全 文 ：丹参酚酸与牛血清白蛋白结合反应的特性和结构相关性研究
邹晓丽,王湘敏,郭海方, 许 卉* ,刘 珂
(烟台大学药学院, 山东 烟台 264005)
摘 要: 目的 研究丹参酚酸与牛血清白蛋白的结合反应特性及其结构相关性。方法 运用荧光和紫外光谱法研
究了 4种小分子天然丹参酚酸类化合物迷迭香酸、紫草酸、丹参酚酸 A、丹参酚酸 B( SA ~ )与牛血清白蛋白
( BSA )的相互作用。结果 计算得到各 SABSA 结合体系的静态表观结合常数( K A )、结合位点数( n)、能量转移效
率( E)、空间距离( r)及热力学常数 G、H 和 S。4 种丹参酚酸均能与 BSA 结合形成非共价复合物, 通过静态猝
灭和非辐射能量转移共同导致 BSA 内源荧光的猝灭。结论 丹参酚酸 A( SA ! )主要通过疏水作用力与 BSA 结
合,而其余 3 种丹参酚酸与 BSA 的结合则主要由氢键和范德华力驱动。SABSA 相互作用体系的结合强度可以用
综合反应参数[ Y= lg( K A ∀ E ∀ n/ r ) ]来表征, 其在数值上按 SA ! # SA # SA∃ # SA 的顺序递减, 并与分子中
所含游离羟基数目和分子体积等结构特性密切相关, 可以利用脂水分配系数 ( clogP)和单位相对分子质量下的拓
扑分子极性表面积( tPS A / M r )来预测丹参酚酸化合物与蛋白的结合程度。
关键词:丹参酚酸; 牛血清白蛋白;相互作用; 结构相关性;荧光光谱法
中图分类号: R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 08127104
Characteristic of salvianolic acid binding to bovine serum albumin
and structureperformance relationship
ZOU Xiaoli, WANG Xiangmin, GU O Haifang , XU Hui, LIU Ke
( Schoo l of Pharmacy, Yantai Univ ersit y, Yantai 264005, China)
Abstract: Objective To study the characterist ic of salv ianolic acid ( SA) binding to bovine ser um albu
min ( BSA) and the st ructureper formance relationship Methods The interact ions betw een BSA and four
natur al SA ( SA , rosmaric acid; SA ∃, lithosperic acid; SA !, salvianolic acid A; and SA , salvianolic
acid B) w er e invest ig ated by fluorescence and ultr av io let spectr oscopy Results The intr insic f luo rescence
of BSA was quenched by SA via forming SABSA complexes and nonradiation ener gy t ransfer The
parameters of SABSA binding process, such as the stat ic apparent associat ion constant K A , the number of
binding site n, the ef ficiency of energy tr ansfer E, the spatial distance r wer e obtained, and the thermody
namic constants G, H , and S were calculated Conclusion T he results indicate that SA ! bounds to
BSA mainly through a hydrophobic force and the o ther three SABSA interact ions are mainly driven by
hydro gen bond and Van der W aals% force Y , a comprehensive binding par ameter const ruct ing f rom the
equat ion Y= lg ( K A ∀ E ∀ n/ r) , could be used to ref lect the interaction extent of SABSA sy stem T he Y
value changes w ith the number of free phenolic hydro xy l and molecule volume and decr eases in the or der of
SA ! #SA # SA ∃ # SA T he results from correlat ion analysis indicate that it could be possible to
