全 文 ：参考文献:
[ 1] Devi R, Sh arma D K H ypol ipidem ic ef fect of dif f erent ex
t ract s of Cler od end ron cole br ookianum Walp in norm al and
h igh fat diet fed rat s [ J ] J Ethnop har macol , 2004, 90: 63
68
[ 2] M enon V P, Sudh eer A R Ant ioxidant and ant i inflamm ato
ry properties of cu rcumin [ J] A dv E xp Med Biol , 2007,
595: 105125
[ 3] 余美荣, 蒋福升, 丁志山 姜黄素的研究进展 [ J] 中草药,
2009, 40( 5) : 828831
[ 4] Aggarw al B B, Sundaram C, Malani N, e t al . Cur cumin: th e
Indian solid g old [ J] Ad v Ex p Med B iol , 2007, 595: 175
[ 5] 谌 辉, 张景辉, 刘文琪 姜黄素抗血吸虫病肝纤维化及其
机制的实验研究 [ J] 中草药, 2009, 40( 8) : 12741277
[ 6] Zh ang Y, Xie M L, Zhu L J , et al . T herapeut ic ef fect of
osthole on hyperlipidemic fat ty liver in rat s [ J] Ac ta Phar
macol S in , 2007, 28: 398403
[ 7] 倪鸿昌, 李 俊, 金 涌, 等 大鼠实验性高脂血症和高脂
血症性脂肪肝模型研究 [ J] 中国药理学通报, 2004, 20
( 6) : 703706
[ 8] 任永丽, 徐宗佩, 梁汝圣, 等 姜黄素防治脂肪肝家鸭模型
的量效关系及安全性的研究 [ J] 辽宁中医杂志, 2008, 35
( 11) : 17351755
[ 9] Rector R S, Th yfault J P, Wei Y Z, et al . Nonalcoholic fat
ty li ver disease and the m etab ol ic syndrome: An update [ J ]
Wor ld J Gast roente rol , 2008, 14: 185192
蒺藜皂苷后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用
李 蓥,宋宏宇, 张羽冠,于丽芳,张 爽, 李 红* ,杨世杰
(吉林大学白求恩医学院 药理学系,吉林 长春 130021)
摘 要:目的 探讨蒺藜皂苷 ( GSTT ) 后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法 56 只大鼠随机分
为假手术组、缺血再灌注模型组、缺血后处理组、阳性药尼可地尔 1 0 mg / kg 组、GSTT ( 100、30、10 mg/ kg ) 组。
采用结扎大鼠心脏左冠状动脉前降支的方法,制备心肌缺血再灌注损伤模型,分离血清,采用分光光度法测定乳酸
脱氢酶 ( LDH)、丙二醛 ( MDA ) 水平和超氧化物歧化酶 ( SOD ) 的活性, ELISA 法测定血清中肿瘤坏死因子
( TNF) 和白细胞介素6 ( IL6) 的量。光学显微镜下观察受损心肌病理组织学改变, 采用 T UNEL 法检测心肌
细胞凋亡情况。结果 与模型组比较, GSTT 100、30 mg / kg 组 LDH、MDA、T NF和 IL6 的量明显降低、SOD 的
活性明显升高 (P< 0 01) ,凋亡细胞数量明显减少 ( P < 0 01) , 心肌组织形态明显改善。结论 再灌注同时 ip
GSTT 进行药物后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,能减少自由基生成,抑制心肌细胞凋亡。
关键词:蒺藜皂苷; 心肌缺血再灌注损伤; 缺血后处理; 药物后处理
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 08132604
蒺藜皂苷 ( GSTT ) 是蒺藜的有效成分,主要包
括螺甾醇和呋甾醇两类。研究发现, GSTT 具有降
血压,调血脂, 降血糖,抗动脉粥样硬化, 阻止动脉、
心肌和肝脏的脂质沉着, 改善血液流变学指标,抗缺
氧,抗衰老和增强性功能,舒张血管,抗心肌缺血再
灌注损伤及脑缺血再灌损伤等作用 [ 14]。目前对其
的研究多在预适应方面, 其对缺血后处理的作用尚
未见报道。本研究旨在观察在体情况下, 再灌注同
时 ip GST T 进行药物后处理,探讨其对大鼠心肌缺
血再灌注损伤的保护作用, 为临床治疗心肌缺血再
灌注损伤提供理论依据。
