全 文 ：其具有操作简便、统计结果可靠的特点,可为麦冬化
学计量学分类及其质量评价提供有效参考。
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主产区远志种质资源遗传多样性的 ISSR分析
李 佳1 ,房敏峰1 , 周天华1 , 杨 佳1 ,刘 夙2 ,赵桂仿1 *
( 1 西北大学生命科学学院,西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,陕西 西安 710069;
2 中国科学院植物研究所,北京 100093)
摘 要:目的 对主产区远志种质资源进行遗传多样性研究。方法 利用 ISSR分子标记分析来自于主产区陕西、
山西和河北 3 个省的 10 个居群的远志种质资源的遗传多样性。结果 12 条 ISSR引物扩增出 276 条带, 其中有
271 条为多态性条带, 聚类分析结果表明,地理来源相同的野生居群和栽培居群先行聚合。野生和栽培远志居群的
遗传变异主要发生在居群间,栽培居群的遗传多样性略低于野生居群, 二者均不符合距离隔离模型。结论 聚类
分析结果与栽培居群多为就地取材的事实相符。造成远志这种遗传变异型式的原因在于其本身的繁殖生物学特
性以及当前的粗放栽培模式。
关键词:远志; 种质资源; ISSR; 遗传多样性
中图分类号: R282 7 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11188105
ISSR Analysis for genetic diversity of Polygala tenuif olia in its main production area
LI Jia
1
, FANG M infeng 1 , ZHOU T ianhua1 , YANG Jia1 , L IU Su2 , ZHAO Guifang1
( 1 Key Labor ator y of Resource Bio lo gy and Biotechno lo gy in Western China, M inistry o f Education, Co llege of L ife Sciences,
Nor thwest Univer sity, Xi an 710069, China; 2 Institute of Botany, The Chinese Academy
of Sciences, Beijing 100093, China)
Abstract: Objective T o discuss the genet ic diversity of Polygala tenui f olia in it s main pr oduct ion
ar ea Methods The genet ic diversity of ten populat ions of P tenui f ol ia f rom its main production area
Shaanx i, Shanxi, and Hebei Pro vinces, w as analyzed using ISSR markers Results T w elv e selected ISSR
primers g enerated a total o f 276 fragments, 271 o f w hich w ere polymorphic fr agments T he cluster analy
sis show ed that w ild and cult ivated populat ions f rom the same geog raphical area w ere cluster ed f irst Ge
netic variat ion of bo th w ild and cult ivated populat ions occurred mainly among populat ions, and the genetic
diversity of cult ivated populations w as low er than w ild ones, but both of them wer e not consistent w ith the
isolat ionbydistance model Conclusion T he r esul ts of cluster analysis agr ee w ith the fact that cult ivated
populat ions are derived direct ly f rom w ild ones nearby It w as it s ow n reproduct ive bio logical featur es and
the current ex tensive cult ivation that resulted in the genet ic pat tern of P t enuif olia Such analy ses can of
fer necessar y molecular biolog ical reasons for the ut ilizat ion and seed br eeding of P t enui f olia
