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黄芪苷通过 PI3K/ Akt 信号通路抗 H2O2诱导的
H9c2 细胞氧化损伤
张
琦, 彭
洋,宋君秋,吴艳娜, 刘艳霞
(天津医科大学基础医学院 药理学教研室, 天津
300070)
摘
要: 目的
研究黄芪苷对 H2O2诱导的 H 9c2 细胞氧化损伤的保护作用及其作用机制。方法
建立 H 2O2诱
导的 H 9c2 细胞氧化损伤模型, MTT 法检测细胞存活率, DNA 抽提及琼脂糖凝胶电泳、Hoechst 33258 染色、
caspase3 活性检测细胞凋亡, Western blotting 检测 tAkt 和 pAkt 蛋白的表达。结果
与 H2O 2组比较, 10、20
mg/ L 的黄芪苷均显著提高细胞存活率, 降低 caspase3 活性,减轻细胞凋亡; 且均显著上调 pAkt 蛋白的表达;
PI3K / Akt 抑制剂 LY294002 部分阻断 10、20 mg / L 黄芪苷的保护作用。结论
黄芪苷部分通过 P I3K / Akt
通路发挥对 H 2O2诱导的 H 9c2 细胞氧化损伤的保护作用。
关键词: 黄芪苷; H 2O2 ; H 9c2;细胞凋亡; PI3K/ Akt ; LY294002
中图分类号: R285
5


文献标识码: A


文章编号: 0253- 2670( 2010) 06- 0955- 05


氧化应激是机体在遭受各种有害刺激时,体内
活性氧 ( react ive oxygen species, ROS) 产生过多,
氧化程度超出抗氧化物的清除能力, 氧化系统和抗
氧化系统失衡而导致组织损伤的过程。近年来大量
研究表明,氧化应激与多种心血管疾病如高血压、动
脉粥样硬化、心肌肥大、心力衰竭等密切相关[ 1]。黄
芪苷( Ast ragaloside , AST) 是黄芪总苷中的
主要有效成分, 研究发现 AST 可以有效改善心功
能,对心肌受抑制大鼠的心肌收缩及舒张功能都有
改善作用[ 2~ 4] , 具有明显的抗氧化损伤作用[ 5]。有
研究发现黄芪提取物能够促进缺氧/复氧损伤的神
经元细胞磷酸化 Akt 蛋白表达增加 [ 6]。现已证实,
P I3K/ Akt 信号通路在心肌保护作用中具有重要作
用[ 7] ,活化的 PI3K 可激活下游信号蛋白 A kt ,进而
发挥抗凋亡作用, 促进 DNA 损伤修复。本研究以
H 2O2诱导 H9c2 细胞氧化损伤为模型, 在研究
AST 细胞保护作用的同时探讨其保护作用与
PI3K/ Akt 信号通路的关系。
1
材料
1
1
细胞株: H9c2 细胞, 购于中国医学科学院基
础医学研究所细胞中心。
1
2
药物与试剂: 黄芪苷( A ST , 上海医科大学
天然药物化学教研室提供, 质量分数> 98%) ; 高糖
DMEM ( Gibco 公司) ;胎牛血清 ( Hyclone 公司) ;
30% H 2O2、DMSO (分析纯) ; MT T ( Amresco 公
司) ; PI3K/ A kt 抑制剂 LY294002 ( Sigma 公司) ;
考马斯亮蓝蛋白质定量试剂盒 (南京建成生物工程
研究所) ; DNA Ladder 抽提试剂盒 (碧云天生物技
!955!中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 6 期 2010年 6月
收稿日期: 20091123





