est imate SABSA binding ex tent from hydrophobic parameter clogP and topopolar surface area per unit of
molecular weight tPS A / Mr o f SA mo lecule
Key words: salv ianolic acids ( SA) ; bov ine serum albumin ( BSA) ; interact ion; st ructureperformance
relat ionship; f luo rescence spect ro scopy
分子生物学和分子药理学的发展使人们能够从
基因水平理解某些疾病的发病机制,并通过分子设
计来寻找有效的治疗药物。因此药物小分子与蛋白
质、DNA 等功能大分子的相互作用成为化学和生命
&1271&中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 20091212 基金项目:山东省高等学校科技计划项目( J09LF08) ;山东省高校优秀青年教师国内访问学者项目( 2007)作者简介:邹晓丽( 1984 ∋ ) ,女,福建人,硕士研究生,研究方向为天然药物化学。Email : pharmzxl@163 com
* 通讯作者 许 卉 T el: ( 0535) 67060308009 Em ail : xu hui33@ sina com
科学相关交叉领域的研究热点, 光谱法则是这类研
究的常用方法 [ 15]。作为传统中药丹参活血化瘀作
用的主要功能成分, 丹参酚酸 ( salviano lic acids,
SA)是一类同时包含新木脂素骨架和咖啡酞缩酚酸
结构的化合物, 具有抗氧化、治疗心肌缺血等多种重
要的生理活性 [ 67]。本实验采用荧光光谱和紫外光
谱法研究了迷迭香酸( SA )、紫草酸( SA ∃)、丹酚
酸 A( SA !)和丹酚酸 B( SA ) 4种重要的丹参酚
酸(化学结构见图 1)与牛血清白蛋白( bov ine serum
album in, BSA)的相互作用,并探讨了 SA 与蛋白结
合反应特性与化学结构的相关性, 所得结果有助于
阐述这类化合物的分子作用机制, 并为体外筛选和
药物设计提供有价值的信息。
1 仪器与材料
图 1 SA 的化学结构
Fig 1 Chemical structures of SA
CARY ∋ Eclipse 型分子荧光光谱仪(美国 Var
ian) ; UV ∋ 2550 型双光束紫外可见分光光度计
(日本 Shimadzu) ; 微量注射器; 旋涡混合器; pHS ∋
3酸度计。
牛血清白蛋白(相对分子质量 68 000, 质量分
数> 98%, 北京军区兽医防治中心生物工程研究
室) ; SA 、SA ∃、SA !和 SA 均由本实验室分离
制备,并经 IR、UV、1HNMR、13CNMR 确证结构,
反相 HPLC 归一化质量分数均大于 99%。其余试
剂均为分析纯, 实验用水为 MilliQ超纯水。
2 方法与结果
2 1 溶液的配制: 牛血清白蛋白以 pH 7 4 Tris
HCl缓冲液为溶剂, 配成 1 0 ∀ 10- 6 mo l/ L 储备溶
液, 4 ( 保存备用; 4种 SA 单体化合物分别用水配
成 1 0 ∀ 10- 4 mol/ L 的溶液, 内含 0 1 mol/ L
NaCl,以维持离子强度。
2 2 光谱的测定: 取 BSA 标准溶液 3 0 mL 于
1 cm石英比色皿中, 置循环水控温比色槽中 (内置
微型磁力搅拌器) , 用微量注射器逐次加入 SA 溶
液, 进行光谱滴定。每次滴定结束, 磁力搅拌 10
min, 停止搅拌并静置5 m in后,在 280 nm 激发波长
下,扫描 300~ 500 nm 荧光光谱,结果见图 2。测定
26 ( 时与 BSA 相同浓度( 1 0 ∀ 10- 6 mol/ L )的 SA
溶液 300~ 500 nm 紫外吸收光谱。按同样方法
进行其他 3种 SA 溶液的光谱测定。
2 3 SABSA 相互作用参数的计算:分别在 26 (
和 37 ( 下测定了不同浓度 SA ~ SA 对 BSA 荧
1~ 90 17, 0 33, 0 50, 0 67, 0 83, 1 00,
1 17, 1 33, 1 50 mol/ L SA
图 2 SA与 BSA结合荧光光谱图
Fig 2 Fluorescence spectrum of SA binding with BSA
光强度的影响。按文献方法 [ 34]处理实验数据,得到
SA 类化合物BSA 结合过程的动态荧光猝灭常数
( K SV )、静态表观结合常数( K A )和结合位点数( n)、
结合过程的热力学参数、化合物的 UV 光谱与 BSA
的荧光光谱的图谱重叠积分( J )、化合物与 BSA 之
间的能量转移效率( E)以及化合物与 BSA 荧光性
氨基酸残基间的平均空间距离( r )等作用参数,结果
见表 1。
2 4 SABSA 荧光猝灭机制的探讨: 由于分子结构
中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在, 使 BSA 具有
内源荧光 ( ex 225 nm, em 345nm )。图 2 中, 随着