!1881!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100225 基金项目:长江学者和创新团队发展计划( PC SIRT ) ;陕西省重大科技专项( 2006ZK10G3) ;陕西省教育厅产业化培育项目( 07JC17)作者简介:李 佳( 1984 ∀ ) ,女,内蒙古赤峰人,硕士,主要从事分子资源植物学方面的研究。
T el : 13927435825 15910862290 Email: doudou1984923413@ 126 com
* 通讯作者 赵桂仿 T el: ( 029) 88305207 Fax: ( 029) 88303572 Email: gf zhao@ nw u edu cn
Key words: Polygala tenui f ol ia Willd ; g ermplasm resources; ISSR; genet ic diversity
远志 Polygala tenuif ol ia Willd 又名细叶远
志,属远志科远志属, 为中药远志的主要、道地原植
物,产于全国各地。中药远志为大宗常用药材,具有
安神益智、交通心肾、祛痰和消肿之功效, 用于心肾
不交引起的失眠多梦、健忘惊悸、神志恍惚、咳痰不
爽、疮疡肿毒和乳房肿痛[ 1] 。近年来市场对中药远
志的需求逐年增长, 主产区山西、陕西和河北的野生
资源由于采挖过度, 几近枯竭,市场供应基本为栽培
药材。目前,对远志的研究主要集中在化学成分和
生物学特性等方面[ 2] ,遗传多样性研究报道较少 [ 3]。
王光志等[ 4] 曾采用 RAPD技术对远志和同属另一
种西伯利亚远志(卵叶远志) P sibir i ca L 的遗传
多样性进行了初步分析。简单重复序列间隔区
( intersimple sequence repeat , ISSR)是在微卫星基
础上发展起来的一种新的分子标记技术[ 5] , 除了具
有 DNA 分子标记的特点外,还有一些独特的优点,
如与 SSR标记相比, 无需事先知道靶序列[ 6] , 可以
产生丰富的多态性片段[ 7] ; 与 RAPD 标记相比, 由
于较高的退火温度和更长的引物序列, 扩增带的可
靠性和重复性更好[ 8] ; 与 AFLP 标记相比, 花费更
少;另外,模板需要量少,实验操作相对简单,结果记
录方便[ 9] 。本研究以远志 10个居群 188份样本为
材料,利用 ISSR标记技术,对远志在栽培和野生状
态下的遗传多样性进行分析,探索野生和栽培环境
对远志遗传多样性的影响,对远志种质有利基因的
开发和栽培种遗传基础的拓展具有重要意义。
1 材料和方法
1 1 材料: 实验材料采自商品远志主产区山西、陕
西、河北 3省,共 10 个居群, 188份样本, 经西北大
学王玛丽教授鉴定,材料来源和居群编号见表 1, W
代表野生居群, C 代表栽培居群。野外采集新鲜健
康的植物幼嫩叶片,用变色硅胶迅速干燥,带回实验
室整理保存备用。在采集的同时记录了相关的地理
参数。所用植物材料均采于 2007年。
表 1 野生和栽培远志居群的地理数据和遗传多样性信息
Table 1 Accession data and genetic diversity for wild and cultivated populations of P tenuif olia
居群代号 采样地点 纬度( N) 经度( E) 样本数 遗传多样性指数
a
PPB/ % h I
WHY 陕西合阳 35#07 110#17 20 55 07 0 189 5 0 285 4
WYC 山西运城 34#50 110#34 20 52 54 0 176 3 0 266 5
WXJ 山西新绛 35#30 110#07 13 37 32 0 131 5 0 196 2
WPY 山西平遥 37#12 112#16 20 47 46 0 157 0 0 237 2
WT X 河北唐县 38#53 114#46 20 40 22 0 128 7 0 195 8
居群平均值 40 22 0 128 7 0 195 8
物种水平 93 84 0 291 7 0 443 1
CHY 陕西合阳 35#07 110#17 20 39 49 0 133 3 0 200 2
CYC 山西运城 34#50 110#34 20 45 29 0 157 0 0 235 1
CXJ 山西新绛 35#30 111#07 20 46 38 0 154 3 0 232 6
CPY 山西平遥 37#12 112#16 20 41 30 0 132 7 0 201 8
CAG 河北安国 38#24 115#19 15 52 54 0 164 6 0 251 7
居群平均值 45 00 0 148 4 0 224 3
物种水平 85 51 0 242 7 0 373 1
a基于 1 000次排列检验的显著性水平,表 3同
a signif icant level based on arran ge inspect ion of 1 000 t imes, T able 3 is same
1 2 基因组 DNA 提取: 选取 0 05 mg 的干燥叶
片, 采用改良的 CT AB 法提取基因组 DNA, 用
