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裙带菜多糖诱导人食管癌细胞 TE13 凋亡的实验研究
商晓辉*
(河北工程大学医学院, 河北 邯郸 056002)
摘 要:目的 探讨裙带菜多糖诱导人食管癌细胞 T E13 凋亡的作用及其机制。方法 采用 MTT 法分析裙带菜
多糖 ( 25、50、100 g/ mL ) 分别作用 24、48、72 h 后对 TE13 细胞增殖的抑制作用; 用透射电镜观察 25、50、100
g / mL 裙带菜多糖分别作用 48 h 后细胞的凋亡结构变化;用流式细胞术分析 TE13 细胞的凋亡率和检测 Sur
v ivin 蛋白的表达水平。结果 不同质量浓度的裙带菜多糖均可明显抑制食管癌 T E13 细胞的增殖 ( P< 0 05) ,
其抑制作用呈质量浓度依赖性,作用 24 h 后的 IC50为 44 8g / mL。不同质量浓度裙带菜多糖作用 48 h 后,均可
诱导 TE13 细胞凋亡, 100 g/ mL 裙带菜多糖可诱导 T E13 细胞凋亡率达 70 51% , 导致 TE13 细胞发生凋亡特
征性超微结构改变,并使 T E13 细胞 Surviv in 蛋白表达水平明显降低 ( P< 0 01)。结论 裙带菜多糖可抑制 TE
13 细胞增殖,诱导细胞凋亡, 该作用与下调细胞 Survivin 蛋白表达有关。
关键词:裙带菜多糖; 食管癌; 细胞凋亡; Sur viv in 蛋白
中图分类号: R286 91 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 07115004
裙带菜 Undaria p innati f ida ( Harv. ) Sur. 为
多年生大型褐藻,属于昆布纲,与海带同属于藻类植
物。裙带菜成分主要包括多糖类化合物 [ 1]、挥发油、
类脂、固醇类、亚麻酸和花生四烯酸等不饱和脂肪
酸。裙带菜多糖可用于防治缺碘性甲状腺肿、动脉
硬化、高脂血症、高血压等。近年来关于海藻多糖的
抗癌研究报道很多 [ 2~ 4] , 但关于裙带菜多糖诱导食
管癌细胞凋亡研究很少。本实验探讨裙带菜多糖抗
食管癌的机制, 为研发抗肿瘤新药提供实验依据。
1 材料与方法
1 1 裙带菜多糖的提取和纯化:采用传统的水提
乙醇沉淀法。取裙带菜洗净, 捣碎后, 甲醛浸泡固
色,用 30 倍的 pH 8. 0 的蒸馏水加热提取 5 h, 滤
过,浓缩, 浓缩液加入 3倍量的乙醇, 静置过夜, 离
心,收集沉淀物, 再进行一次加水溶解, 80% 乙醇沉
淀,离心,收集沉淀物进行透析, 透析保存液再加入
无水乙醇沉淀得裙带菜多糖。裙带菜多糖粗品含较
多的水溶性蛋白, 60 蒸馏水溶解,用 2% 三氯乙
酸 ( T CA) 使水溶性蛋白变性, 静置过夜, 6 000 r/
m in 离心 30 min, 收集上清液, 以 75% 乙醇沉析,
离心收集沉淀。最后进行透析脱盐, 用蒸馏水对多
糖粗品进行溶解, 使用相对分子质量为 12 000 透析
袋,每袋 5 mL, 蒸馏水搅拌透析过夜, 24 h 换一次
蒸馏水,收集透析液,蒸发浓缩, 减压干燥, 得到多糖
晶体(收率 0 4% )。取裙带菜多糖晶体样品 200 g ,
混合溶于 2 L 蒸馏水中, 用 0. 45 m 微孔滤膜滤
过,滤液用 RPM I 1640 培养基稀释 (终体积分数小
于 0 1%)。
!1150! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 20091127 基金项目:邯郸市科技厅资助项目 ( 08231080622)作者简介:商晓辉( 1976 ∀ ) ,女,山东省聊城人,硕士,讲师,研究方向是肿瘤免疫学、抗肿瘤中药研究。Email: geer345@ sina. com