SA 浓度的增加, BSA 的内源荧光强度有规律地降
低,且发射峰的峰位与峰形均不变, 表明 SA I 对
BSA 的荧光有猝灭作用。SA ∃~ SA 与 SA 类
似,都能引起 BSA荧光的猝灭。
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表 1 SABSA结合过程的相互作用参数
Table 1 Interaction parameters of SABSA binding process
参 数 温度/ ( SA SA ∃ SA ! SA
K SV / ( 10
5 L & mol- 1 ) 26 1 19( R2 = 0 9994 6) 2 64( R2 = 0 996 8) 3 30( R2 = 0 997 0) 2 60( R 2= 0 997 3)
37 1 05( R2 = 0 988 3) 2 46( R2 = 0 998 4) 2 63( R2 = 0 994 3) 3 04( R 2= 0 999 8)
K A / ( 104 L & m ol- 1) 26 0 116 ( R2= 0 996 9) 55 0( R2 = 0 997 9) 18 5( R 2= 0 998 0) 26 4( R 2= 0 998 1)
37 0 028( R2 = 0 995 8) 4 72( R2 = 0 998 5) 75 6( R 2= 0 997 9) 16 5( R 2= 0 999 8)
n 26 0 647 9 1 041 9 0 958 3 0 997 6
37 0 520 0 0 875 4 1 086 9 0 953 4
H / ( kJ& m ol- 1) 26 - 100 84 - 172 03 98 62 - 32 93
37 - 100 84 - 172 03 98 62 - 32 93
G/ ( kJ& mol- 1) 26 - 17 54 - 32 86 - 30 15 - 31 03
37 - 14 48 - 27 74 - 34 89 - 30 96
S / ( J& mol- 1 & K- 1 ) 26 - 278 41 - 465 14 430 38 - 6 35
37 - 278 40 - 465 15 430 40 - 6 35
J/ ( 10- 14 cm3 & L & mol- 1 ) 37 1 354 4 1 251 9 1 689 1 1 456 5
E 37 0 09 0 12 0 24 0 17
r/ nm 37 5 81 5 43 4 96 5 21
不存在猝灭剂时, 生物大分子的荧光平均寿命
( !0 )约为 1 ∀ 10- 8 s[ 9]。根据 K SV = K q ∀ !0 , 以及表 1
数据,计算得各试验反应体系动态猝灭速率常数 K q
的量级为 1013 ,均远大于各种猝灭体对生物大分子动
态猝灭速率常数的最大值 2 ∀ 1010 L/ ( mol & s) [9] ,据
此可以推断, 4种 SA对 BSA内源性荧光主要不是以
分子扩散控制的动态猝灭而是静态猝灭。
根据 Frster 的偶极偶极非辐射能量转移原
理,可以进一步计算药物分子与 BSA 内源性荧光的
主要产生部位第 212 位的色氨酸残基间的距离
( r)
[ 10]。由表 1数据可以看出, SA ~ SA 与 BSA
中色氨酸残基之间的 r 值均小于 7 nm, 表明试验的
4种 SA 均能够插入 BSA 分子内部,形成稳定的非
共价复合物,非辐射能量转移与静态猝灭共同导致
SA 对 BSA 的荧光猝灭。
2 5 SABSA 结合反应的作用力类型: 根据结合反
应前后热力学参数焓变( H )和熵变( S)的相对大
小,可以进一步判断小分子有机化合物与蛋白质间
的主要作用力类型。当 H > 0、S > 0时, 主要作
用力为疏水作用力; 当 H < 0、S < 0时,主要作用
力为氢键和范德华力;当 H < 0、S> 0时,主要作
用力为静电引力[ 11]。表 1的数据表明, SA ~ SA
与 BSA 的结合均是 Gibbs 自由能降低的自发过
程。其中, SA 、SA ∃、SA 与 BSA 间的作用力主
要为氢键作用力和范德华力,而 SA !BSA 结合过
程的主要驱动力则为分子间疏水相互作用。
2 6 SABSA 结合反应特性与化学结构的相关性:
比较表 1 中的数据可以发现, 37 ( 时 4 种 SA 与
BSA 结合作用的 K A、E 和 n 按 SA ! # SA # SA
∃# SA 的顺序递减, 同时 r 按上述顺序递增, 表
明 SABSA 结合作用按以上顺序逐渐减弱。
为了便于进行结构相关性分析,根据以上测定
结果,构造一个综合反应参数 Y 以反映 SABSA 分
子结合程度, Y = lg ( K A ∀ E ∀ n/ r ) , 计算结果见表
2。所得 Y 值按 SA ! # SA # SA ∃ # SA 顺序
依次减小。
表 2 SA ~ SA 的主要理化特性参数
Table 2 Main physicochemical parameters
of SA ∋ SA
丹参酚酸 M r NH clogP* tP SA* / MW Y
360 4 1 099 6 0 401 4 0 353 2
∃ 538 5 1 347 8 0 392 7 2 960 5