作者简介:张
琦( 1985 ∀ ) ,女,天津人,硕士生,研究方向:心血管药理学及分子药理学。
Tel: ( 022) 23542523
Email: z hangqi8501@ 126. com
* 通讯作者
刘艳霞
Tel: ( 022) 23542523
Email : liu _yanx ia@ yahoo. com
术研究所) ; H oechst 33258 染色试剂盒及 Caspase
3 检测试剂盒 (南京凯基生物科技发展有限公司) ,
兔抗鼠 tAkt 和 pAkt ( Ser473) 单克隆抗体 ( Cell
Signaling T echnolo gy 公司) ; 羊抗兔 IgG (北京中
杉金桥生物技术有限公司)。
1
3
仪器: CO 2孵箱 ( Thermo 公司) ; SW ∀ CJ ∀ 1F
型净化工作台 (苏州净化设备有限公司) ; 680 型酶
标仪、电泳仪、转膜仪、凝胶成像仪 ( BIORAD 公
司) ; 5417型低温高速离心机 ( Eppendorf 公司) ;荧
光显微镜 ( Olympus公司)。
2
方法
2
1
H9c2 细胞培养: H9c2 细胞培养于含 10%
FBS 的高糖 DMEM 培养基中,于 5% CO2、饱和湿
度及 37 # 条件下培养, 每 2~ 3 d 更换 1 次培养
基。将对数生长期的细胞以 8 ∃ 104 / mL 或 1
2 ∃
105 / mL 的密度接种于 96 或 6 孔板中,于培养箱中
培养。
2
2
实验分组: 细胞培养 24 h, 换用无血清高糖
DMEM 培养基并加入不同试药。各组加入 H 2O2
后作用 6 h。实验分组: 对照组, 加入无血清高糖
DMEM 培养基; H 2O 2组, 加入 H 2O 2终浓度为 200

