率及分离频率也随明党参发育的不
同而变化。幼苗期的内生真菌种群及数量都较少 ;
在苗期和孕蕾期 ,内生真菌的种群丰富 ,数量较多 ,
分布普遍 ,尤其是在孕蕾期共分离到 8 属 47 株的内
·321·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
生真菌 ,优势种群镰孢属、地霉属和链格孢属的分离
率均在 30 %以上 ,分离频率均在 19 %以上 (表 3) 。
表 3 　明党参不同生长期内生真菌种群的动态变化
Table 3 　Population dynamic change of endophytic
fungi of C1 smyrnioides at different
growing stages
属 　名 幼苗期
IR/ % IF/ %
苗期
IR/ % IF/ %
孕蕾期
IR/ % IF/ %
果熟期
IR/ % IF/ %
镰孢属 1. 5 40. 0 21. 6 28. 6 41. 8 31. 9 27. 4 27. 3
木霉属 - - 9. 5 9. 5 12. 2 6. 4 10. 3 4. 5
地霉属 1. 6 20. 0 23. 7 21. 4 36. 9 21. 3 21. 6 27. 3
链格孢属 1. 2 20. 0 20. 9 16. 7 35. 6 19. 1 18. 5 9. 1
葡柄霉属 - - 10. 2 7. 1 11. 6 4. 3 - -
丝核菌属 - - 8. 8 4. 8 9. 2 4. 3 9. 5 9. 1
痂囊腔菌属 - - 7. 0 2. 4 7. 2 4. 3 7. 8 13. 6
拟青霉属 0. 8 20. 0 12. 2 9. 5 14. 6 8. 5 12. 8 9. 1
3. 4 　不同产区明党参内生真菌种群分析 :由于受气
候等环境条件的影响 ,不同地区明党参内生真菌种
群分布和数量存在差异。气候条件、生态环境相似
度大的江苏地区 ,内生真菌种群和数量分布基本相
似。优势种群种类和数量以江苏地区最为丰富 ,部
分内生真菌具有一定的地域专一性 ,如痂囊腔菌属
内生真菌仅分布于江苏地区 ,而浙江杭州地区却未
分离到丝核菌属的内生真菌 (表 4) 。
表 4 　不同产区明党参内生真菌种群分析
Table 4 　Population comparison of endophytic fungi
of C1 smyrnioides from different habitats
属 　名 江苏南京菌株数 IF/ %
江苏句容
菌株数 IF/ %
安徽安庆
菌株数 IF/ %
浙江杭州
菌株数 IF/ %
镰孢属 12 33. 3 11 33. 3 7 28. 0 5 22. 7
木霉属 2 5. 6 1 3. 0 3 12. 0 2 9. 1
地霉属 9 25. 0 7 21. 2 5 20. 0 5 22. 7
链格孢属 5 13. 9 5 15. 2 5 20. 0 4 18. 2
葡柄霉属 - - - - 2 8. 0 3 13. 6
丝核菌属 2 5. 6 3 9. 0 1 4. 0 - -
痂囊腔菌属 3 8. 3 3 9. 0 - - - -
拟青霉属 3 8. 0 3 9. 0 2 8. 0 3 13. 6
合计 36 100 33 99. 7 25 100 22 99. 9
3. 5 　内生真菌诱导子对明党参悬浮培养细胞生长
及其多糖积累的影响 :通过在明党参细胞培养液中
添加不同内生真菌诱导子 ,考察其对细胞生长与多
糖积累的影响。从表 5 得知明党参内生真菌种群中
已筛选到 7 株内生真菌 ,其诱导子对明党参细胞生
长和多糖的合成均具有一定的促进作用 ,其中以
Fusari um sp12、Fusari um sp13 和 A lternari a sp12
诱导子对明党参细胞作用的效果较好 ,尤其是 Fu2
sari um sp13 诱导子处理组 ,明党参细胞生长量和多
糖量分别比对照提高了 31. 86 %和 38. 01 %。此外 ,
与对照组相比较 ,5 组处理差异分别达到了显著和
极显著水平 (表 5) 。
表 5 　内生真菌诱导子对明党参悬浮培养细胞生长
及多糖积累的影响( …x ±s , n = 5)
Table 5 　Effects of endophytic fungal elicitors on cell growth
and polysaccharide accumulation of C1 smyrnioides
in suspension culture ( …x ±s , n = 5)
菌　株 细胞/ (mg ·L - 1) 多糖/ (mg ·L - 1)
Fusarium sp1 1 1 079. 88 ±32. 98 38. 08 ±0. 33
Fusarium sp1 2 1 298. 75 ±41. 41 3 3 46. 78 ±2. 25 3 3
Fusarium sp1 3 1 371. 89 ±27. 31 3 3 51. 63 ±2. 91 3 3
A lternaria sp11 1 065. 75 ±33. 79 33. 99 ±0. 61
A lternaria sp12 1 314. 43 ±41. 55 3 3 47. 69 ±2. 02 3 3
Geot richum sp1 1 106. 29 ±30. 94 3 3 41. 98 ±1. 33 3 3