! 494 6 2 527 6 0 374 5 4 599 4
718 7 1 840 5 0 387 2 3 710 4
针对研究中的 4 种小分子 SA 化合物, 利用
ChemBioDraw 软件( U ltr a 11 0)计算了与分子结构
密切相关的两个理化特性参数脂水分配系数
( clogP )和拓扑分子极性表面积( tP SA ) , 并以相对
分子质量(M r)为因子校正分子体积大小对分子极
性表面积的影响, 得参数( tPS A/ M r ) , 结果见表 2。
可以看出, clogP、tPS A/ Mr 在数值上分别按
SA !# SA # SA ∃# SA 的顺序递减和递增,并
与参数 Y 随分子结构的变化趋势呈现明显的相关
性。进一步以 clog P( X 1)和 tP SA / M r( X 2 )为自变
量,以 Y 为应变量, 分别进行多项式回归分析,得回
归方程:
Y= - 2 806 4 X 12+ 12 808 X 1- 9 935 1( R= 0 955 0)
Y= - 6 814 9 X 22+ 5 131 9 X 2- 961 51( R= 0 998 2)
回归方程拟合度良好, 拟合曲线见图 3。
可以看出, 在相对分子质量不变的情况下, SA
分子结构中游离羟基数目减少, 其 clog P 值增大,同
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图 3 SABSA结合程度参数和理化特性参数的拟合曲线图
Fig 3 Correlation between SABSA binding parameter Y
and physicochemical property parameters
时分子的极性表面积减小, 与蛋白的结合作用将增
强;在游离羟基数目一定的情况下,相对分子质量增
大,将使单位相对分子质量下的分子极性表面积减
小,其与蛋白的结合作用将增强。因此, 分子中结构
中羟基数目和分子体积综合影响 SABSA 的相互
作用,疏水性和氢键结合能力是与丹参酚酸BSA 结
合程度相关的两个理化特性。
3 讨论
本实验研究结果表明, 对于天然的小分子 SA
类化合物, 在药物设计中, 综合考虑脂水分配系数
和单位相对分子质量下的拓扑分子极性表面积这两
个理化参数来预测其与蛋白的结合作用程度, 将可
以获得切实可靠的参考数据。
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半夏白术天麻汤提取液的血清指纹图谱研究
王淑玲1 ,孙秀梅2 ,张兆旺2 ,谢 恬1*
( 1 杭州师范大学 生物医药与健康研究中心 ,浙江 杭州 310012; 2 山东中医药大学药学院,山东 济南 250014)
摘 要:目的 比较半夏白术天麻汤 4 种方法提取液的血清指纹图谱。方法 取大白兔, ig 半仿生生物酶提取
( SBEE)液, 采集不同时刻的血样, 分离含药血清,用 HPLC 法和 UV 法测定,将 H PLC 色谱峰数目、峰总面积以及
紫外吸光度平均值标准化处理,加权求和后得综合评判 Y 值,以 Y 值大者为较佳采血时刻; 然后对 4 种方法提取液
此时刻的含药血清进行指纹图谱比较。结果 给药后 2 h 的含药血清综合评判 Y 值最大; 4 种方法提取液 2 h 含
药血清以 SBEE 液综合评判 Y 值最大。结论 SBEE 液含药血清较水提法、醇提法、SBE 法提取液含药血清中成分
量高。
关键词:半夏白术天麻汤; 4种提取液; 含药血清指纹图谱
中图分类号: R284 2 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 08127406
Comparison of serum fingerprint in extract solution from Banxia Baizhu Tianma Decoction
WANG Shuling1 , SUN Xiumei2 , ZHANG Zhaowang2 , XIE T ian1
( 1 Biomedicine and H ealth Inst itute of H ang zhou No rmal U niversit y, H angzhou 310012, China; 2 Co llege
of Pharmacy, Shandong Univ ersity of T r aditional Chinese Medicine, Jinan 250014, China)
Abstract: Objective Comparing the serum fingerprint of four kinds of ex tr act so lut ion f rom Banxia
&1274& 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 2010 年 8 月
* 收稿日期: 20091029 作者简介:王淑玲( 1972 ∋ ) ,女,山东东营人,讲师、博士, 1995年获山东中医药大学学士学位, 2005年获江西中医学院中药学硕士学位,
2009年获山东中医药大学药学院中药学博士学位,从事中药新药研究与中药炮制原理研究的科研、教学工作。
T el: ( 0671) 28868269 Email: w sling000@ 163 com