1 0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量,并在紫外分光光
度计( Eppendorf Biophtometer)下检测其浓度,最后
用 0 1 ∃ TE 溶液稀释,标定到 25 ng /L,于- 20 %
冰箱储存备用。
1 3 引物筛选与 PCR扩增: 所用引物参照英属加
拿大哥伦比亚大学 UBC 公司 ( http: / / www
michaelsmith ubc ca/ services/ NAPS/ Primer Sets/
Primers Oct2006 pdf )公布的第 9 套 ISSR 引物序
列, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
每个居群随机选取 2个 DNA 模板在 10 L 的反应
体系中进行扩增筛选, 从 80 条引物中选取了 12条
扩增条带明亮清晰, 重复性好的引物(表 2)用于全
部 10个居群的样本分析。PCR扩增反应在 PTC ∀
200( M J Research, 美国) PCR 仪中进行, 反应体系
为: 25 ng DNA 模板, 1 0 L 10 ∃ buf fer (含 1 0
mmol/ L MgCl2 ) , 0 3 mmol/ L dNTP, 0 4 mmol/ L
!1882! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
引物和 0 6 U T aq DNA聚合酶, 以 ddH 2O补足体
系至 10 L。PCR扩增程序为 94 % 预变性 5 m in;
35个循环: 94 % 变性 45 s,最适退火温度下退火(温
度随引物而定, 见表 2,其中 Y= ( C+ T) , H= ( A +
T+ C) , V= ( G+ A + C) ; N L 为统计位点数目; N PL
为统计多态位点数目; T A 为最适退火温度) 45 s, 72
% 延伸 60 s;循环结束后 72 % 延伸 7 m in。
表 2 12 条引物的序列
Table 2 Seqnence of primers
引物代号 序列( 5 & 3 ) N PL / N L TA / %
UBC807 ( AG) 8 T 18/ 18 56
UBC808 ( AG) 8 C 14/ 17 59
UBC810 ( GA) 8 T 16/ 17 53
UBC811 ( GA) 8 C 19/ 20 58
UBC834 ( AG) 8 YT 14/ 17 54
UBC841 ( GA) 8 YC 17/ 19 58
UBC842 ( GA) 8 YG 15/ 17 59
UBC851 ( GT) 8 YG 16/ 18 58
UBC873 ( GACA) 4 15/ 17 57
UBC881 ( GGGGT) 3 19/ 20 58
UBC891 HVHTGT GTGTGTGTGTG 19/ 20 50
UBC899 GATGGTGTTGGTCATT GTTCCA 18/ 20 50
1 4 产物检测:扩增产物用 1 ∃ T BE 配制的 2 0%
琼脂凝胶电泳分离, 溴化乙锭( 0 5 g / mL EB) 染
色, 在 100 V 电压下电泳 1 5 h, 用 DL2000 作为
Marker(润德生物工程技术服务有限公司提供)。
电泳结束后在紫外凝胶成像系统( BioRad Labora
to ries,英国)中观察、记录、保存图像。
1 5 数据统计分析: ISSR为显性标记, 同一引物扩
增产物中,电泳率一致的条带被认为具有同源性,按
照电泳图谱中同一位置上 DNA 带的有无进行统计,
有带记为 1,无带记为 0, 形成 01矩阵输入计算机。
用POPGENE( version 1 32)软件统计分析遗传多样
性和遗传结构的参数:多态位点百分率( Percentage of
polymorphic bands, PPB) , Shannon 表型多样性指数
( I ) , Nei基因多样性指数( h) , Nei遗传距离( GD )和遗
传一致度 ( GI ) , Nei 遗传分化指数 ( Gst )和基因流
( Nm)。基因流(Nm )与 Nei基因分化指数( Gst )之间存
在等式关系: N m= ( 1/ Gs t- 1) / 4。以上所有指标的
计算均在 HardyWeinber g 平衡假设条件下进行。
根据N ei的无偏差遗传距离, 利用 MEGA( ver
sion 4 0)软件对居群进行 U PGMA 聚类分析。用
GENALEX( version 6 1)软件包, 构建欧式平方距
离,在此基础上对居群进行主成分分析( PCA )来检
测居群的遗传相似性。用 Arlequin( version 3 0)软
件包,基于样品间的欧式平方距离,对其进行分子等
级分析( analy sis of molecular variance, AMOVA)
来估计遗传变异在居群间和居群内的分布。另外,
研究还进一步利用 TFPGA( version 1 3)软件进行
Mantel检验,检测居群间遗传距离与地理距离之间
的关系。
2 结果
2 1 物种和居群水平的遗传多样性: 用 2 0%琼脂
糖分离 ISSR扩增结果, 能产生清晰的条带(图 1)。