Rhizoctonia sp1 1 085. 78 ±19. 03 3 39. 42 ±0. 98 3
对照　　　　 1 040. 44 ±27. 17 37. 41 ±0. 79
　　与对照组比较 : 3 P < 0. 05 　3 3 P < 0. 013 P < 0. 05 　3 3 P < 0. 01 vs cont rol group
4 　讨论
4. 1 　明党参内生真菌种群结构与生态分布的研究 :
植物内生真菌是植物体内环境的重要组成部分 ,其
与宿主植物在长期共进化过程中 ,形成了密切的互
惠共生关系[11 ,12 ] 。本实验表明 ,明党参内生真菌种
群具有丰富的生物多样性 ,生态分布广泛。部分内
生真菌具有明显的区域专一性和组织专一性 ,并随
着明党参不同的生长发育期而出现动态变化。这是
由于在不同的地理位置 ,温度、湿度、光照等气候条
件的差异 ,影响内生真菌对明党参的感染、定殖和生
长 ,因此内生真菌种群分布和数量表现出一定的地
域专一性 ,相同生境下的植物内生菌分布具有一定
的相似性等特点。如 Murali 等[13 ] 发现不同生境中
的柚木内生真菌种群结构差异较大 ,粪壳菌 ( S or2
dari a sp1 ) 、刺盘孢霉 ( Col letot richum sp1 ) 仅仅定
殖于潮湿气候条件下的柚木树中 ,而胶孢炭疽菌
Col letot richum gloeos porioi des 只存在于干燥气候
条件下的柚木树中 ,虽然拟茎点霉 ( Phomopsis sp1 )
和叶点霉 ( Phy l lost ict a sp1 ) 是两种生态环境下的
优势种群 ,但定殖率却存在差异 ,前者在潮湿落叶林
中分布数量较多 ,定殖率较高 ,后者在干燥落叶林中
分布数量较多 ,定殖率较高。内生真菌在明党参不
同组织中的种群分布差异明显 ,具有一定的组织专
一性 ,其原因除了植物体外环境因素的影响外 ,还可
能是由于宿主不同部位 (或组织)微环境的影响。如
Verma 等[14 ] 系统研究了植物印度苦楝 A z a2
di racht a i ndica A1 J uss 树皮、茎以及叶片部位内生
真菌的分布规律 ,发现内生真菌在叶片中的种类最
多 ,定殖率最高。此外 ,在明党参不同的生长发育
期 ,其体内的生理状态可能不同 ,代谢存在一定的差
异 ,在气温较高、日照较长的月份 ,光合作用较强 ,能
·421· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
合成较多的营养物质 ,并且从幼苗期到果熟期 ,气温
逐步升高 ,这些变化都有利于内生真菌的生长繁殖。
在明党参生长发育的前期主要是进行营养生长 ,植
物体与内生真菌之间存在竞争营养物质的可能 ,而
后期主要进行生殖生长 ,营养物质储备相对充足 ,所
以在明党参的幼苗期种群丰富度较低 ,数量较少 ,而
后期内生真菌种群丰富 ,数量较多。
4. 2 　内生真菌诱导子对明党参悬浮培养细胞生长
及其多糖积累的影响 :近年来 ,研究发现内生真菌能
够产生一类能够引起植物细胞合成和积累次生代谢
产物的活性物质 ,称之为内生真菌诱导子 (elicitor) 。
作为一种特定的化学信号 ,在植物与微生物的相互
作用中 ,它们可以快速、专一和有选择地诱导植物代
谢过程中特定基因的表达 ,促进植物中次生代谢产
物的积累[15 ] 。目前 ,内生真菌诱导子在药用植物中
的应用十分广泛 ,尤其是在细胞悬浮培养和毛状根
培养方面 ,主要集中于真菌诱导子对药用植物生物
碱、萜类、皂苷等天然产物的诱导。如分离于长春花
的内生真菌可诱导长春花碱的合成和积累 ,产量比
对照提高了 2～5 倍[16 ] 。在本研究中 ,发现 5 株内
生真菌诱导子对明党参细胞生长及其多糖积累具有
显著和极显著的影响。在后续研究中 ,将进一步探
讨诱导子的作用效果与诱导子浓度、诱导子加入时
间、诱导时间长短等多种因素的相关性以及相关的
诱导机制 ,从而为研究内生真菌诱导子促进明党参
活性成分积累的机制奠定基础 ,也为研究药用植物
次生代谢的调控提供新的思路。
因此 ,通过分析明党参内生真菌种群结构与生态
分布的动态变化规律 ,以期阐明不同内生真菌优势种
群在明党参生长发育的不同阶段所产生的不同作用 ,
从而有助于从内生真菌的角度揭示明党参品质的形
成机制 ,对于明党参野生资源的保护及其药材的优质
高效栽培均具有重要的指导意义和应用前景。
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《中草药》杂志列中文核心期刊中国医学类第一位
中国医学类核心期刊表
序号 刊 　名 　　 序号 刊 　名 　　
1 　中草药 11 　针刺研究
2 　中国中药杂志 12 　中药新药与临床药理
3 　中国中西医结合杂志 13 　南京中医药大学学报
4 　中国针灸 14 　中国实验药剂学杂志
5 　中成药 15 　辽宁中医杂志
6 　北京中医药大学学报 16 　时珍国医国药
7 　中药材 17 　中医杂志
8 　中国中医基础医学杂志 18 　新中医
9 　中药药理与临床 19 　中国中西医结合急救杂志
10 　中华中医药杂志 20 　中国天然药物
　　　　摘自《中文核心期刊要目总览》2008 年版 (第五版)
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