mo l/ L ; AST ( 10 mg/ L ) + H 2O2组, 同时加入终质
量浓度为 10 mg/ L 的 AST 和 200
mol/ L 的
H 2O 2 ; AST ( 20 mg/ L) + H 2O 2组,同时加入终质量
浓度为 20 mg / L 的 A ST 和 200
mol/ L 的 H 2O2 ;
LY294002+ H 2O 2组, LY294002 10
mo l/ L 预处理
10 min,再加入终质量浓度为 200
mo l/ L 的 H 2O2
组; LY294002 + AST ( 10 mg/ L ) + H 2O 2 组,
LY294002 10
mol/ L 预处理 10 m in, 再同时加入
终浓度为 10 mg/ L 的 AST 和 200
mol/ L 的
H 2O 2 ; LY294002 + AST ( 20 mg/ L ) + H 2O 2组,
LY294002 10
mol/ L 预处理 10 m in, 再同时加入
终质量浓度为 20 mg/ L 的 AST 和 200
mo l/ L 的
H 2O 2。
2
3
MT T 法检测细胞存活率: 取各组细胞, 每孔
加入 MT T 溶液 20
L,放入培养箱中继续培养 4 h
后弃培养基, 每孔加入 150
L DMSO, 震荡 10
m in, 490 nm 波长处检测吸光度 ( A ) 值,以 A实验组 /
A 对照组 ∃ 100%计算细胞存活率。
2
4
Hoechst 33258 染色: 取各组细胞, 弃去培养
基,用 DHank%s 液洗涤细胞 2 次, 然后加入 Ho
echst 33258 室温染色 10 m in, 用蒸馏水洗去染液,
用荧光显微镜在激发波长 340 nm 处观察并拍照。
2
5
caspase3 活性检测: 使用分光光度法检测细
胞中 caspase3活性。收集细胞, 加入裂解液, 细胞
于冰上裂解 30 min, 4 # 下 12 000 r/ m in 离心, 取
上清 5
L 用 Bradford 法进行蛋白定量, 各组均取
等量蛋白加入 2 ∃ 反应缓冲液及 5
L caspase3 作
用底物, 37 # 避光孵育 4 h, 405 nm 处测定 A 值,
以 A实验组 / A对照组的值表示 caspase3的活性。
2
6
DNA 抽提及琼脂糖凝胶电泳: 根据 DNA
Ladder 抽提试剂盒说明书进行操作。收集并裂解
细胞后,抽提 DNA 并定量,各组取 6
g DNA 样品
上样, 2% 琼脂糖凝胶电泳, 30 V 电泳 3 h, 观察
DNA 梯状条带。
2
7
Western blo tt ing 检测[ 8] : 收集各组细胞, 用
4 # 预冷裂解液冰上裂解 30 min,冰上刮取细胞, 4
# 下 12 000 r/ m in 离心 5 m in。取上清, - 80 #
保存备用。用 Bradford 法测定蛋白浓度。制备
12% 分离胶和 5% 浓缩胶。将蛋白与 5 ∃ 上样缓
冲液混匀, 煮沸 5 min。上样总蛋白为 80
g, 加入
电泳缓冲液, 80 V 电泳 30 min,待进入分离胶后改
为 120 V 约 1
5 h。再以 200 mA, 转 PVDF 膜
2 h。5% 脱脂奶粉封闭 1 h 后,加入相应兔抗鼠一
抗 ( pAkt 1 & 1 000, tA kt 1 & 1 000) , 4 # 过夜,
TBST 洗膜 3次, 每次 10 min。加入过氧化物酶标
记的羊抗兔 IgG ( 1 & 10 000) , 室温孵育 1 h。
TBST 洗膜 3次, 每次 10 min。加入 ECL 显色液,
曝光显影。结果运用 Quant it iv e 软件进行分析, 计
算条带的吸光度值。采用所测 pAkt 蛋白条带与
tAkt 条带的比值来表示 pAkt 蛋白的表达水平。
2
8
数据处理:结果数据以 x ∋ s 表示,采用 SPSS
16
0 软件进行统计学处理分析, 对所测定结果进行
正态性及方差齐性检验, 各组间比较使用 Oneway
ANOVA 检验。
3
结果
3
1
MT T 法检测细胞存活率: 与对照组比较,
H 2O2处理使细胞存活率明显降低 ( P < 0
01) ; 与
H 2O2组比较, 10、20 mg/ L A ST 均显著提高细胞存
活率 ( P< 0
01) ; 分别与 10、20 mg / L AST 比较,
加入 LY294002 后细胞存活率显著下降 ( P <
0
01) ,而与 H 2O2组比较无显著差异, 结果见图 1。
3
2
Hoechst 33258 染色: 结果显示, 对照组细胞
形态完整,细胞核染色均匀。而 H2O2处理后细胞
不规则固缩凝聚, 呈致密浓染,细胞核分裂成碎片;
与 H2O2组比较, 10、20 mg/ L AST 均能减轻细胞
核凝聚, 减少细胞碎片; 分别与 10、20 mg/ L AST
比较,加入 LY294002后细胞核碎片明显增加,细胞
!956! 中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 6 期 2010年 6月
1对照
2H2O2
3AST ( 10 mg ! L- 1 ) + H 2O2
4AST ( 20 mg ! L- 1) + H 2O 2
5LY294002+ H2O 2
6LY294002+ AST ( 10 mg ! L- 1 ) + H2O 2
7LY294002+ AST ( 20 mg ! L- 1 ) + H2O 2
与对照组比较: * * P < 0
01; 与 H2O 2组比较: # # P < 0
01
与 AST ( 10 mg ! L- 1 ) + H 2O 2组比较: ( ( P< 0
01
与 AST ( 20 mg ! L- 1 ) + H 2O 2组比较: ) ) P< 0
01
* * P < 0
01 v s cont rol group; # # P < 0
01 v s H2O 2 group
( (P < 0
01 v s AST ( 10 mg ! L- 1 ) + H 2O 2 group
) )P < 0
01 v s AST ( 20 mg ! L- 1 ) + H 2O 2 group
图 1
AST 和 LY294002 对 H2O2损伤的 H9c2
细胞存活率的影响 ( x∋ s, n= 10)
Fig. 1
Effect of AST and LY294002 on viability
of H9c2 cells injuried by H2O2( x ∋ s, n= 10)
核呈致密浓染; 见图 2 (箭头所示为凋亡细胞)。
3
3
DNA Ladder 检测: 琼脂糖凝胶电泳结果显
示,与对照组比较, H 2O2处理后 DNA 片段分布较
弥散, DN A 梯状条带明显; 与 H 2O2组比较, 10、20
mg/ L AST 减轻 DNA 片段弥散程度, DNA 梯状条
带不明 显; 与 10、20 mg / L AST 比 较, 加 入
LY294002 后 DNA 片段分布较弥散, DNA 梯状条
带明显;见图 3。
3
4
caspase3 活性检测: 结果显示, 与对照组比
较, H 2O2处理使 caspase3 活性显著升高 ( P <
0
01) ;与 H 2O2组比较, 10、20 mg/ L AST 均明显
降低 caspase3 活性 ( P< 0
01) ; 与 10、20 mg/ L
AST 比较, 加入 LY294002 后 caspase3 活性均明
显升高 ( P< 0
01) ,见图 4。
3
5
pAkt/ tAkt 蛋白表达变化: Western blot t ing
检测显示, 与对照组比较, H 2O2处理使 pAkt 蛋白
表达增加 ( P< 0
05) ;与 H 2O 2组比较, 10、20 mg/ L
AST 能够明显增加 pAkt 蛋白的表达 ( P< 0
01) ;
与 10、20 mg/ L AST 比较, 加入 LY294002 后 p
Akt 蛋白的表达被明显抑制 ( P < 0
01) ; 各组 t
Akt 蛋白表达水平无明显改变,见图 5。
A对照
BH 2O 2
CAST ( 10 m g ! L - 1) + H 2O 2
DAST ( 20 mg ! L- 1 ) + H2O2
ELY294002+ H 2O2
FL Y294002+ AST ( 10 mg ! L- 1) + H 2O 2
GLY294002+ AST ( 20 mg ! L- 1 ) + H 2O2
图 2
AST和 LY294002 对 H2O2损伤的 H9c2 细胞核 Hoechst 染色的影响
Fig. 2
Effect of AST and LY294002 on nuclei Hoechst staining of H9c2 cells injured by H2O2
4
讨论


