全 文 ：化合物、茋类( st ilbene, 1, 2二苯乙烯) [ 12]、苯丙酸
类化合物的相关生物活性研究较多。其生物活性表
现在抗炎、抗氧化[ 45] 作用,抑制环氧酶 ( COX) [ 6] 活
性,镇痛, 对癌细胞的毒性作用, 抑制 5还原酶活
性, 抑制苏氨酸酶活性等。其中抗炎、抗氧化, 抑制
环氧酶 ( COX) 活性, 镇痛作用与抗 RA 密切相关。
本实验选取了小鼠醋酸扭体法、小鼠热板法疼
痛试验以及二甲苯致小鼠耳廓肿胀、醋酸诱导的毛
细血管通透急性炎症模型和大鼠棉球肉芽肿的慢性
炎症模型,观察白桂木不同提取部位的活性, 实验结
果表明白桂木根醋酸乙酯提取物有镇痛作用和对炎
症中出现的变质渗出和增生都有较好的抑制作用,
这表明该部位具有较好的抗炎镇痛活性, 初步揭示
白桂木醋酸乙酯提取物在治疗 RA 中的作用, 但有
关白桂木的镇痛抗炎作用机制有待进一步研究。
参考文献:
[ 1] 甘茂罗, 欧阳胜, 谢 平, 等 白桂木的化学成分研究 [ J ]
中草药, 2005, 36( 7) : 988989
[ 2] 陈黎明, 谢 平, 肖庆青, 等 白桂木化学成分研究 [ J] 中
草药, 2007, 38( 6) : 815818
[ 3] 徐叔云, 卞如濂, 陈 修, 等 药理实验方法学 [ J ] 北京:
人民卫生出版社, 2002
[ 4] Oh H , Ko E K, Ju n J Y, et al . H epatoprotect ive and f ree
radical s cavenging act ivit ies of p renylf lavonoids, coum arin ,
an d s tilben e fr om Moru s alba [ J] P lanta Med , 2002, 68
( 10) : 932934
[ 5] Loren z P, Roych ow dhury S, Engelmann M, et al . Ox yres
verat rol and res verat rol are poten t ant ioxidan ts and free radi
cal scavengers: effect on nit rosat ive and oxidat ive s t ress de
rived from microglial cell [ J] N it ri c Ox id e , 2003, 9( 2) : 64
76
[ 6] Su B N, Cu endet M , H aw thorne M E, et al . Const ituents of
the bark and tw igs of A r tocarp us d adah w ith cycloox ygenase
inhib itory act ivity [ J] J Nat Pr od , 2002, 65( 2) : 163169
生血丸对骨髓抑制小鼠造血功能的调控作用
严苏纯1 ,王光普1 ,刘 彤2 *
( 1 天津医科大学总医院 中医科, 天津 300052; 2 中新药业达仁堂制药厂, 天津 300052)
摘 要:目的 观察生血丸对60Co 合并环磷酰胺致骨髓抑制小鼠造血功能的影响, 探讨该方促进全血细胞上调的
作用机制。方法 通过全自动血细胞分析仪检测外周血象;流式细胞术检测骨髓细胞细胞周期; EL ISA (酶联免疫
吸附法) 检测骨髓基质中红细胞生成素 ( EPO)、血小板生成素 ( TPO )、粒细胞生长因子 ( GCSF) 的量。结果 生
血丸能明显改善骨髓抑制小鼠外周血中白细胞 ( WBC)、红细胞 ( RBC)、血红蛋白 ( H B)、血小板计数 ( PLT )、骨髓
有核细胞 ( BM C) 的量 ( P< 0 05) ,生血丸组升红细胞疗效更为突出 ( P< 0 05) ; 生血丸组能解除 G0 / G 1期细胞阻
滞,促进 G0 / G1期细胞进入增殖周期; 生血丸能有效平衡微环境中 TPO 的量; 能改善 EPO 的表达; 对骨髓抑制小
鼠骨髓细胞上清中 GCSF 有明显的正调控作用。结论 生血丸能提高骨髓抑制小鼠外周血血细胞和骨髓有核细
