全 文 ：RPHPLC法测定湿毒清片中 7种活性成分
褚文静,张 雪,黄喜茹*
(河北医科大学药学院 分析化学教研室, 河北 石家庄 050017)
摘 要:目的 建立反相高效液相色谱法同时测定湿毒清片中丹参素、阿魏酸、木犀草苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、黄芩
苷和隐丹参酮。方法 采用 DiamonsilTM C18色谱柱( 250 mm 4 6 mm, 5 m) , 以甲醇1%冰醋酸为流动相进行梯
度洗脱,体积流量为 1 0 mL/ min,柱温 30 ! , 检测波长为 250 nm。结果 丹参素、阿魏酸、木犀草苷、迷迭香酸、丹
酚酸 B、黄芩苷和隐丹参酮的线性范围分别为 0 164 2~ 2 464、0 007 600~ 0 114 0、0 036 16~ 0 542 4、0 051 84~
0 777 6、0 287 0~ 4 305、0 240 0~ 3 600、0 020 85~ 0 312 8 g, r 值分别为 0 999 9、0 999 7、1 000 0、0 999 8、
0 999 9、0 999 8、1 000 0。丹参素、阿魏酸、木犀草苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、黄芩苷和隐丹参酮的平均回收率分别
为 97 1%、96 7%、99 2%、96 4%、98 2%、99 6% 、100 2% , RSD 分别为 1 5%、1 4%、1 3%、1 7%、1 3%、
0 68%、0 53%。结论 该方法专属性好、准确度高 ,可用于综合评价湿毒清片的质量。
关键词:湿毒清片; 丹参素;阿魏酸; 木犀草苷;迷迭香酸; 丹酚酸 B;黄芩苷; 隐丹参酮;高效液相色谱
中图分类号: R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11180903
湿毒清片是由地黄、当归、丹参、苦参、蝉蜕、黄
芩、白鲜皮、土茯苓、甘草组成的复方制剂,具有养血
润燥、化湿解毒、祛风止痒的功效,用于皮肤瘙痒症
属血虚湿蕴皮肤症者。湿毒清片的质量控制方法未
见报道, 而组方类同作用相近的湿毒清胶囊[ 1] 以其
中一至两种成分作为质量控制指标的 HPLC 法已
有报道[ 23]。本实验建立了高效液相色谱法同时测
定湿毒清片中组成药味当归的有效成分阿魏酸和木
犀草苷[ 4] ,丹参的有效成分丹参素、迷迭香酸、丹酚
酸 B 和隐丹参酮以及黄芩的有效成分黄芩苷共 7
种成分。该法专属性好、准确度高,可用于全面评价
湿毒清片的质量。
1 仪器与试药
Agilent 1200全自动高效液相色谱仪 (二极管
阵列检测器、四元泵、柱温箱、自动控温进样器) ,
Agilent 化学工作站。
丹参素钠(批号 110855200405)、阿魏酸(批号
111581200302)、木犀草苷(批号 111720200603)、
丹酚酸 B ( 批号 111562200504 )、黄芩苷 (批号
110715200514)、隐丹参酮(批号 110852200305)对
照品均购自中国药品生物制品检定所; 迷迭香酸(质
量分数 98%以上)购自四川成都曼思特生物科技有
限公司。甲醇为进口色谱纯, 冰醋酸为分析纯,水为
重蒸水。湿毒清片 (广州诺金制药有限公司, 批号
251151、251200、251204, 规格:每片 0 5 g)。
2 方法与结果
2 1 色谱条件: DiamonsilTM C18色谱柱( 250 mm
4 6 mm, 5 m) ; 流动相: 甲醇( A)1% 冰醋酸( B) ,
梯度洗脱程序: 0 ~ 10 min, 20% A; 10~ 11 m in, 线
性改变至 45% A, 11~ 20 m in, 45% A, 20~ 26 min,
线性改变至 78% A, 26~ 50 min, 78% A; 停止时间
50 m in,后运行 10 min。体积流量 1 0 mL/ min;自
动进样 10 L;柱温 30 ! ; 检测波长 250 nm。理论
塔板数按丹参素计算不低于 8 000, 7种组分与相邻
色谱峰的分离度均大于 1 5, 且各组分的色谱峰对
称,色谱图见图 1。
2 2 对照品溶液的制备: 精密称取对照品丹参素