氧化应激是心血管疾病的重要病理反应过程。
心肌损伤时, 自由基的产生远远超过自身内源性抗
氧化系统的清除能力。过多的自由基可以引起脂
质、蛋白质、核酸的过氧化, 最终导致疾病的发生。
ROS 是生物体内的主要自由基,机体中的 ROS 不
仅具有氧化性, 更能引发级联反应,从而产生更多的
ROS。细胞内 ROS 水平升高时, 可以促进细胞内
Ca2+ 浓度升高, 并上调 bax 相关基因的表达, 开放
线粒体通透性转换孔,激活 caspases,而导致细胞凋
亡。H 2O2是细胞内氧化代谢的中间产物, 是研究细
胞氧化应激损伤的主要工具。本研究证明, 200
!957!中草药
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第 41 卷第 6 期 2010年 6月
MDNA Marker
1对照
2H2O 2
3AST ( 10 mg! L- 1 )+ H2O2
4AST ( 20 mg ! L- 1) + H 2O 2
5LY294002+ H2O 2
6LY294002+ AST ( 10 mg ! L- 1 ) + H2O 2
7LY294002+ AST ( 20 mg ! L- 1 ) + H2O 2
图 3
AST 和 LY294002 对 H2O2损伤的 H9c2 细胞 DNA
片段化的影响
Fig. 3
Effect of AST and LY294002 on DNA fragmen
tation of H9c2 cells injured by H2O2
1对照
2H2O2
3AST ( 10 mg ! L- 1 ) + H 2O2
4AST ( 20 mg ! L- 1) + H 2O 2
5LY294002+ H2O 2
6LY294002+ AST ( 10 mg ! L- 1 ) + H2O 2
7LY294002+ AST ( 20 mg ! L- 1 ) + H2O 2
与对照组比较: * P < 0
05
* * P< 0
01
与 H 2O 2组比较: # # P < 0
01
与 AST ( 10 mg ! L- 1 ) + H 2O 2组比较: ( ( P< 0
01
与 AST ( 20 mg ! L- 1 ) + H 2O 2组比较: ) ) P< 0
01
* P< 0
05
* * P < 0
01 v s cont rol group
# # P< 0
01 v s H 2O2 group
( (P < 0
01 v s AST ( 10 mg ! L- 1 ) + H 2O 2 group
) )P < 0
01 v s AST ( 20 mg ! L- 1 ) + H 2O 2 group
图 4
AST和 LY294002 对 H2O2损伤的 H9c2 细胞
caspase3 活性的影响 ( x ∋ s, n= 10)
Fig. 4
Effect of AST and LY294002 on caspase3 activity
of H9c2 cells injured by H2O2( x ∋ s, n= 10)

