全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 9 期 2011 年 9 月 ·1740·
蛇床子素制备方法的研究
曾春萍 1，贾曼谱 2，王书华 2，安 芳 2*
1. 张家口市药品检验所，河北 张家口 075000
2. 河北北方学院 药学系，河北 张家口 075000
摘 要：目的 优选超临界 CO2萃取蛇床子中蛇床子素工艺，建立制备型高效液相色谱（PHPLC）分离纯化萃取物中蛇床子
素的方法。方法 以总萃取物得率和萃取物中蛇床子素的量为指标，选取温度、压力和提取次数 3 个因素，按 L9(34) 正交设
计优选蛇床子素超临界 CO2萃取工艺。萃取物经甲醇超声溶解后，采用 PHPLC 法，色谱柱为：Zorbax SB-C18柱（250 mm×
21.2 mm，7 μm），流动相为甲醇-水（70∶30），柱温为 25 ℃，体积流量为 15 mL/min，检测波长为 322 nm，进样量为 5 mL，
收集蛇床子素馏份，经真空冷冻干燥得蛇床子素单体。结果 最佳萃取工艺为：温度 50 ℃，压力 25 MPa，提取 3 次（每
次 1 h），PHPLC 法制备的蛇床子素用面积归一化法与外标法定量，质量分数为 98.8%，1H-NMR 鉴定结构，与文献数据一
致。结论 超临界 CO2萃取蛇床子中蛇床子素提取效果好，工艺简单可行，PHPLC 法制备高纯度蛇床子素，简便快捷，并
适于大规模制备蛇床子素。
关键词：蛇床子素；超临界 CO2萃取；制备型高效液相色谱（PHPLC）；面积归一化
中图分类号：R284.2 文献标志码：B 文章编号：0253 - 2670(2011)09 - 1740 - 03
Preparation of osthol by preparative high performance liquid chromatography
ZENG Chun-ping1, JIA Man-pu2, WANG Shu-hua 2, AN Fang2
1. Zhangjiakou Institute for Drug Control, Zhangjiakou 075000, China
2. Department of Pharmacy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China
Key words: osthol; supercritical CO2 extraction; preparative high performance liquid chromatography (PHPLC); area normalization
蛇床子素又名甲基欧芹酚（osthol），是从伞形
科植物蛇床 Cnidium monnieri (L.) Cusson 成熟果实
中提取的香豆素。蛇床子素具有抗肿瘤、抗诱变、
抗氧化，抑制阿霉素的心脏毒性等多种药理活性[1-6]。
蛇床子中蛇床子素的量最高[7]。有关蛇床子素的提
取方法，主要采用水煎、醇提等，操作较为繁琐，
有效成分损失较大，超临界 CO2 萃取蛇床子中蛇床
子素产率高[8-9]。目前，蛇床子素的分离纯化方法主
要是重结晶法、大孔树脂纯化法[10]，操作繁琐，制
备量小。制备型高效液相色谱（PHPLC）已成为当
今高效分离与纯化中药有效成分的重要技术手段，
在制备高纯度生物活性物质时，操作简单，制备量
大[11]。本实验以总萃取物得率及萃取物中蛇床子素
的量为指标，选取对萃取影响较大的温度、压力和
次数 3 个因素，按 L9(34) 正交设计优选蛇床子素超
临界 CO2 萃取工艺，建立 PHPLC 分离、纯化超临
界 CO2 萃取物中蛇床子素的方法，为蛇床子素纯品
的大规模制备提供实验依据。
1 仪器与试剂
Speed SFE 型超临界 CO2 萃取仪（美国应用分
离公司）；Agilent 1200 PHPLC（美国安捷伦公司）；
Agilent 1100 HPLC（美国安捷伦公司）；Modul
Yod—230 型冷冻干燥机（美国热电公司）；ME235S
型微量电子天平（北京赛多利斯公司）；Bruker
Avance—400 兆液体谱仪（德国布鲁克公司）；SGW
X—4 显微熔点仪（上海精密科学仪器有限公司）；
U—3900 紫外分光光度计（日本日立）。
蛇床子素对照品（批号 110822-200608，中国
药品生物制品检定所）；蛇床子（批号 090701，产
地河北，张中垣药饮片公司）经河北北方学院药物
收稿日期：2010-11-20
基金项目：张家口市科技局资助项目（0711046D-9）
作者简介：曾春萍（1973—），女，主管药师，长期从事药物有效成分提取及检测工作。Tel: 13831398000 E-mail: yjszcp@163.com
*通讯作者 安 芳 Tel: (0313)4029558 E-mail: anfang1965@yahoo.com.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 9 期 2011 年 9 月 ·1741·
研究所马淑兰教授鉴定为伞形科植物蛇床 Cnidium