1 2 试剂: RPM I 1640 培养基为美国 Gibco 公司
产品, MT T、碘化丙啶 ( P I)、二甲基亚砜 ( DM SO)
及兔抗人 Survivin 单克隆抗体为美国 Sigma 公司
产品。
1 3 细胞株及其培养: 人食管癌细胞 T E13 由河
北医科大学第四医院科研中心提供。用含 10% 胎
牛血清、100 U / mL 青霉素和 100 U / mL 链霉素的
RPM I 1640 完全培养基, 置于 37 、5% CO 2和饱
和湿度条件下培养。
1 4 实验方法
1 4 1 MT T 法检测裙带菜多糖对 TE13 细胞增
殖的影响[ 5] :取对数生长期 T E13 细胞,调整细胞
浓度为 1 # 105 / mL,接种于 96 孔培养板,每孔 100
L (含细胞数为 1 # 104个)。实验组加入含不同质
量浓度裙带菜多糖 ( 25、50、100 g / mL) 的培养基
100 L, 阴性对照组加入 RPM I 1640 培养基 100
L, 阳性对照组加入含羟基喜树碱 ( 30 g/ mL) 的
培养基 100 L, 每组均设 3 个复孔, 置饱和湿度、
37 、5% CO2培养箱中分别培养 24、48、72 h,每天
用倒置显微镜观察细胞形态学变化,实验终止前每
孔加入 MT T ( 5 mg/ mL) 20 L,继续培养 4 h, 弃
上清液,每孔加入 150 L DMSO, 振荡 10 min, 待
结晶溶解后, 用酶标仪于 570 nm 波长测定吸光度
( A ) 值。计算细胞生长抑制率, 用 POMS 软件计算
IC50值。
抑制率= ( 1- 实验组平均 A 值/对照组平均 A 值) # 100%
1 4 2 透射电镜观察细胞凋亡的超微结构: 调节
TE13细胞浓度为 1 # 105 / mL, 移至六孔培养板,
板底面放入无菌玻片,实验组在 TE13 细胞悬液中
加入含不同质量浓度的裙带菜多糖 ( 25、50、100
g/ mL) 的培养基 100 L,对照组加入等量 RPMI
1640 培养基, 于 37 培养 48 h后,收集 T E13 细
胞, PBS 洗涤后, 2 5% 戊二醛固定,梯度酒精脱水,
树脂包埋, 超薄切片, 铀铅双重染色,透射电镜观察
细胞超微结构变化[ 6] 。
1 4 3 流式细胞术测定细胞凋亡率:收集经不同质
量浓度裙带菜多糖 ( 25、50、100 g/ mL) 作用 48 h
后的 T E13 细胞, PBS 洗涤 3次, 70% 乙醇固定,
PI 染色,用流式细胞仪分析细胞凋亡率。
1 4 4 流式细胞术检测 Sur vivin 蛋白表达: 细胞
分组及处理方法同 1 4 3项。将细胞经 70% 乙醇
固定后加入兔抗人 Sur vivin 单克隆抗体,室温孵育
30 min, PBS 洗涤, 加入 PE羊抗兔 IgG 二抗, 37
孵育 50 min, PBS 洗涤, 流式细胞仪检测, 以 X
mode 值表示 Survivin 相对量。
1 4 5 统计学方法: 应用 SPSS 11 5 软件对所有
数据进行统计学处理, 结果以 x ∃ s 表示,两组间均
数比较用 t检验。
2 结果
2 1 对 TE13 细胞增殖的抑制作用: 25、50、100
g/ mL 的裙带菜多糖均可抑制 TE13 细胞增殖,
且随裙带菜多糖质量浓度的增加和作用时间延长抑
制作用增强, 抑制率最高达 70 51% ,作用 72 h 的
IC50为 18 3 g / mL, 与阴性对照组相比差异显著
( P< 0 01)。见表 1。
表 1 裙带菜多糖对 TE13 细胞的增殖抑制作用
( x ∃ s, n= 3)
Table 1 Effect of polysaccharides from [WTHX] U. pinnatifida[ WTHZ]
on proliferation of TE13 cells (x ∃ s, n= 3)