胞计数; 可促进骨髓抑制小鼠骨髓细胞从 G 0/ G1期进入增殖周期; 并能有效调节骨髓微环境中 T PO、EPO 和
GCSF 的表达, 从而促进骨髓抑制小鼠的造血功能。
关键词:生血丸; 骨髓抑制; 造血功能; 红细胞生成素 ( EPO)
中图分类号: R286 1 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11185304
生血丸源于中医研究院广安门医院名老中医谢
海洲教授数十年临床之验方。方中有鹿茸、黄柏、山
药、炒白术、桑枝、白扁豆、稻芽、紫河车,具有补肾健
脾、填精补髓之功效。主药鹿茸温肾壮阳、强筋健
骨、生精益血,是峻补元阳之要药,用于治疗精血两
亏,活血又补血,具有促进造血之功能; 紫河车益气、
养血、补精, 有强壮作用; 白术、山药为健脾开胃之
品,于大补之中防滋腻, 有益气生血之作用: 黄柏为
泻火滋阴、清解清泻之品,取其缓解滋补过峻之作用
而有利于体内吸收,该方组方严谨,临床应用功效确
切。本实验拟从造血干细胞的增殖状况、造血微环
境的变化来探讨生血丸的作用机制。
1 材料
1 1 动物: 雄性 BalB/ C 小鼠, 中国人民解放军军
事医学科学院实验动物中心提供, 体质量 ( 20 2)
g , 8~ 12周龄, 许可证号 SCXK(军) 2007004。
1 2 仪器: ST ! 360 型酶标仪, 湖北中盛千湖科技
有限公司; EPICS XL 型流式细胞仪, 美国 BECK
∀1853∀中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100423 作者简介:严苏纯( 1967 ! ) ,女,江苏人,副教授,博士,研究方向为中医药对造血的调控。
T el : 13207607682 Email: d2004012@ 163. com
MANCOU LT ER 公司; M CD ! 15A 型 CO 2培育
箱,日本 SANYO 公司; CX ! 1 O 型倒置相差显微
镜,日本 Olympus公司。
1 3 药品与试剂:重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子
( granulocyte macrophagecolony stimulat ing factor,
GMCSF) ,华北制药金坦生物技术股份有限公司;
碘化丙啶 ( PI) 染色试剂盒, 凯基生物科技有限公
司; 小鼠红细胞生成素 ( ery thropoiet in, EPO )
ELISA Kit , Boatman Bio tech; 小鼠粒细胞集落刺
激因 子 ( gr anulocy te colonyst imulat ing factor,
GCSF) ELISA Kit , Boatman Biotech; 小鼠血小板
生成素 ( thr ombopoiet in, T PO) ELISA Kit , Boat
man Bio tech;生血丸干粉 (用液相色谱检测, 本品含
黄柏以盐酸小檗碱计,不得少于 0 20 mg / g ) , 中新
药业达仁堂制药厂提供。
2 方法
2 1 骨髓抑制小鼠动物模型的制备:骨髓抑制小鼠
模型的制备是本课题组经过反复实验论证、比较各
种造模方法而制定的方案[ 1]。具体方法如下: 小鼠
经 2 0 Gy 60Co 全身照射后的第4天开始 ip 环磷酰
胺 ( CTX) 50 mg/ kg (于临用前配制) , 每天注射 1
次,连续给药 3 d完成模型制备。
2 2 动物分组及给药: 将实验动物随机分为 4组:
生血丸组、模型组、对照组、阳性药组 ( GMCSF)。
除对照组外,其他 3 组均进行造模。小鼠造模完成
后 24 h 开始给药, 生血丸组每只小鼠按 10 g / kg
(相当于临床人用剂量的 20 倍) 的剂量,每天 ig 给
药。对照组和模型组 ig 等量生理盐水, 阳性药组 ip
GMCSF 125 g / kg,连续 7 d。
2 3 外周血细胞计数:末次给药后 24 h,经小鼠眼
球后静脉丛采血 20 L, 抗凝稀释后用全自动血细
胞分析仪进行血常规及其分类检测。
2 4 骨髓有核细胞悬液的制备: 末次给药后 24 h,
颈椎脱臼处死各组小鼠, 取出股骨,用 6号针头以 1
