全 文 ：大黄提取物抗氧化活性与游离蒽醌相关性的研究
吕慧英1, 2 ,赵晨曦1 *
,吴  海2 ,梁逸曾2* ,李  强1
( 1
长沙学院 生物工程与环境科学系, 湖南 长沙  410003; 2
中南大学化学化工学院 中药现代化研究中心,
湖南 长沙  410083)
摘  要:目的  优化大黄抗氧化物的提取条件, 以及研究大黄抗氧化活性与蒽醌的相关性。方法  以大黄提取物
清除 DPPH 自由基的能力为参考指标,考察溶剂种类、乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数等因素对大黄提取物
抗氧化活性的影响;应用偏最小二乘法建立 DPPH 自由基清除能力与游离蒽醌之间的关系模型, 对大黄提取物
DPPH 自由基清除能力进行预测。结果  确定了大黄抗氧化物的最佳超声提取条件为: 以 70%乙醇为溶剂、料液
比为 1 30 ( g/ mL)、超声提取 2 次、每次提取 20 min, 超声提取> 浸提> 回流提取, 超声提取物清除率最高达
95
2%。PLS 模型的预测值与测定值间的相关系数(R)为 0
954 8, 均方根误差( RMSEP)为 0
032 4。结论  PLS
模型预测提示芦荟大黄素、大黄素与大黄提取物 DPPH 自由基清除能力呈现正相关, 而大黄酸、大黄酚、大黄素甲
醚与大黄提取物 DPPH 自由基清除能力呈现负相关。
关键词:大黄; 蒽醌;抗氧化活性; 偏最小二乘法;超声提取
中图分类号: R284
2    文献标识码: B    文章编号: 02532670( 2010) 03041204
  大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用
大黄的干燥根和根茎。大黄抗氧化活性的研究已有
报道[ 1] ,但比较多的是对脂质体系的抗氧化作用 [ 2]
和清除羟基自由基的研究[ 3] 。清除 DPPH 自由基
法是一种快速、简便、灵敏的评估植物抗氧化能力的
可行方法,被广泛应用到评价各种天然产物的自由
基的清除[ 4] 。自由基的清除能力与酚的量有高相关
性已经在谷类植物[ 5]、水果、饮料研究中有报道。
DPPH 自由基清除测定法的结果显示, 在易感生物
体和食物系统中,氢和(或)电子供体的吸收, 可以阻
止活性自由基接触如脂蛋白、多不饱和脂肪酸、
DNA、氨基酸、蛋白质和糖等活质分子[ 6]。大黄主
要有效成分为蒽醌类衍生物, 包括芦荟大黄素、大黄
酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚以及与葡萄糖结合
成苷, 5 种游离蒽醌是大黄以及衍生中药大黄属质
量控制的基础。然而, 关于游离蒽醌化合物及其量
对于大黄的药效如抗氧化活性的影响研究却鲜有报
道。本实验采用偏最小二乘法将大黄提取物抗 DP
PH 自由基能力与游离蒽醌相关联, 为大黄药材的
有效提取和抗氧化作用机制研究提供参考。
1  仪器和材料
Agilent 1100型 HPLC (四元梯度泵, DAD 检
测器, HP Chem Stat ion 色谱工作站, 美国安捷伦科
技) , 上海 BRANSON SB2200 超声波发生器,
D1810C 型电子分析天平 (上海申生科技有限公
司) , U V ! 2100型紫外分光光度计(日本岛津)。
芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素
甲醚对照品购自中国药品生物制品检定所;四川产
大黄药材购于湖南国杏中药饮片有限责任公司, 经
湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定为药用大黄
Rheum of f i cinale Baill。药材于 40 ∀ 干燥、粉碎过
40目筛,贮于干燥器中置暗处保存备用;甲醇、乙腈、
磷酸均为江苏汉邦科技有限公司生产的色谱纯,二次
蒸馏水,乙醇、醋酸乙酯、石油醚、正己烷等均为北京
化工厂生产的分析纯试剂, DPPH( Sigma公司)。
2  方法与结果
2
1  对 DPPH 自由基的抑制试验方法:取 2 mL 以
甲醇配制成的 DPPH 溶液, 浓度为 2
0 # 10- 4 mo l/
L ,与等体积不同浓度的大黄提取物充分混匀, 30
m in 后在 517 nm 处测量其吸光度 AS,控制样本用
甲醇代替提取物, 以纯甲醇为空白样本,计算对 DP
PH 自由基的清除率 ( S) [ 7]。IC50定义为抑制 50%