1 材料与方法
1 1 药品、试剂与仪器:蒺藜皂苷 ( GST T) 由吉林
敖东洮南药业股份有限公司提供, 质量分数> 90% ;
乌拉坦,中国医药集团上海化学试剂公司; 尼可地
尔,购自长春大政国际经贸集团制药有限公司; 乳酸
脱氢酶 ( LDH )、超氧化物歧化酶 ( SOD)、丙二醛
( MDA) 检测试剂盒, 均购自南京建成生物工程研
究所; 肿瘤坏死因子( TNF) 及白细胞介素6
( IL6) 试剂盒 ( R& D, 200908)。TECAN A 5082
酶标仪, Aust ria; 恒温水浴箱, 北京医疗设备厂;
6010 紫外分光光度计, 安捷伦上海分析仪器厂;
LDZ4 1 8 型低速自动平衡离心机,北京雷勃尔离
心机有限公司。
1 2 动物:清洁级 Wistar 大鼠, 体质量 200~ 220
g ,雌雄兼用,由吉林大学白求恩医学院实验动物中
心提供,合格证号: SCXK (吉) 20070003。
1 3 模型制备: Wistar 大鼠, 以 20% 乌拉坦 ( 5
mL/ kg ) ip 麻醉,仰卧位固定, 切开气管, 用动物呼
吸机机械通气, 参数为: 呼吸频率 75 次/ m in, 潮气
1326 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 20100310 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30472020, 30672654) ; 高校博士点基金资助项目 ( 2005183129)作者简介:李 蓥( 1988 ) ,女,吉林长春人。Tel: 13029117908 Email: jes sica_li_ok@ 126. com
* 通讯作者 李 红 T el: ( 0431) 85619483 Email: lhong@ jlu . edu. cn jcyaol i@ sina. com. cn
量 9 mL/ kg, 呼吸比 1! 2。四肢皮下接心电图机,
稳定 5 min 后, 记录一段正常心电图作为对照。于
胸骨左侧 2 mm 切开皮肤,在第四肋间隙用眼科剪
向下分离肋间肌,向上伸入血管钳夹闭两侧肋间肌
以减少出血。剪断 3、4 肋骨,用拉钩拉开胸壁, 在
两侧胸壁肌肉分别穿一双线留小圈在内侧。小心剪
开心包膜, 暴露心脏。以左冠状静脉主干为标志, 在
左心耳下缘 3~ 4 mm 处以缝合针进针,斜向右上方
肺动脉圆锥方向出针。待呼吸平稳 10 min 后收紧结
扎线,压迫左冠状动脉前降支。冠状动脉结扎 30 min
后轻拉松结扎线, 恢复血液灌注。分别在正常状态
下,穿线及结扎后测量心电图,以确定模型成立。
1 4 实验分组: 56 只大鼠随机分成 7 组, 每组 8
只,分别为假手术组: 冠状动脉下穿线不结扎, 缺血
再灌注模型组: 缺血 30 m in, 再灌 120 min, 缺血后
处理组: 缺血 30 min,再灌 30 s, 缺血 30 s, 反复 3
次,再灌 120 m in, GST T ( 100、30、10 mg/ kg ) 组:
缺血 30 min,再灌 120 min,再灌起始时分别 ip GSTT
100、30、10 mg/ kg, 尼可地尔组: 缺血 30 min, 再灌
120 min,再灌起始时 ip尼可地尔 1 mg/ kg。
1 5 血清生化指标测定:于再灌注结束时经腹主动
脉取血, 3 000 r/ min 离心 10 m in,分离血清。按试
剂盒说明书采用分光光度法检测血清 MDA、LDH
水平及 SOD 活性。
16 TNF与 IL6的测定:于再灌注结束时经腹主
动脉取血, 3 000 r/ min 离心 10 min, 分离血清, 按
ELISA 试剂盒说明书检测血清 TNF与 IL6 水平。
1 7 病理组织切片测定:再灌注结束后迅速摘取心
脏,置于 4% 多聚甲醛中固定过夜。心尖上约 3
mm 处纵向切取左室心肌约 0 3 cm ∀ 0. 5 cm。进
行常规石蜡包埋,切片,染色, 梯度乙醇脱水, 二甲苯
透明,中性树脂封片,光镜观察。
1 8 心肌组织凋亡检测 ( TU NEL 法) :心肌组织
切片常规脱蜡水化, 按试剂盒操作说明进行
TU NEL 染色,成色反应后, 常规脱水, 二甲苯透明,
中性树胶封片。光镜下观察细胞核中有棕黄色颗粒
者为 TU NEL 阳性细胞, 在 400 ∀ 显微镜下, 于缺血
处心肌组织随机采集 5个非重叠视野, 检测 100 个
心肌细胞中 TUN EL 阳性细胞数,取其平均值。
1 9 统计分析:实验结果以 x # s 表示,采用 SPSS
10 0 统计软件对实验数据进行方差分析。
2 结果
2 1 对血清生化指标的影响: 与假手术组比较, 模
型组血清 MDA、LDH 水平明显升高, SOD 活性明
显降低 ( P < 0 01) ; 与模型组比较, GSTT 100、30
mg/ kg 和缺血后处理组血清 MDA、LDH 水平降
低, SOD 活性明显升高 ( P< 0 05、0 01)。结果见