12条引物能在 188份样本中扩增出 276 条带,平均
每条引物扩增出 23个条带, 其中 271( 98 19%)条
带具多态性。野生远志在物种水平上多态性高
( PPB= 93 84%) ; 在居群水平上遗传多样性最高和
最低的分别是陕西合阳居群( PPB= 55 07%)和山
西新绛居群( PPB= 37 32%) , 平均为 46 52%。栽
培远志在物种水平上的 PPB 值为 85 51% ;在居群
水平上遗传多样性最高和最低的分别是河北安国居
群 ( PPB = 52 54% ) 和陕西合阳居群 ( PPB =
39 49% ) ,平均为 45 00%(表 1)。
图 1 引物 UBC899 对WPY居群 20 个个体的扩增结果
Fig 1 Twenty ISSR amplification patterns for population WPY using Primer UBC899
2 2 居群的遗传结构: 分子变异分析结果显示, 栽
培和野生远志居群间的遗传分化指数( Fs t )分别为
0 508 9和 0 540 6,即遗传变异发生在居群间的比
率分别为 50 89%和 54 06% ,栽培居群略低于野生
居群(表 3)。POPGEN E分析结果也表明野生居群
的遗传分化程度 ( Gst = 0 465 4) 略高于栽培居群
( Gs t= 0 389 3)。野生居群和栽培居群的 N m 分别为
0 574 2和0 784 3, 说明远志经过栽培后, 遗传分化
!1883!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
降低, 基因流增加。10 个远志居群中 CXJ居群与
WXJ居群的遗传距离最近, 为0 187 7; CAG 居群
和WHY居群最远,为0 508 6(表 4)。
表 3 远志 10个居群 ISSR变异的 AMOVA
Table 3 Hierarchical analyses AMOVA for ISSR variation
surveyed in ten populations of P tenuif olia
变异来源 自由度 离均差平方和 变异组分
变异百分
率/ % P值
a
远志(野生)
居群间 4 2 187 361 25 27 5406 < 0 001
居群内 88 2 114 123 24 02 4594 < 0 001
远志(栽培)
居群间 4 1 792 904 20 51 5089 < 0 001
居群内 90 1 955 117 21 72 4911 < 0 001
2 3 聚类分析: U PGMA 树(图 2)显示, 相近来源
地的野生居群和栽培居群先聚在一起(其中河北安
国的栽培居群与邻近的唐县野生居群聚合) ,形成 5
小群。它们再聚成 2支、3 组, 第 1 支包含 2 组, 即
HY 小群单独为 ∋组, YC和 XJ小群聚为 (组;第 2
支包含 1组,即由 PY 和 T X( AG)小群聚合而成的
)组。PCA分析结果(图 3)与 UPGMA 聚类树基
本一致:相近来源地的野生和栽培居群先聚为 5小
群;沿着 X坐标轴方向,它们再形成 2区域, 第 1区
域包含 ∋组和 (组, 第 2 区域包含 )组。另外,
M antel检验表明 5 个野生居群的遗传距离与其地
理距离之间无显著相关性( P> 0 05)。
表 4 远志 10 个居群遗传一致度 I(对角线以上)和遗传距离 D(对角线以下)
Table 4 Nei s genetic identity ( above diagonal) and genetic distance D ( below diagonal) among ten populations
居群 WHY WYC WXJ WPY WTX CHY CYC CXJ CPY CAG
WHY 0 699 7 0 741 0 0 673 2 0 657 7 0 779 0 0 660 2 0 731 1 0 645 2 0 601 3
WYC 0 357 1 0 763 7 0 663 1 0 688 5 0 658 0 0 813 4 0 686 3 0 633 3 0 623 4
WXJ 0 299 8 0 269 6 0 693 6 0 675 1 0 681 0 0 722 9 0 828 8 0 634 6 0 657 6
WPY 0 395 7 0 410 8 0 365 8 0 694 1 0 695 0 0 627 5 0 653 6 0 806 2 0 709 0
WT X 0 419 0 0 373 3 0 392 9 0 365 1 0 656 0 0 649 2 0 695 2 0 681 4 0 811 3
CHY 0 249 7 0 418 7 0 383 8 0 364 3 0 421 8 0 633 2 0 693 9 0 660 9 0 658 8
CYC 0 415 2 0 206 5 0 324 5 0 466 1 0 432 0 0 457 0 0 698 5 0 647 5 0 646 0
CXJ 0 313 2 0 376 5 0 187 7 0 425 3 0 363 5 0 365 0 0 358 8 0 603 0 0 639 0