5 48 mg、阿魏酸380 mg、木犀草苷 1 81 mg、迷迭香
酸 3 24 mg、丹酚酸 B 7 18 mg、黄芩苷 4 0 mg 和隐
丹参酮10 42 mg,分别置 25 mL 量瓶中,用50%甲醇
溶解并稀释至刻度, 配成质量浓度分别为 219 2、
152 0、72 32、129 6、287 0、160 0、417 0 g/ mL 的对
照品储备液。分别精密吸取上述丹参素、阿魏酸、木
犀草苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、黄芩苷、隐丹参酮储备
液 3 75、025、2 5、2 0、5 0、7 5、025 mL 置25mL量
瓶中,用50%甲醇稀释至刻度,摇匀,配成质量浓度分别
为3285、152、723、1037、57 4、480、4 17 g/ mL 的混
合对照品溶液。
2 3 供试品溶液的制备:取湿毒清片 10片,去除薄
膜衣,精密称定, 研细,混匀,取细粉0 5 g (约相当于
∀1809∀中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100303 基金项目:河北省中医药局资助项目( 05057) ;河北省科技厅科技项目( 062761372)作者简介:褚文静( 1981 # ) ,女,河北赞皇人,硕士研究生,从事药物分析研究。电话: ( 0311) 86265623 Em ail: w enjingchu@ 163. com
* 通讯作者 黄喜茹 T el: ( 0311) 86265623 Email: hxiru@ 163 com
1片) ,精密称定, 置具塞锥形瓶中,精密加入 75%甲
醇20 mL,称定质量, 回流提取 3 h,放冷,称定质量,
用 75%甲醇补足减失的质量, 摇匀, 滤过,取续滤液
用 0 45 m 微孔滤膜滤过, 即得供试品溶液。
按湿毒清片的生产工艺制备缺当归、丹参、黄芩
的阴性制剂, 同法制备阴性供试品溶液。
1丹参素 2阿魏酸 3木犀草苷 4迷迭香酸 5丹酚酸 B 6黄芩苷 7隐丹参酮
1danshensu 2f erul ic aicd 3lu teoloside 4rosm arin ic acid 5salvianolic aicd B 6baicalin 7 cryptotanshinone
图 1 混合对照品(A)、湿毒清片( B)和阴性对照(C)HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC Chromatograms of mixture reference substance (A) , Shiduqing Tablet ( B) , and negative sample ( C)
2 4 线性关系考察:取混合对照品溶液过 0 45 m
滤膜后,按上述色谱条件分别进样 5、15、25、35、45、
55、65、75 L , 记录色谱峰面积。以峰面积对进样
质量进行线性回归, 各组分的回归方程、相关系数及
线性范围见表 1。
表 1 7 个成分的回归方程和相关系数
Table 1 Regression equation and correlation
coefficients of seven components
化合物 线性回归方程 r 线性范围/ g
丹参素 A = 90 396 C- 0 681 0 999 9 0 164 2~ 2 464
阿魏酸 A = 272 5 9 C+ 0 641 7 0 999 7 0 007 600~ 0 114 0
木犀草苷 A = 378 6 C+ 0 531 1 000 0 0 036 16~ 0 542 4
迷迭香酸 A = 177 7 2 C- 0 313 1 0 999 8 0 051 84~ 0 777 6
丹酚酸 B A = 189 47 C- 0 826 8 0 999 9 0 287 0~ 4 305
黄芩苷 A = 161 5 3 C- 1 867 9 0 999 8 0 240 0~ 3 600
隐丹参酮 A = 386 1 9 C- 1 919 6 1 000 0 0 020 85~ 0 312 8
2 5 专属性试验: 取阴性供试品溶液过 0 45 m
滤膜后,按上述色谱条件进样 10 L,结果表明阴性
样品对所测组分无干扰。
2 6 检测限:取混合对照品溶液逐步稀释后, 注入