mo l/ L H 2O 2作用 6 h,能够显著诱导 H9c2细胞存
活率下降, caspase3 活性升高, DNA 片段弥散程度
1对照
2H 2O 2
3AST ( 10 mg ! L- 1) + H 2O 2
4AST ( 20 mg ! L- 1 ) + H 2O2
5LY294002+ H 2O 2
6L Y294002+ AST ( 10 mg ! L- 1) + H 2O 2
7L Y294002+ AST ( 20 mg ! L- 1) + H 2O 2
与对照组比较: * P< 0
05
* * P < 0
01
与 H2O 2组比较: # # P< 0
01
与 AST ( 10 mg ! L- 1) + H 2O2组比较: ( (P < 0
01
与 AST ( 20 mg ! L- 1) + H 2O2组比较: ) )P < 0
01
* P < 0
05
* * P< 0
01 v s cont rol gr ou p
# # P < 0
01 v s H 2O 2 group
( (P< 0
01 v s AST ( 10 mg ! L- 1) + H 2O2 group
) )P< 0
01 v s AST ( 20 mg ! L- 1) + H 2O2 group
图 5
AST 上调 H2O2损伤的 H9c2 细胞 pAkt 的表达
(x ∋ s, n= 3)
Fig. 5
AST increases pAkt expression of H9c2 cells
injured by H2O2 ( x∋ s, n= 3)
及凋亡细胞数明显增加。
目前大量研究已证实, 黄芪具有较好的心肌保
护作用,并已被广泛应用于心血管疾病的治疗中 [ 9]。
AST 作为黄芪总苷中重要的单体成分,能够显著改
善心肌功能,减轻缺氧/复氧或自由基等造成的心肌
损伤[ 10]。本研究发现, AST 能够显著提高 H 2O2诱
导的 H9c2细胞存活率,减少小片段 DNA 及凋亡细
胞数,降低 caspase3活性,这些都说明 AST 对 H 2O2
诱导的 H9c2 细胞凋亡具有保护作用。
PI3K/ Akt 通路是细胞内重要的生存通路, 该
通路的激活可减轻细胞凋亡。Akt 是 PI3K 下游重
要的靶蛋白,可经 PI3K/ Akt 信号途径的磷酸化作
用生成 pAkt 而被激活。研究发现, 诱导心肌细胞
过表达 Akt 或激活 Akt ,能够显著抵抗心肌细胞的
缺 氧/复 氧 损 伤[ 11] 。而 PI3K/ Akt 抑 制 剂
LY294002 能够加重缺氧诱导的心肌细胞凋亡。
PI3K/ Akt 的抗凋亡作用主要依赖于线粒体功能,
!958! 中草药
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第 41 卷第 6 期 2010年 6月
降低 bax 基因的表达, 细胞内 Ca2+ 浓度及 caspase
3 活性。已有研究发现,黄芪提取物能够促进缺氧
复氧损伤的神经元细胞 pAkt 表达增加 [ 6]。本研
究在 AST 对 H 2O2诱导的 H9c2 细胞凋亡具有保
护作 用 的 基 础 上, 应 用 PI3K/ Akt 抑 制 剂
LY294002, 发现阻断 PI3K/ Akt 通路后, AST 对
H 2O 2诱导的 H 9c2 细胞损伤的保护作用被部分取
消。本实验还通过 Western blot t ing 检测显示,
AST 能够上调 pA kt 的表达, 这都说明 AST 的保
护作用是部分依赖于 PI3K/ Akt 通路的。
总之, AST 对 H 2O 2诱导的 H9c2 细胞氧化损
伤具有一定的保护作用, 其作用机制与其激活
PI3K/ Akt 细胞信号通路有关。
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w ays to the res cue [ J ]
J Bioener g Biomember , 2009, 41
( 2) : 169180