mL 生理盐水液冲出骨髓细胞, 4号针头滤过制成单
个骨髓细胞悬液。取部分骨髓细胞悬液在显微镜下
按白细胞计数法进行骨髓有核细胞 ( BMC) 计数。
2 5 细胞周期样品制备及分析:在给药 7 d后 24 h
分别取各组动物的股骨, 参照 2 4 项方法制备骨髓
有核细胞悬液。将单个骨髓细胞悬液离心 ( 1 000
r/ min, 5 min) , 去上清, 用 PBS 洗涤 2 次, 弃上清
液,滴入 70% 冷乙醇固定打散细胞,再用 PBS 洗 2
次,加 100 L PBS 混匀, 加 PI 染液 ( 4 # ,避光 30
m in) ,上流式细胞仪检测细胞周期的变化。
2 6 双抗体夹心 ABCELISA 法检测骨髓有核细
胞上清中的 EPO、T PO、GCSF 水平: 末次给药
24 h 分别取各组动物的股骨, 制备骨髓有核细胞悬
液。将单个骨髓细胞悬液离心 ( 1 000 r/ min,
5 min) ,保留上清,按照试剂盒说明操作, 酶标仪在
492 nm 处测吸光度值。
2 7 统计学方法: 实验所得数据用 SPSS 11 5 软
件统计,结果用 x s 表示,各组数据进行方差齐性
检验,同时进行单因素方差分析。
3 结果
3 1 生血丸对骨髓抑制小鼠外周血及骨髓有核细
胞计数的影响:实验结果显示模型组与对照组相比,
血中白细胞 ( WBC )、红细胞 ( RBC )、血红蛋白
( HB)、血小板计数 ( PLT)、BMC 的数量明显减少,
证明造模是成功的。生血丸组、阳性药组均能明显
改善骨髓抑制小鼠外周血中 WBC、RBC、HB、PLT、
BMC 的量 ( P< 0 05) , 生血丸组提高 RBC 数量疗
效更为突出, 与阳性药组相比有显著差异 ( P <
0 05)。见表 1。
3 2 生血丸对骨髓抑制小鼠骨髓细胞细胞周期的
影响:实验结果显示造模后骨髓细胞细胞周期出现
了停滞的状态, G 0 / G 1期细胞堆积, G 2 / M 期和 S 期
细胞明显减少。生血丸组和阳性药组均能解除
G 0 / G 1 期细胞阻滞,促进 G 0 / G 1期细胞进入增殖周
期,不断生成各类血细胞,并且两组之间无明显差异
( P> 0 05)。见表 2。
3 3 生血丸对骨髓抑制小鼠造血微环境中 EPO、
T PO、GCSF 表达的影响:实验结果显示生血丸组、
表 1 生血丸对骨髓抑制小鼠外周血及骨髓有核细胞计数的影响 ( x s, n= 6)
Table 1 Effect of Shengxue Pill on peripheral blood and bone marrow nucleated cell of myelosuppression mice (x s, n= 6)
组 别 剂量/ ( g ∀ kg - 1 ) WBC/ ( ∃ 109 ∀ L- 1 ) RBC/ ( ∃ 1012 ∀ L- 1 ) HB/ ( ∃ 109 ∀ L- 1 ) P LT / ( ∃ 109 ∀ L - 1) BMC/ ( ∃ 109 ∀ L- 1)
对照 - 8 26 4 52 10 77 2 18 154 83 7 35 287 16 36 42 10 66 1 03
模型 - 1 18 0 25* 2 83 1 46* 84 73 40 86* 163 66 38 37* 2 16 1 16*
生血丸 10 5 52 1 06% 8 38 1 58 % & 137 33 19 41 % 244 66 37 36% 8 33 2 58%
GMCSF 1 25∃ 10- 4 7 80 1 83% 5 69 0 59 % 137 50 5 35 % 259 00 61 77% 7 17 2 63%
与对照组比较: * P< 005; 与模型组比较: % P< 0 05; 与阳性药组比较: &P < 005
* P< 0 05 v s con tr ol group; %P < 0 05 v s model group; &P < 0 05 v s posit ive group
∀1854∀ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
表 2 生血丸对骨髓抑制小鼠骨髓细胞细胞周期的影响
( x s, n= 6)