高效液相色谱仪, 以峰高为基线噪音 3 倍计, 丹参
素、阿魏酸、木犀草苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、黄芩苷
和隐丹参酮的最低检测限分别为 4 6、0 18、0 35、
0 74、6 8、6 3、0 52 ng。
2 7 精密度试验: 取对照品溶液,按上述色谱条件
各取 10 L 注入高效液相色谱仪,连续进样 6次, 丹
参素、阿魏酸、木犀草苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、黄芩
苷和隐丹参酮的峰面积 RSD 分别为 0 76%、
0 65%、0 28%、0 79%、1 2%、1 0%、0 39%。
2 8 重现性试验:取批号为 251151样品,制备 5份
供试品溶液,各进样 10 L,测得丹参素、阿魏酸、木犀
草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、黄芩苷和隐丹参酮的平均
质量分数分别为 1 010 mg/片( RSD= 0 32%)、0 014
72 mg/片 ( RSD= 1 2%)、0082 69 mg/片 ( RSD=
0 67%)、0 146 2 mg/片( RSD= 0 75%)、1022 mg/
片 ( RSD = 1 1%)、7573 mg/片 ( RSD = 0 37%)、
0 034 52 mg/片( RSD= 0 86%)。
2 9 稳定性试验:取批号为 251151的供试品溶液,
分别于 0、2、4、6、8、10、12、16、24 h进样10 L, 丹参
素、阿魏酸、木犀草苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、黄芩苷
和隐丹参酮峰面积的 RSD 分别为 1 7%、1 3%、
0 86%、1 4%、1 8%、1 1%、1 6%。表明供试品溶
液 24 h 内稳定。
2 10 回收率试验:取批号 251151样品细粉 0 1 g,
精密称定, 平行 3 份, 分别加入混合对照品溶液
9 6、8 8、8 0 mL, 制备供试品溶液,测定, 计算加样
回收率,结果丹参素、阿魏酸、木犀草苷、迷迭香酸、
丹酚酸 B、黄芩苷和隐丹参酮的回收率分别为
97 1%、96 7%、99 2%、96 4%、98 2%、99 6%、
100 2% , RSD 分别为 1 5%、1 4%、1 3%、1 7%、
1 3%、0 68%、0 53%。
2 11 样品测定: 按供试品溶液制备方法制备湿毒
清片样品溶液,按上述色谱条件进样,用工作曲线法
计算质量分数,结果见表 2。
表 2 湿毒清片中 7种有效成分的测定结果( n= 4)
Table 2 Determination of seven components in Shiduqing Tablets (n= 4)
批 号 丹参素/
( m g ∀ 片- 1)
RSD/
%
阿魏酸/
( mg ∀ 片- 1 )
RSD/
%
木犀草苷/
( mg ∀ 片- 1 )
RSD/
%
迷迭香酸/
( mg ∀ 片- 1 )
RSD/
%
丹酚酸 B/
( mg ∀ 片- 1)
RSD/
%
黄芩苷/
( m g ∀ 片- 1)
RSD/
%
隐丹参酮/
( mg ∀ 片- 1)
RSD/
%
251151 1 015 0 32 0 014 77 1 2 0 082 96 067 0 145 5 075 1 023 1 10 7 609 0 37 0 034 04 0 86
251200 1 004 1 30 0 015 21 1 0 0 083 56 083 0 141 7 120 1 016 0 79 7 195 0 90 0 033 95 1 40
251204 1 008 0 85 0 015 15 1 1 0 083 29 100 0 142 3 054 1 019 1 40 7 026 0 72 0 034 26 1 10
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3 讨论
3 1 检测波长的选择:经二极管阵列检测器分别对
7种成分进行全波长扫描得知,丹参素的特征吸收
波长为226、280 nm ,阿魏酸的特征吸收波长为236、