自由基所需的样品浓度,通过获得的抑制 DPPH 回
归方程计算所得。
  S = (A o- A s) / A o# 100%
式中: Ao为控制样本的吸光度; A s为测试样本的吸光度
2
2  大黄提取物制备条件的优化
2
2
1  溶剂种类的选择: 称取 0
5 g 大黄细粉, 分
∃412∃ 中草药  Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月

收稿日期: 20090412                     基金项目:科技部中药国际合作项目( 2007DFA40680) ;湖南省科技计划项目( 2007FJ3094)作者简介:吕慧英( 1981 ! ) ,女,硕士研究生,从事中药现代化的分析与研究。Email: lhy110300@ 163
com
* 通讯作者  赵晨曦  T el: ( 0731) 4261506  Email: cxzh003@ gm ail
com梁逸曾  T el: ( 0731) 8830831  Email: YiZen g Liang@ 263
net
别加入 50 mL 不同溶剂(正己烷、石油醚、氯仿、醋
酸乙酯、丙酮、甲醇、80%甲醇、乙醇、70%乙醇、水) ,
超声提取 30min,抽滤, 40 ∀ 下真空旋转蒸发至干,
后用甲醇溶解定容于 10 mL 量瓶中,放入冰箱,于 4
∀ 下冷藏,备用。分别移取 40
L 大黄提取物样品
于 10mL 量瓶中, 用甲醇定容,对应药材质量浓度即
为 0
2 mg / mL。上述溶液分别进行抗 DPPH 自由
基的抑制试验(平行测定 3次,取平均值) ,结果清除
率分别为 5
6%、10
4%、10
2%、14
5%、20
6%、
78
5%、90
2%、48%、87
4%、56
8%。可知 80%
甲醇提取物抗氧化能力最强, 70%乙醇提取物次之;
正己烷、石油醚等低极性溶剂提取物抗氧化能力低,
不适宜用作提取剂;水的极性最强, 但水提物抗氧化
能力并不高( 56
8% ) ,考虑到甲醇有毒, 不宜用于食
品和药物的加工,而乙醇来源丰富,成本低等诸因素,
本实验采用 70%乙醇作为提取大黄的溶剂,乙醇也
是大多数研究工作和工业生产通常采用的溶剂[ 8]。
2
2
2  乙醇体积分数的影响: 条件同 2
2
1, 考察
不同体积分数乙醇( 30%、60%、70%、80%、90%)对
提取物清除 DPPH 自由基能力的影响,结果见图 1。
可知,乙醇体积分数在 30% ~ 70%大黄提取物抗氧
化能力随乙醇体积分数的增加而增强, 乙醇体积分
数达到 70%时最强,而后随乙醇体积分数的增加反
而减弱,且 90%时抗氧化能力低于 30%。这可能是
因为部分蒽醌类衍生物的低醇溶性导致的。综合考
虑,本实验选择 70%乙醇提取。
图 1 乙醇体积分数影响提取物清除 DPPH自由基能力
Fig
1 Effects of ethanol concentration on DPPH free
radical scavenging activity
2
2
3  超声提取时间的影响: 以 70%乙醇为提取
溶剂,其他条件同 2
2
1, 考察不同超声提取时间
( 10、20、30、40、60 m in)对提取物清除 DPPH 自由
基能力的影响。其测定结果如图 2所示: 大黄提取
物抗氧化能力在 10~ 20 min快速增强, 20~ 30 m in
几乎没有变化, 随后随提取时间的延长而减弱,这可
能是因为随着超声时间的延长、温度升高导致提取
物不稳定从而降低抗氧化能力。因此确定提取时间
为 20 min。
图 2  提取时间影响提取物清除 DPPH自由基能力
Fig
2  Effects of extracting time on DPPH free radical
scavenging activity
2
2
4  料液比的影响:以 20 min为超声提取时间,
其他条件同 2
2
3, 考察不同料液比( 1 5、1 10、
1 20、1 30、1 40、1 50 g/ mL)对提取物清除
DPPH 自由基能力的影响, 结果分别为 60
1%、
65
9%、66
4%、68
2%、68
9%、69
6%。可知大黄
提取物抗氧化能力随料液比增加而增强, 1 30料
液比后增强缓慢。考虑溶剂耗量和回收溶剂的能
耗,选择 1 30的料液比。
2
2
5  超声提取次数的影响: 以 1 30 g/ mL 为料
液比,其他条件同 2
2
4, 考察不同超声提取次数