Table 2 Ef fect of Shengxue Pill on cell cycle of bone
marrow nucleated cell of myelosuppression
mice ( x s, n= 6)
组别
剂量/
( g ∀ kg- 1 )
细胞周期/ %
G0/ G1 期 G2 / M S期
对照 - 56 36 1 97 11 50 1 49 32 31 1 12
模型 - 72 21 2 10* 6 56 0 89* 22 03 1 47*
生血丸 10 62 70 1 56% 9 26 0 81% 25 23 2 38%
GMCSF 1 25 ∃ 10- 4 64 88 2 02% 8 53 0 90% 24 91 2 33%
与对照组比较: * P< 005; 与模型组比较: % P< 0 05
* P< 0 05 v s con tr ol group; %P < 0 05 v s model group
阳性药组均能明显影响骨髓基质中 TPO、EPO、
GCSF 的量。正常情况下, 骨髓基质中只有很少量
的细胞因子。受造模的损害, 骨髓基质中 EPO、
TPO 的量急剧增加, 和对照组相比有明显的差异
( P< 0 05)。随着药物的应用, 微环境中的细胞因
子量会逐渐回落, 渐趋于正常。在对 TPO 的影响
中可以看到,生血丸组及阳性药组均能有效平衡微
环境中 T PO 的量, 两组之间比较无显著差异; 对
EPO 的影响显示,两组均能改善 EPO 的表达,生血
丸组疗效有更佳的趋势;在对 GCSF 的影响中, 两
组对骨髓抑制小鼠骨髓细胞上清中 GCSF 均有明
显的正调控作用,两组之间无明显差异 ( P> 0 05)。
见表 3。
表 3 生血丸对骨髓抑制小鼠造血微环境中 EPO、
TPO、GCSF 表达的影响 ( x s, n= 6)
Table 3 Ef fect of Shengxue Pill on EPO, TPO, and GCSF
in bone marrow matrix of myelosuppression
mice ( x s, n= 6)
组别 剂量/ ( g ∀ kg- 1 ) EPO TPO GCSF
对照 - 0 104 0 023 0 119 0 023 0 310 0 111
模型 - 0 323 0 066* 0 527 0 128* 0 114 0 024*
生血丸 10 0 169 0 050% 0 219 0 101% 0 223 0 097%
GMCSF 1 25 ∃ 10- 4 0 192 0 021% 0 278 0 174% 0 262 0 078%
与对照组比较: * P< 005; 与模型组比较: % P< 0 05
* P< 0 05 v s con tr ol group; %P < 0 05 v s model group
4 讨论
生血丸是具有补肾健脾、填精补髓之功效的临
床验方。临床广泛应用于放化疗骨髓抑制及再生障
碍性贫血。血细胞均起源于骨髓产生的造血干细
胞。正常情况下,大多数造血干细胞处于细胞周期
的静止期 ( G 0期) , 只有不到 10% 的造血干细胞处
于增殖状态,造血祖细胞尤其是早期造血祖细胞虽
然有高度增殖能力, 但也并非全部处于增殖周期中,
而静止期的造血干细胞或祖细胞进入细胞周期依赖
于造血因子的增加和(或)造血抑制因子的减少[ 23]。
在细胞周期的不同时相 ( G 1、S、G 2、M 期) 间,从 G1
期到 S 期、G2期到 M 期这两个阶段正处于复杂活
跃的分子水平变化时期, 易受外界条件的影响, 且
DNA 是辐射作用的靶分子。G0 / G1和 S+ G 2 / M 期
细胞数量比例的变化反映着细胞增殖周期状态。本
实验结果表明, 复合造模后小鼠的骨髓细胞中 G0 /
G 1期细胞比例显著高于对照组。产生了 G1期阻
滞,即抑制了细胞从 G 1期进入 S 期,使 DNA 合成
减少。进而使 DNA 合成的后期细胞 ( G 2期细胞)
和有丝分裂期细胞 ( M 期细胞) 减少。而生血丸组
及阳性药组小鼠 G 0 / G 1期骨髓细胞比例较模型组
均显著下降。S期和 G2 / M 期骨髓细胞比例较模型
组均显著上升。因此, 实验小鼠经复合造模后, 外周
血红细胞、白细胞、血红蛋白及骨髓有核细胞数与对