322 nm,木犀草苷的特征吸收波长为 255、350 nm,
迷迭香酸的特征吸收波长为 230、330 nm, 丹酚酸 B
的特征吸收波长为 255、286 nm,黄芩苷的特征吸收
波长为 278 nm, 隐丹参酮的特征吸收波长为 264
nm ,而丹参素的截止波长为 300 nm, 为兼顾各组分
的检测信号强度和检测灵敏度,本试验选择 250 nm
作为检测波长。
3 2 流动相的选择:湿毒清片是由九味中药组成的
复方制剂,化学成分复杂,且各味中药的活性成分的
极性差异较大。本试验曾分别考察了甲醇水、乙
睛水、甲醇0 1%磷酸、乙睛0 4% 磷酸等溶剂系
统,分离结果均不理想。而采用甲醇1%冰醋酸作
流动相,进行梯度洗脱可将 7个组分完全分离, 且基
线稳定,峰形好,实验结果满意。
3 3 提取条件的考察:为了从湿毒清片中最大限度
地提取出各种有效成分, 实验对比了不同提取方法
(超声、回流和索氏提取)、不同提取溶剂(甲醇、50%
甲醇、75%甲醇、75%乙醇、水)对湿毒清片的提取效
果,结果表明,用 75% 甲醇回流提取的有效成分多、
效率高,回流 3 h 即能提取完全。
参考文献:
[ 1] 李思明,何俊兵,王 辉,等 湿毒清胶囊化学成分与药理作用
研究进展[ J] 现代药物与临床, 2009, 24( 4) : 220224
[ 2] 乐仁昌 湿毒清胶囊中阿魏酸的含量测定[ J] 海峡药学,
2008, 20( 5) : 3032
[ 3] 黄诗远,陈 凤,姚红霞 RPHPLC法测定湿毒清胶囊中丹酚
酸 B和黄芩苷的含量[ J] 中国药师, 2008, 11 ( 6) : 663664
[ 4] 陈慧珍 当归的研究进展[ J ] 海峡药学, 2008, 20 ( 8) : 8384
正交试验优选全蝎盐制工艺的研究
徐连明,邵 杰,付小环, 杨妍妍,杨 璐*
(江苏康缘药业股份有限公司,江苏 连云港 222001)
摘 要:目的 研究不同炮制条件对全蝎乙醇提取物中总氮的影响,为确定合理的加工方法提供依据。方法 以
氯化钠水溶液用量、氯化钠水溶液浓度、煮沸时间为因素, 采用正交试验法对全蝎炮制方法进行考察,以醇浸出物、
总氮为指标对炮制方法进行优选。结果 最佳工艺为加 4 倍量 15% 氯化钠水溶液, 煮沸 5 min。结论 所炮制之
全蝎有效成分破坏少,保证了药材的质量。
关键词:全蝎; 炮制;总氮; 正交试验
中图分类号: R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11181102
全蝎为钳蝎科动物东亚钳蝎 Buthus mar tensi i
Kar sch的干燥全体, 性味辛、平, 有毒, 具有息风镇
痉、攻毒散结、通络止痛等功效。全蝎的炮制方法按
∃中国药典%2010版一部规定为& 春末至秋初捕捉,
除去泥沙,置沸水或沸盐水中,煮至全身僵硬,捞出,
置通风处,阴干∋ [ 1]。此法对用盐比例、氯化钠水溶
液用量及加工时间长短, 都未作具体规定,导致市场
上全蝎质量参差不齐。市场上全蝎的含盐量为
30 14% ~ 38 75%, 含水量为 29 78% ~ 40 16% ,
使得全蝎用量不准确, 有效成分受到损失而影响临
床疗效[ 24]。为提高全蝎品质,本实验采用正交试验
法,以氯化钠水溶液用量、氯化钠水溶液浓度、煮沸
时间为因素,以醇浸出物、总氮为指标对全蝎炮制方
法进行考察,以确定最佳的炮制工艺。
1 材料与仪器
全蝎收购自山东省淄博全蝎养殖场, 经连云港
市药品检验所王统康主任药师鉴定为钳蝎科动物东
亚钳蝎 Buthus martensi i Kar sch。YHG # 50 远红
外快速恒温干燥箱。试剂均为分析纯。
2 方法
2 1 样品制备: 将活全蝎去除泥土沙石等杂质, 投
入清水中浸泡 2 h。使其吐出腹内容物, 然后洗净
为生品,备用。
2 2 正交试验设计:以氯化钠溶液炮制全蝎,影响
∀1811∀中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100429 基金项目:国家科技部重大新药创制项目( 2009ZX09313032)作者简介:徐连明( 1966 # ) ,男,硕士,高级工程师,主要研究方向:中药制剂的工艺与质量标准。
T el : ( 0518)85521955 Email: lygxlm2006@ 163. com