表 1。
2 2 对 T NF与 IL6水平的影响:与假手术组比
较,缺血再灌注大鼠血清中 TN F与 IL6 水平明
显升高。与模型组比较, GST T 100、30、10 mg/ kg
对 T NF及 IL6 分泌均有明显抑制作用 ( P<
0 01) , 结果见图 1。
表 1 GSTT 对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清 LDH、MDA、
SOD 水平的影响 ( x# s, n= 8)
Table 1 Ef fect of GSTT on LDH, MDA, and SOD levels
in serum of myocardial ischemiareperfusion
injured rats (x # s, n= 8)
组别 剂量 / ( mg kg- 1 )LDH/ (U mL- 1) SOD/( U mL- 1) MDA/ ( mo l L - 1)
假手术 - 3 48# 0 48 17103# 21 99 0 89 # 025
模型 - 4 62# 0 21 ∃ 10185# 25 85 ∃ 10 53 # 215 ∃
缺血后处理 - 4 02# 0 20* 13966# 20 81* * 3 31 # 102* *
GST T 100 3 44# 0 49* * 15140# 5 17* * 2 15 # 056* *
30 3 96# 0 31* 13538# 10 88* * 6 37 # 098* *
10 4 13# 0 16 12537# 17 26 8 48 # 111
尼可地尔 1 3 83# 0 29* * 14919# 7 16* * 5 55 # 177* *
与假手术组比较: ∃P < 0 05
与模型组比较: * P < 0 05 * * P < 0 01
∃P < 0 05 v s Sham group
* P < 0 05 * * P< 0 01 v s m odel group
与假手术组比较: ∃ P< 0 05; 与模型组比较: * * P < 0 01
∃P < 0 05 v s Sham group; * * P < 0 01 v s model group
图 1 GSTT对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清 TNF
和 IL6 水平的影响 ( x# s, n= 8)
Fig. 1 Ef fect of GSTT on TNF and IL6 levels in serum
of myocardial ischemiareperfusion injured rats
(x # s, n= 8)
2 3 对心肌组织病理形态学的影响:光镜下观察,
假手术组心肌纤维排列整齐,结构清楚,横纹清晰可
见,细胞核呈长椭圆形,分布均匀,心肌细胞无肥大、
萎缩或水肿; 模型组心肌细胞间隙增宽,心肌纤维明
显肿胀,排列紊乱,可见部分肌纤维断裂, 心肌细胞
间可见大量散在的红细胞和部分成片红细胞渗出,
1327 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
心肌间质出现大量炎细胞浸润,可见肌浆凝聚;缺血
后处理组及 GST T 100、30 mg/ kg 组心肌细胞排列
相对规则, 界限清楚, 心肌纤维轻度肿胀, 红细胞明
显少于模型组, 偶见成纤维细胞及炎细胞浸润;阳性
对照药尼可地尔组偶见肌浆凝聚, 炎细胞浸润不
明显。
2 4 对心肌细胞凋亡的影响:光镜下观察细胞核中
有棕黄色颗粒者为阳性细胞, 假手术组可见少量凋
亡细胞, 说明正常细胞存在凋亡, 但凋亡率小于
10%。与假手术组比较,模型组 T UNEL 染色阳性
细胞数明显增多 ( P< 0 01) ;与模型组比较, GSTT
100、30 mg / kg 组、后处理组和阳性药组 TU NEL
染色阳性细胞数明显减少 ( P< 0 05、0 01)。结果
见图 2和 3。
A假手术组 B模型组 C缺血后处理组 D~ FGSTT 100、30、10 mg kg- 1组 G尼可地尔组
ASham gr ou p Bmodel gr ou p Cis chemia postcondit ioning group
D FGSTT 100, 30, and 10 m g kg- 1 g rou p GNicorandil group
图 2 GSTT 对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织形态学的影响
Fig. 2 Effect of GSTT on histomorphology change of cardiac muscle of myocardial ischemiareperfusion injured rats ( x# s, n= 8)
A假手术组 B模型组 C缺血后处理组
D~ FGST T 100、30、10 mg kg- 1组 G尼可地尔组