组别 / ( g ! mL- 1)
抑制率/ %
24 h 48 h 72 h
对照 - 0 0 0
羟基喜树碱 30 42 82 ∃ 2 35* * 68 1 4 ∃ 1 10* * 74 07 ∃ 0 88* *
裙带菜多糖 25 40 88 ∃ 1 52* * 59 9 8 ∃ 1 52* * 63 91 ∃ 0 36* *
50 56 17 ∃ 3 25* * 60 6 4 ∃ 2 06* * 68 46 ∃ 0 37* *
100 59 49 ∃ 2 12* * 68 9 8 ∃ 2 94* * 70 51 ∃ 0 97* *
与对照组比较: * * P< 0 01
* * P < 0 01 v s cont rol group
2 2 对 T E13 细胞超微结构的影响: 经不同质量
浓度裙带菜多糖作用 48 h后, T E13 细胞发生细胞
凋亡特征性超微结构改变, 表现为细胞体积缩小,胞
浆浓缩,核不规则,核染色质固缩浓聚呈块状,边集
于核膜下,胞浆空泡化,出现凋亡小体等改变。而对
照组细胞体积大, 核仁大而明显, 核浆比例大,微绒
毛和内质网丰富, 细胞器结构正常, 未发现凋亡征
象。见图 1。
2 3 对 T E13 细胞凋亡的影响:经 25、50、100 g/
mL 裙带菜多糖作用 48 h 后, 流式细胞术分析结果
显示, T E13 细胞发生了明显的凋亡现象, 随药物质
量浓度增加凋亡率增加, 细胞凋亡率分别为
39 01%、50 39%、68 23%, 与对照组 ( 凋亡率
21 99% ) 相比差异显著 ( P< 0 05) , 见图 2。
2 4 对 TE13 细胞 Survivin 蛋白表达的影响:经
25、50、100 g/ mL 裙带多菜糖处理 48 h 后, T E13
细胞 Surv iv in 蛋白表达 ( Xmode 值 ) 分别为
16 967 ∃ 0 456、9 328 ∃ 0 356、6 006 ∃ 0 224, 随药
物剂量增加 Survivin 蛋白表达逐渐降低。50、100
g/ mL 处理组显著低于对照组 ( 17 917 ∃ 0 504)
( P< 0 01) , 25 g / mL 处理组蛋白表达低于对照
组,但差异无统计学意义 ( P> 0 05) ,见图 3。
!1151!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
3 讨论
目前肿瘤的预防还十分困难,而海藻多糖近年
来成为抗肿瘤新药开发的研究方向。本实验 MT T
结果显示, 25、50、100 g/ mL 裙带菜多糖对 TE13
细胞增殖具有明显的抑制作用,作用 72 h 对肿瘤细
胞增殖抑制率可达 70 51%。
细胞凋亡不仅与肿瘤的发生、发展及退化有密
切的关系, 而且是肿瘤治疗的主要目标。诱导细胞
凋亡已成为目前抗肿瘤药物研究的热点。本研究电
子透镜观察结果表明, 25、50、100 g/ mL 裙带菜多
糖分别作用于 TE13 细胞 48 h 后, 可诱导细胞发
生典型的凋亡结构改变,凋亡率与裙带菜多糖质量
浓度成正比。
为了进一步探讨裙带菜多糖诱导 TE13 细胞
凋亡机制, 本实验采用不同质量浓度裙带菜多糖
( 25、50、100 g/ mL) 作用于 T E13细胞 48 h, 发现
!1152! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
用药后 Survivin 蛋白的表达水平显著降低。Sur
v iv in 是细胞凋亡抑制基因,编码的蛋白属于凋亡抑
制蛋白 ( inhibito r of apoptosis pro tein, IAP) 家族
成员, Surv iv in 在成人体内除胸腺、生殖腺中有微量
表达外,所有分化成熟的组织, 均无表达, 但在许多