( 1、2、3)对提取物清除 DPPH 自由基能力的影响。
所得提取物对 DPPH 自由基的清除率依次为
83
4%、89
4%、90
0%。从工作效率和生产成本等
因素考虑,以两次提取较为合理。
2
2
6  提取方法的影响:称取 0
5 g 大黄细粉, 加
入 30 mL70%乙醇浸提 3 d,抽滤, 40 ∀ 下真空旋转
蒸发至干, 后用甲醇溶解定容于 10 mL 量瓶中, 放
入冰箱,于 4 ∀ 下冷藏, 备用, 作为浸提提取物。称
取 0
5 g 大黄细粉,加入15 mL 70%乙醇,回流提取
1h,抽滤,再向滤渣中加 15 mL70%乙醇回流 1 h后
抽滤,合并两次所得滤液,抽滤, 40 ∀ 下真空旋转蒸
发至干,后用甲醇溶解定容于 10 mL 量瓶中, 放入
冰箱,于 4 ∀ 下冷藏, 备用, 作为回流提取提取物。
称取 0
5 g 大黄细粉,以料液比 1 30 加入 70%乙
醇溶液,超声提取 2次,每次 20 min,所得提取物分
别经抽滤, 旋干后用甲醇溶解定容于 10 mL 量瓶
中,备用,作为超声提取提取物。
移取上述溶液,用甲醇配成不同浓度的溶液,进
行抗 DPPH 自由基的抑制试验。平行测定 3次,取
平均值。结果见图 3。可知超声提取物自由基清除
率最高,其 DPPH 自由基清除率先增大后出现明显
的平台,到相当于药材浓度 0
3 mg / mL 时,清除率
达到最高 95
2%。对于图 3中的曲线,利用计算回
归方程的方法计算得大黄超声提取、浸渍、回流提取
∃413∃中草药  Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
物的 IC50 值依次为 0
087、0
176、0
293 mg / mL,
结果与上述结论相同。
图 3  不同提取方法对大黄提取物清除 DPPH自由基
能力的影响
Fig
3 Effects of dif ferent extracting methods on DPPH
free radical scavenging activity
2
3  游离蒽醌对 DPPH 自由基清除能力的影响
2
3
1  HPLCDAD分析条件: Waters PAH C18色
谱柱( 250 mm # 4
6 mm , 5
m) ; 流动相: 甲醇乙
腈0
01%磷酸缓冲溶液( 3 5 2) ; 检测波长: 225
nm ;体积流量: 1
0 mL/ min; 进样量: 20
L; 柱温:
室温 。进样液过 0
45
m的微孔滤膜后进行分析。
2
3
2  游离蒽醌的提取与测定:称取 0
2 g 大黄细
粉,分别加入 30 mL 不同溶剂(正己烷、氯仿、醋酸乙
酯、丙酮、甲醇、80%甲醇、乙醇、70%乙醇、水) , 超声
提取20min,抽滤, 40 ∀ 下真空旋转蒸发至干, 加入
1 mol/ LH2SO4 30 mL 水解, 再加入 20 mL 三氯甲烷
萃取(萃取3次) ,合并三氯甲烷层,挥干,用甲醇定容
于 10 mL 量瓶中,放入冰箱,于4 ∀ 下冷藏,备用。分
别移取 2 mL 大黄提取物样品于 10 mL 量瓶中,用甲
醇定容,对应药材质量浓度即为 4 mg/ mL。
上述溶液分别进行游离蒽醌的测定和抗 DPPH
自由基的抑制试验(平行测定 3 次, 取平均值)。其
色谱叠加图见图 4, 游离蒽醌(外标法测定)及清除
DPPH 自由基的能力的测定结果见表 1。
1芦荟大黄素 2大黄酸  3大黄素  4大黄酚  5大黄素甲醚
1 aloe emodin  2rh ein  3em odin  4chrysophanol  5phy
scion
图 4 大黄不同提取方法提取物的 HPLC色谱图
Fig
4  HPLCChromatograms of extracts of rhubarb by
different extracting methods
表 1 蒽醌的量及游离蒽醌清除 DPPH自由基的能力
Table 1  Contents of free anthraquinones and DPPH free radical scavenging activity
编号 溶剂 芦荟大黄素/
( mg ∃ g- 1 )
大黄酸
( mg ∃ g- 1 )
大黄素/
( mg ∃ g- 1)
大黄酚/
( mg ∃ g- 1)
大黄素甲醚/
( mg ∃ g- 1 )
清除率/
%
1 正己烷 0
306 0
243 0
457 1
626 0
387 45
0
2 氯仿 1
210 1