ASham group Bmodel group Cischemia postcondit ion ing
group D FGSTT 100, 30, and 10 m g kg- 1 group
GNicorandil group
与假手术组比较: ∃ ∃P < 0 01
与模型组比较: * P < 0 05 * * P< 0 01
∃ ∃P < 001 v s Sham g rou p
* P< 0 05 * * P< 0 01 v s model grou p
图 3 GSTT对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞
凋亡的影响
Fig. 3 Effect of GSTT on myocardium apoptosis
of myocardial ischemiareperfusion
injured rats ( x# s, n= 8)
3 讨论
心肌缺血性疾病是目前临床上发生率最高的急
症之一,进行血运重建可显著降低其死亡率, 但潜在
的再灌注损伤可能会引起心肌细胞坏死、凋亡、心肌
顿抑及无复流现象,成为影响预后的一个重要因素。
研究显示[ 56] ,在闭塞的冠脉血管完全开放、心肌组
织实现完全再灌注之前,间断少许开放冠脉血流,直
至最后完全的开放血流, 对于再灌注损伤具有干预
作用,心肌组织可以得到一定的保护,即缺血后处理
具有保护作用。与缺血预适应相比,缺血后处理在实
施上有更好的可预测性及可控性,因此具有较好的临
床应用前景[ 7]。尽管这种机械后处理是一种新的治
疗理念和手段,但具有潜在的危险, 临床应用有限。
经过探索发现[ 89] ,在完全恢复血流前,不采用机械后
处理办法,而使用模拟内源性保护机制的药物 即
药物后处理 ( pharmacological postconditioning) ,对心
肌缺血再灌注损伤具有类似缺血后处理的保护作用,
可避免反复机械刺激导致的严重问题。
GSTT 为临床上常用的抗心脑血管疾病药物,
本实验室的前期研究发现, GSTT 预适应对心肌缺
血再灌注损伤具有保护作用[ 10] , 故本实验进一步探
讨 GSTT 后处理对缺血再灌注损伤是否具有保护
作用。本实验结果显示心肌缺血再灌注损伤大鼠给
予 GSTT 药物后处理能明显降低血清 MDA、LDH
的水平, 并提高 SOD 的活力, 病理形态学及
1328 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
TU NEL 检测均显示, 应用 GST T 后, 心肌组织损
伤减轻,心肌细胞凋亡率下降。揭示在再灌注的同
时外源性给予 GST T 可增强机体清除氧自由基的
能力,减轻细胞膜脂质过氧化损伤,提高机体的抗氧
化能力,从而发挥药物后处理的保护作用。
研究发现, 细胞因子参与了缺血再灌注损伤的
发生与发展。受损的心肌细胞会分泌 T 炎症性因
子,诱导心肌细胞凋亡,进一步加重细胞损伤。本实
验结果显示,缺血再灌后血清中 TNF、IL6 升高,
与文献报道一致[ 11]。而 GSTT 可显著抑制损伤心
肌细胞分泌 T NF、IL6, 减轻再灌注对细胞膜损
伤程度,进一步揭示了 GST T 后处理可抑制缺血再
灌注导致的心肌细胞凋亡。
综上所述, GST T 后处理对大鼠心肌缺血再灌
注损伤具有保护作用,能减少自由基生成,减少炎症
因子分泌, 抑制心肌细胞凋亡,其具体的作用机制有
待于进一步研究。
参考文献:
[ 1] 李 红, 冯彩霞, 关凤英, 等 蒺藜皂苷对大鼠心肌缺血再
灌注损伤的保护作用 [ J] 吉林大学学报:医学版, 2009, 35
( 5) : 794797
[ 2] 孙 巍, 李晶莹, 李 红, 等 蒺藜皂苷对缺血心肌细胞内
核转录因子 B的作用 [ J] 中草药, 2008, 39( 6) : 889892
[ 3] Wang S S, Ji Y S, Li H , et al . Mechanisms of gros s sapo
nin s of T ribu lu s t err estr is via act ivat ing PKC! agains t myo
cardial apoptosis indu ced by oxidat ive st ress [ J ] Ac ta Phar m
S in, 2009, 44( 2) : 134139
[ 4] 姜恩平, 苏学今, 李 红, 等 蒺藜皂苷对 H 2O 2诱导 PC12
细胞凋亡保护作用及其机制研究 [ J] 中草药, 2008, 39
( 9) : 13681371
[ 5] Zh ao Z Q, Corvera J S, Halkos M E, e t al . Inhib iti on of my
ocardial injury by ischemic postcondit ioning during r eperfu
sion: com paris on w ith is chemic precondit ioning [ J] A m J