人类肿瘤组织中表达水平升高[ 6]。Survivin 通过直
接抑制 caspase3 和 caspase7, 使二者分离, 抑制
caspase 蛋白酶活性[ 7] ,从而抑制其诱导肿瘤细胞凋
亡。本实验结果显示,裙带菜多糖作用后 TE13 细
胞的 Survivin 蛋白表达明显减少, 提示裙带菜多糖
诱导 T E13 细胞凋亡的机制与 Survivin 有关。
本实验结果表明, 裙带菜多糖可显著抑制 T E
13 细胞增殖, 该作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关, 这
些作用的进一步研究, 可为裙带菜多糖抗肿瘤作用
的开发和利用奠定基础。
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沙棘提取物对麻醉开胸犬血流动力学的影响
李路平1 ,岳海涛2 ,吕铭洋3 ,陈 霞4* ,祁 乐5
( 1 吉林大学中日联谊医院 药剂科, 吉林 长春 130031; 2 白求恩医科大学制药厂,吉林 长春 130012;
3 吉林大学珠海学院 化学与药学系,广东 珠海 519041; 4 吉林大学白求恩医学院 药理学教研室,
吉林 长春 130021; 5 吉林大学第三临床学院,吉林 长春 130012)
摘 要:目的 研究沙棘提取物对麻醉开胸犬血流动力学的影响。方法 24 只犬随机分为 4 组,沙棘按 4、16 mg/
kg 2 个剂量静脉滴注给药; 阳性对照药舒血宁注射液组静脉滴注 2 3 mg/ kg ;模型组静脉滴注生理盐水, 记录给沙
棘提取物后犬血流动力学各参数。结果 与模型组比较, 沙棘 4、16 mg / kg 组犬的心输出量 ( CO)、心肌血流量
( MBF)、心脏指数 ( CI)、心搏指数 ( SI) 增加 (P < 0 05、0 01) , 总外周阻力、冠脉阻力降低 ( P< 0 05、0 01)。结论
沙棘提取物具有明显改善麻醉开胸犬血流动力学的作用。
关键词:沙棘; 血流动力学; 心输出量
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 07115304
沙棘 H ippop hae r hamnoides L. 是胡颓子科
落叶灌木, 在我国资源丰富, 具有相当高的药用价
值[ 1]。国内外对沙棘的化学成分及其功效进行了大
量研究,发现其含有丰富的维生素、脂肪酸、微量元
素及黄酮类物质,在抗凝血、防止血管栓塞、抗衰老、
抗疲劳、增强机体活力和免疫力等方面都显示出独
特的治疗效果[ 2, 3] 。本课题组前期研究了沙棘对犬
心肌氧代谢的作用[ 4] ,证明了沙棘能明显降低心肌
氧摄取率。但沙棘对犬血流动力学则较少见系统研
究,因此,本实验研究沙棘提取物对麻醉开胸犬血流
动力学的影响, 深入探讨其药理作用, 为临床合理、
安全用药提供依据。
1 材料与方法
1 1 动物: 健康杂种犬, 雌雄兼用, 体质量 12~ 16
kg,由吉林大学实验动物中心提供。
1 2 药品: 沙棘提取物 (含异鼠李素和槲皮素 10
mg/ 100 g ) 由吉林大学白求恩医学院药理教研室提
供;舒血宁注射液由山西银湖制药有限责任公司生
产,批号 2005071401。
1 3 仪器: RM ∀ 6000 型多导生理记录仪、MFV ∀
1200型电磁流量计, 日本光电公司生产。SC ∀ 3 电
动呼吸机,上海医疗器械厂生产。
1 4 方法: 健康成年杂种犬 24 只, 随机分为 4组
(每组 6只) ,分别为模型组 ( NS) ,沙棘提取物 4、16
!1153!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 20100105 作者简介:李路平( 1962 ∀ ) ,男,吉林长春人,主管药师,主要从事新药开发研究。
* 通讯作者 陈 霞