CPY 0 438 1 0 456 8 0 454 8 0 215 4 0 383 7 0 414 0 0 434 6 0 505 8 0 753 7
CAG 0 508 6 0 472 6 0 419 1 0 343 9 0 209 1 0 417 0 0 437 0 0 447 8 0 282 8
图 2 远志 10个居群的 UPGMA树
Fig 2 UPGMA Dendrogram of ten populations
of P tenuif olia
3 讨论
3 1 野生和栽培居群的遗传关系分析: U PGMA
树和 PCA 图都显示,相近来源地的野生和栽培居群
先聚在一起,这与各地栽培远志的种子大都就近取
材的事实是一致的。
3 2 野生和栽培居群的遗传多样性:与本项研究同
时,笔者另对全国 20个远志野生居群(包括本研究
涉及到的 5个)的遗传多样性做了分析(待发表) , 得
出的基本结论是,野生远志较高的种内遗传多样性
主要取决于其广泛的地理分布; 其居群内的遗传多
样性也高于具有类似生活型而生境破碎化的其他物
图 3 野生和栽培远志 10个居群 188 个个体的 PCA图
Fig 3 PCA of 188 individuals f rom ten wild and cultivat
ed populations of P tenuif olia
种。本项研究对栽培居群的遗传多样性和遗传结构
分析表明,栽培居群的遗传多样性低于野生居群的
遗传多样性,这主要与以下几方面的因素有关: ( 1)
远志用种子繁殖, 选种是其栽培的第一步,而选种不
可避免会造成遗传多样性的下降; ( 2)生境整齐均
一、高密度栽培的田间生境通常比破碎的野外生境
更利于基因交流, 因此栽培驯化时间越长,栽培居群
的遗传多样性越低。本项研究涉及的栽培远志居
群,如陕西合阳、山西运城和平遥居群均有较长的栽
!1884! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
培驯化历史,这可以解释其较低的遗传多样性。
虽然如此,栽培居群仍然保持了相当的遗传多样
性。其原因分析可能是: ( 1)目前的远志栽培较粗放,
未开展足够的育种工作;从遗传角度来看,现在栽培
的远志实际上处于半野生状态,栽培远志居群相当于
野生远志居群在人工露地种植环境下的延续。( 2)远
志的营养繁殖不发达,分蘖能力有限,虫媒传粉, 自交
不育,这些特点使得远志的繁育系统在野生环境和栽
培环境下区别不大,因此对其遗传多样性的变化影响
也不大。( 3)远志的结实率不高,因此每年新播下的
远志种子必然来自众多的母株,这也增加了遗传多样
性;如果每年新播的种子仅仅来源于少量母株,一两
代之后遗传多样性就会有极大下降。
在本项研究涉及的栽培远志居群中,山西新绛
和河北安国的遗传多样性反而高于邻近的野生居
群,除了上述可能的原因之外,还可能有各自的独特
原因:与其他野生居群相比,新绛的野生居群生境破
碎化严重,导致样本采集个体数过少,因此对其遗传
多样性有可能低估。安国位于华北平原北部中心地
区,长期的农业开垦已使原先可能存在的野生远志
资源绝迹,其栽培用的种子系从唐县和平遥引入; 种
子引进的多元化丰富了该地区栽培种的遗传多样
性,从而使之高于唐县的远志野生居群。
另外,在对全国 20个野生远志居群的遗传多样
性进行分析后还发现, 野生远志的遗传分化符合经
典的距离隔离模型[ 10] ,但是对本研究所涉及的野生
居群进行相关性检验之后, 发现遗传距离与相应的
地理距离并无相关性(尽管聚类关系基本和地理关
系相符)。这说明在地理范围较狭的时候,远志的遗
传分化与距离隔离模型有较大偏差,前一分析体现
出来的与模型的符合须在较大的地理尺度上才能体
现出来。
3 3 对远志育种的建议:本项研究结果从遗传学上
证实,目前的远志栽培多为就地取种,在遗传上相当
于在人工环境上让远志进行半野生生长, 类似于对
野生远志的迁地保护, 这在作物栽培上属于较原始
粗放的方式。现在已经有不少关于远志栽培技术的
文献报道 [ 1114] , 主要关注播种、催苗和田间管理环
节,但优秀种质资源的缺乏却是制约远志产业发展
的更大瓶颈。
对于今后的远志育种, 有如下建议:第一,远志
营养繁殖不发达, 结实率不高,严重影响了远志栽培
规模的扩大。应当选育有较强营养繁殖能力或较高
结实率的品种。第二, 至少从清代后期开始,陕西中
东部、山西南部一直被视为远志的道地产地,但据考
证,在历史上远志实际上并无明确的道地产地[ 15]。
因此,对于远志的道地性是以遗传型的表现为主,还
是以生态饰变为主, 需要通过移植实验等手段进行
确定。由于野生远志居群分布广泛, 如果证明其道
地性有较多的环境影响因素,在育种时理应充分利
用其分布区范围内的种质资源, 而不仅是道地产地
的种质资源。第三, 由于栽培远志居群仍有较高的
遗传多样性,因此远志的育种材料可以优先在栽培
居群中遴选。第四, 野生远志资源较高的遗传多样
性表明, 其资源开发的潜力可观。现存的野生远志
居群应予以有效保护, 以供今后育种取材之用。
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!1885!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月