P hysiol H ear t Cir c Phy siol , 2003, 285( 2) : 579588
[ 6] Zhu M , Feng J, Lucchinet ti E, et al . Is chemic postcondi
ti on ing protect s rem odeled m yocardium via th e PI3KPKB/
Akt reperfu sion inju ry salvage kinase pathway [ J] Car d io
vasc Re s, 2006, 72( 1) : 152162
[ 7] Kloner R A, Rezkal la S H Precondi tionin g, postcondi tion
ing and their applicat ion to clinical cardiology [ J] Car diova sc
Re s, 2006, 70( 2) : 297307
[ 8] Yao Y, Li L, Li L, et al . Sevoflu ran e postcondit ioning p ro
t ect s chr on ical ly infarcted rat heart s against i sch emiar eperfu
sion injury by act ivation of pro survival kin as es and inhib iti on
of mitoch ond rial perm eabilit y t ransit ion pore opening up on
reperfusion [ J] B iol Pharm B ul l , 2009, 32 ( 11 ) : 1854
1861
[ 9] Hn isch A, T heu ring N, Ebn er B, e t al . Postcondit ionin g
w ith levosim endan reduces the infarct siz e in volvin g the PI3K
pathway and KAT Pchan nel activat ion but i s independent of
PDE% in hibit ion [ J] Basic Res Card iol , 2010, 105 ( 2 ) :
155167
[ 10] 张 爽, 李 红, 魏征人, 等 蒺藜皂苷预适应对心肌缺血
再灌注损伤大鼠心功能的影响 [ J] 中草药, 2010, 41( 6 ) :
959963
[ 11] 程江霞, 彭晓红, 秦 汉, 等 缺血后处理对大鼠心肌缺血
再灌注时血清 T NF、IL1∀ 和 IL6 浓度的影响 [ J] 武汉
大学学报:医学版, 2008, 29( 5) : 576577
龙须菜藻红蛋白对 H22荷瘤小鼠免疫功能的影响
陈美珍,杜 虹,徐本杰*
(汕头大学理学院 生物系, 广东 汕头 515063)
摘 要:目的 研究龙须菜藻红蛋白体内抑瘤效应与荷瘤小鼠机体免疫功能的关系, 探讨其抑瘤作用的细胞免疫
学机制。方法 建立小鼠 H22肝癌实体瘤模型,分别 ig 给予藻红蛋白高、中、低剂量。连续给药 7 d 后, 测定各组
小鼠肿瘤生长抑制率和腹腔巨噬细胞的吞噬指数,采用 MTT 法检测各组小鼠脾淋巴细胞增殖指数、NK 细胞免疫
活性和肿瘤坏死因子 ( T NF) 的分泌。结果 高剂量藻红蛋白对小鼠 H 22肿瘤的生长抑制率明显高于模型组
( P< 0 05) ,抑瘤率为 30 23% ;与模型组比较, 藻红蛋白对荷瘤小鼠胸腺和脾脏有保护和修复作用, 具有显著提高
腹腔巨噬细胞的吞噬指数 (P< 0 05)、脾淋巴细胞增殖指数 ( P< 0 01)、NK 细胞对靶细胞的杀伤活性 ( P< 0 01)
和增加脾淋巴细胞分泌 TNF的作用 (P< 0 05)。结论 龙须菜藻红蛋白可明显提高 H22荷瘤小鼠细胞免疫功
能,这可能是其抗肿瘤效应机制之一。
关键词:龙须菜藻红蛋白; 抗肿瘤; 细胞免疫
中图分类号: R286 91 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 08132904
龙须菜 Gr acilar ia lemaneif ormis Webervan
Bosse 是江蓠属红藻。龙须菜在我国已经成为继海
带和紫菜之后的第三大重要养殖藻种, 资源十分丰
富。至今,龙须菜主要用于提取琼胶,民间多用于入
1329 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 20091203 基金项目:广东省科技计划项目 ( 2007A032600003) ; 汕头市科技计划项目 ( 2006 149)作者简介:陈美珍( 1956 ) ,女,副教授,硕士生导师,主要研究方向为天然活性物质研究与开发。
T el: ( 0754) 82902540 Email: chenmz@ s tu. edu. cn