照组比较均显著下降 ( P< 0 05) , 证明造模成功。
流式细胞术检测, 进一步证实了骨髓细胞周期造模
后 G 1期阻滞, 使造血干细胞或祖细胞难以进入细胞
周期,导致外周血血细胞、骨髓有核细胞数下降,也是
模型组体外培养各祖细胞集落产率下降的成因之一。
在成人,骨髓是最为重要的造血场所,其中造血
干细胞、基质细胞及细胞外基质是骨髓造血的三大
支柱,后两者是目前研究最为关注的造血微环境。
造血微环境中造血调控因子协同调节造血干细胞的
增殖和分化。
EPO 是生理情况下调节红系生成的主要细胞
因子,主要调控红系造血干细胞的增殖、分化和成
熟,早期红系祖细胞 ( BFUE) 的增殖受 EPO、白细
胞介素3 ( IL3)、巨噬细胞集落刺激因子 ( MCSF)
等多种因子的调控, 晚期红系祖细胞 ( CFUE ) 则
主要受 EPO 的调节。EPO 对多向祖细胞 ( CFU
GEMM )、巨核细胞集落生成单位 ( CFUMeg )、粒
巨噬细胞集落生成单位 ( CFUGM ) 也有一定的调
控作用[ 4] ,并可直接作用于激活的 B 细胞,促进 B
细胞增殖。提高免疫球蛋白合成。据 Herm ine
等[ 5 ]和郭平等 [ 6]的研究报道, 正常小鼠骨髓细胞也
有 EPO mRNA 的表达。EPO 通过结合到其相应
受体 EPO 受体 ( EPOR) 而起作用。对骨髓抑制小
鼠骨髓基质中 EPO 的表达进行了检测, 表明生血
丸可平衡骨髓微环境中 EPO 的浓度, 从而促进周
围血红细胞的均衡产生。
T PO 主要促进巨核系祖细胞 ( menakaryocyte
colony fo rming unit , CFUMK) 增殖, 促进巨核细
胞增殖与分化成熟,以及血小板的成熟和释放。目
∀1855∀中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
前研究已表明 T PO 是体内调节血小板生成的首要
调节因子,此外 T PO 还具有显著的早期造血调控
作用,促进红系和巨核系在内的各系干祖细胞增
殖[ 78]。此外 T PO 还可通过其受体的吸收、灭活来
调控。本研究表明,造模后骨髓抑制小鼠外周血中
的血小板下降, 微环境中的 T PO 上升。服用生血
丸后,游离 T PO 的量逐渐下降,外周血中血小板的
量也逐渐回升, 达到一个血小板TPO 的自稳状态。
生血丸能明显有助于调节这种自稳状态。
粒细胞集落刺激因子 ( GCSF) 是由单核细胞、
巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞等多种细胞分泌
产生的一种重要的造血生长因子,能选择性和特异
性地刺激造血干细胞向中性粒细胞的定向增殖和分
化。动员造血干细胞进入外周血,并可加速粒细胞
成熟, 增强中性粒细胞的吞噬能力[ 9] ,增加内皮细胞
黏附受体的表达,促进白细胞黏附 [ 10]。中性粒细胞
水平具有 GCSF 基因剂量依赖性。本实验结果显
示,生血丸能上调 GCSF 的表达,同时解释了外周
血中白细胞数上调的原因。
参考文献:
[ 1] 严苏纯, 祝彼得, 陈志伟 几种骨髓抑制性贫血小鼠模型的
比较研究 [ J ] 成都中医药大学学报, 2007, 30( 1) : 3134
[ 2] 祝晓玲, 祝彼得 黄芪注射液对小鼠骨髓细胞增殖周期的影响 [ J] 中药材, 2000, 23( 10) : 625627
[ 3] 刘 屏, 王东晓, 陈若芸, 等 儿茶素对骨髓细胞周期及造
血生长因子基因表达的作用 [ J] 药学学报, 2004, 39( 6 ) :
424428
[ 4] Maxw ell P H, Fergu son D J P, Nicholl s L G, et al . Sites of
eryth ropoiet in product ion [ J] K idney Int , 1997, 51: 393
[ 5] H ermin e O, Beru N, Pech N, e t al . An autocrin e role for
eryth ropoiet in in mouse hematopoietic cell dif f erent iat ion [ J ]