213 1
592 4
371 1
147 48
3
3 醋酸乙酯 1
240 1
299 1
703 4
532 1
121 57
9
4 丙酮 1
396 1
490 1
916 5
137 1
416 50
6
5 甲醇 2
345 4
324 2
733 6
074 1
775 59
5
6 80%甲醇 2
057 3
353 2
312 5
443 1
462 60
1
7 乙醇 1
902 2
572 2
439 6
207 1
713 60
0
8 70%乙醇 2
336 3
937 2
583 5
965 1
658 65
3
9 水 0
715 2
414 0
829 1
844 0
527 27
3
2
3
3  抗 DPPH 自由基能力与游离蒽醌的 PLS 模
型:偏最小二乘法( part ial least square, PLS )由于
具有较强的提供信息的能力而成为化学计量学中最
受推崇的多变量校正方法, 目前是最有效的分析方
法之一,它从自变量矩阵和应变量矩阵中提取偏最
小二成分,有效地降维,并消除自变量间可能存在的
复共线关系, 明显改善数据结果的可靠性和准确
度[ 9]。实验采用偏最小二乘( PLS)方法对大黄提取
物 DPPH 自由基清除能力进行分析。首先采取留
一交互检验法确定最优主成分数为 3,故选取 3个
主成分建立 DPPH 自由基清除能力与 5 种游离量
之间的关系,模型为 y = 0
557 6 x 1- 0
147 8 x 2+
0
081 0 x 3- 0
043 7 x 4- 0
257 4 x 5+ 0
403 4。其
中 y 为大黄提取物 DPPH 自由基清除能力, x 1、x 2、
x 3、x 4、x 5 分别为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄
酚、大黄素甲醚的量。根据此模型对大黄提取物
DPPH 自由基清除能力进行预测, 见图 5。其预测
值与测定值间的相关系数( R)为 0
954 8, 均方根误
∃414∃ 中草药  Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
差( RM SEP)为 0
032 4, 说明建立的模型具有良好
的预测能力。
图 5  PLS模型预测结果(取 3 个主成分)
Fig
5 Prediction results of PLS model ( three factors)
  通过所建立的模型可以看出,芦荟大黄素和大
黄素甲醚的回归系数的绝对值相对较大, 分别为
0
557 6、0
257 4, 说明这两种物质的量对大黄提取
物 DPPH 自由基清除能力的影响较大, 而大黄酚的
回归系数仅为 0
043 7, 说明大黄酚对大黄提取物
DPPH 自由基清除能力的影响相对较弱。
3  讨论
本研究以提取物抗 DPPH 自由基能力为评价指
标,确定了大黄抗氧化物的最适提取条件为: 70%乙
醇为溶剂, 料液比 1 30 ( g/ mL) , 超声提取 2次, 每
次提取 20 min。在同样的条件下,提取效率或清除率
为超声提取法> 浸渍提取法> 回流提取法。这一结
果为大黄抗氧化活性物质的有效提取提供了依据。
本实验采用 PLS 法就大黄提取物对 DPPH 自
由基清除率与其中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大
黄酚和大黄素甲醚的量进行关联,建立了大黄提取
物抗氧化活性与 5种游离蒽醌量之间的定量线性相
关关系模型。结果表明, 大黄提取物的抗氧化活性
是各种性质物质的共同贡献。从模型的回归系数可
以看出,芦荟大黄素、大黄素与大黄提取物 DPPH
自由基清除能力呈现正相关,即抗氧化活性随芦荟
大黄素、大黄素量的增加而增加;而大黄酸、大黄酚、
大黄素甲醚与大黄提取物 DPPH 自由基清除能力
呈现负相关,即大黄提取物的抗氧化活性随这 3种
游离蒽醌量的增加而降低。这一结果与文献报道的
芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚清除羟基自由
基能力一致的相关性 [ 10]。说明若提取物中芦荟大
黄素、大黄素的量越高,或者大黄酸、大黄酚、大黄素
甲醚的量越低,则大黄提取物 DPPH 自由基清除能
力将会越强。这一结论为蒽醌类物质的抗氧化机制
研究提供参考。
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