蒺藜皂苷预适应对心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能的影响
张
爽,李
红 ,魏征人,梁
蕾, 张
问,杨世杰
(吉林大学基础医学院 药理学教研室,吉林 长春
130021)
摘
要: 目的
建立 Langendo rff 离体心脏灌流系统, 制备缺血再灌注实验模型, 观察蒺藜皂苷 ( g ro ss saponins
fr om T r ibulus terr estr is , GST T ) 预适应对大鼠心肌缺血再灌注损伤心功能的影响。方法
56 只大鼠随机分为 7
组, 正常对照组、缺血/再灌组 ( I/ R)、心肌缺血预适应组 ( IPC)、阳性药腺苷组、GSTT 200、100、50 mg/ L 组, 缺血
30 min,再灌 40 min, 记录给药前、再灌后 5、10、15、20、30 m in 心率 ( H R)、左室收缩压 ( LVSP ) 等心功能指标 ,并
同步记录冠脉流量 ( CF ) , 同时测定心肌组织 ATP 水平。结果
I/ R 组再灌注后 5、10、15、20、30 m in HR、LVSP
明显下降 ( P< 0
001) ; IPC 组, GSTT 200、100 mg / L 预适应组和腺苷预适应组再灌注后 5、10、15、20、30 min H R、
LVSP 均明显升高 (P < 0
05、0
01) ; I/ R 组再灌注后各时间点 ( 5、10、15、20、30 min) CF 明显减少 ( P< 0
001) ;
与 I/ R 组相比, IPC 组, GST T 200、100 mg / L 预适应组和腺苷预适应组再灌注后各时间点 ( 5、10、15、20、30 min)
CF 均增加 ( P< 0
05、0
01、0
001) ; I/ R 组 Na+ K + ATP 酶活力明显降低 (P < 0
001)。与 I/ R 组相比, IPC 组,
GST T 200、100 mg / L 预适应组和腺苷预适应组 Na+ K+ AT P 酶活力明显升高 ( P< 0
05、0
01)。I/ R 组的 Ca2+
Mg 2+ ATP 酶活力有增高趋势, 与 I/ R 组相比, IPC 组, GSTT 200、100 mg / L 预适应组和腺苷预适应组 Ca2+
Mg 2+ ATP 酶活力明显升高 (P< 0
05、0
01)。结论
GST T 可抑制心功能低下, 舒张冠状动脉, 增加冠脉血流量
而改善心肌的供血、供氧; GSTT 还可增加心肌组织 ATP 酶活性, 通过抑制 Na+ / Ca2+ 交换, 使得细胞摄取的 Ca2+
减少。
关键词: 蒺藜皂苷; 缺血再灌注损伤; 缺血预适应; 心功能; ATP 酶
中图分类号: R286
2


文献标识码: A


文章编号: 0253- 2670( 2010) 06- 0959- 05
!959!中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 41 卷第 6 期 2010年 6月
收稿日期: 20091010





















基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30472020, 30672654) ; 高校博士点基金资助项目 ( 2005183129)作者简介:张
爽( 1975 ∀ ) ,女,吉林省长春市人,药理学博士,吉林大学电子科学与工程学院讲师,研究方向为分子药理学。
Email : mariazs@ 163. com
* 通讯作者
李
红
Em ail: LH ong@ jlu. edu. cn