Blood , 1991, 78: 22532260
[ 6] 郭 平, 王继峰, 王升启 芍药苷对放射线致血虚证小鼠骨
髓 EPO 和 GCSF 基因表达的影响 [ J] 山东中医药大学学报, 2005, 29( 3) : 236239
[ 7] Drachman J G Role of thrombopoietin in hematopoiet ic stem
cell and progenitor regulat ion [ J] Curr Op in H ematol ,
2000, 7( 3) : 183
[ 8] Fujiw ara T, H arigae H, Kameoka J, et al . A case of famil ial
thrombocytosi s: pos sible role of altered th rom bopoiet in p ro
duct ion [ J] H ematol , 2004, 76( 4) : 395
[ 9] 冯彦斌, 苑晓玲, 善亚君, 等 GCSF 受体胞内区结合蛋白
COXII 的分子克隆及相互作用验证 [ J] 生命科学研究,
2004, 8( 1) : 15
[ 10] Fuste B, Maz zara R, Escolar G, e t al . C ranu locyte colony
st imulat ing factor incr eases , expression of adhes ion receptors
on endothelial cell s throngh act ivat ion of p38 M APK [ J ]
H aematologica, 2004, 89( 5) : 578
复方鹿茸健骨胶囊治疗原发性骨质疏松症的∋期临床观察
李凤才1 ,谢海泉1 ,冷向阳2 *
( 1 白求恩医科大学制药厂, 吉林 长春 130012; 2 长春中医学院附属医院,吉林 长春 130021)
骨质疏松症是一种骨量减少和骨组织显微结构
受损,继而引起骨骼脆性增加和骨折危险度增高的
系统性骨骼疾病, 临床上常表现为疼痛, 身长缩短、
驼背、骨折等。其中以腰背部的疼痛最为常见,而骨
折是其最严重的并发症。骨质疏松症是老年性疾病
中的一种多见病、常见病, 属中医的(骨痿)、(骨痹)
的范畴。复方鹿茸健骨胶囊是长春中医学院附属医
院骨科张文泰教授与白求恩医科大学制药厂共同研
制开发的中药复方制剂, 由鹿茸、制首乌、龟甲、杜
仲、紫河车、当归等组成, 具有补肾壮骨、活血止痛的
功效, 主要治疗原发性骨质疏松症 ( 肝肾不足
证) [ 1] 。现将其∋期临床试验研究报道如下。
1 资料和方法
1 1 西医诊断标准:参照中国老年学学会骨质疏松
委员会骨质疏松诊断标准学科组 1999年 10 月 22
日制定的∗中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二
稿)+[ 2] :必须具备全身疼痛, 多以腰背疼痛为明显,
轻微外伤可致骨折;或脊柱后突畸形;或骨密度减少
2个标准差以上者。
1 2 中医诊断标准: 参照∗中药新药临床研究指导
原则+第 3辑中的(中药新药治疗骨质疏松症的临床
研究指导原则) [ 3]的评定要求制定。肝肾不足证:腰
背疼痛、腰膝酸软、足跟疼痛,以及头目眩晕、耳鸣耳
聋、夜尿频数等症状,舌质或偏红或淡, 脉或沉细或
弦细,骨质疏松症见上述证候者。
1 3 病理纳入及排除标准
1 3 1 纳入病理标准: ( 1)具有典型的骨质疏松症
临床症状,符合骨质疏松症西医诊断标准和中医辨
证属肝肾不足证者; ( 2)年龄在 45~ 70 岁者; ( 3)自
愿作为受试对象, 签署知情同意书,并能接受试验药
物剂型,保证完成疗程者。
1 3 2 排除病例标准: ( 1)不符合上述西医诊断及
∀1856∀ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100509 作者简介:李凤才( 1965 ! ) ,男,吉林长春人,高级工程师,主要从事新药研究与开发工作。
T el : ( 0431) 85888045 Email: xiehaiqu an2003@ 163. com