monnieri (L.) Cusson 的干燥成熟果实；甲醇为色谱
纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法和结果
2.1 超临界 CO2 萃取工艺
称取洁净、干燥蛇床子 65.0 g，置提取釜中加
热加压循环提取 3 次（每次提取 1 h），提取完成，
从出料口收集萃取物，计算总萃取物得率。
2.2 正交试验设计优化工艺[8]
选取对萃取影响较大的萃取温度、萃取压力和
萃取次数为考察因素，按 L9(34) 正交表设计，以总
萃取物得率和萃取物中蛇床子素的量为指标，结果
表明，萃取温度 50 ℃，萃取压力 25 MPa，萃取 3
次（每次 1 h）为超临界 CO2 萃取蛇床子中蛇床子
素最佳工艺，65.0 g 蛇床子可得萃取物 1.492 6 g，
萃取物中蛇床子素质量分数为 66.70%。
2.3 HPLC 法测定蛇床子素[12]
2.3.1 色谱条件 色谱柱为 Hypersil BDS-C18 柱
（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（80∶
20）；体积流量 1 mL/min，检测波长 322 nm；柱温
25 ℃；进样量 20 μL。
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取蛇床子素对照
品 6.0 mg，置 10 mL 量瓶中，甲醇溶解，室温超声
15 min，定容至刻度，作为蛇床子素对照品溶液。
2.3.3 供试品溶液的制备 取各种蛇床子超临界萃
取物样品 0.1 g，精密称定，置 10 mL 量瓶中，精密
加甲醇 8 mL，室温超声 15 min，甲醇定容至刻度，
静置。过 0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，作为蛇床
子超临界 CO2 萃取物供试品溶液。
2.3.4 线性关系考察 取蛇床子素对照品溶液，甲
醇依次稀释得 15.0、10.0、7.50、5.00、3.75 μg/mL
系列对照品溶液，分别进样 20 μL，按“2.3.1”色
谱条件测定，以质量浓度对峰面积进行线性回归，
得回归方程为 Y＝96.250 1 X－5.780 5，r＝0.999 8，
线性范围为 3.75～15.0 μg/mL。
2.3.5 样品测定 取各样品制备供试品溶液，按
“2.3.1”项色谱条件测定，记录色谱图，外标法计算
蛇床子素的量。
2.4 PHPLC 分离纯化蛇床子素
2.4.1 色谱条件 色谱柱为 Zorbax SB C18 柱（250
mm×21.2 mm，7 μm），流动相为甲醇-水（70∶30），
柱温 25 ℃，体积流量 15 mL/min，检测波长 322
nm，进样量 5 mL，馏份收集基于峰，最小阈值为
25.6 mAU。
2.4.2 蛇床子素制备 将上述萃取物用甲醇超声溶
解 15 min，过 0.45 μm 微孔滤膜。按制备色谱条件
进样 5 mL，根据制备色谱图收集馏份，馏份经减压
浓缩，至有少量晶体析出时，真空冷冻干燥，得蛇
床子素单体 0.995 0 g。图 1 为蛇床子素的 PHPLC
色谱图。
*蛇床子素
*osthol
图 1 蛇床子素样品 PHPLC 图
Fig. 1 PHPLC chromatogram of osthol
2.5 蛇床子素质量分数的测定
对照品定性，见图 2，将制备所得蛇床子素，
按“2.3.1”色谱条件进行测定，采用峰面积归一化
法，蛇床子素的质量分数为 99.0%。外标法定量，
测得蛇床子素质量分数为 98.8%。
*蛇床子素
*osthol
图 2 蛇床子素对照品（A）与样品（B）的 HPLC 色谱图
Fig. 2 HPLC chromatograms of osthol reference
substance (A) and sample (B)
0 5 10 15 20 25 30
t / min
*
*
*
0 2 4 0 2 4
t / min
A B
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 9 期 2011 年 9 月 ·1742·
2.6 蛇床子素结构鉴定
所得单体为白色针状晶体（MeOH），mp 82～
83 ℃，与对照品混合熔点不下降。1H-NMR (DMSO-
d6) δ: 1.67 (3H, s, C′5-CH3), 1.84 (3H, s, C′4-CH3),
3.53 (2H, d, C′1-CH2), 3.92 (3H, s, C7-OCH3), 5.22
(H, m, C′2-H), 6.23 (H, d, J = 9.5 Hz, C3-H), 6.83 (H,
d, J = 9.5 Hz, C6-H), 7.28 (H, d, J = 9.5 Hz, C5-H),
7.60 (H, d, J = 9.5 Hz, C4-H), 数据与文献报道一
致[13]，鉴定该晶体为蛇床子素。
3 讨论
本实验考察了乙腈-水-三乙胺、甲醇-水不同流
动相，不同体积流量（10、15、20 mL/min），不同
进样体积（3、5、7 mL）以及流动相甲醇-水按不同
比例组成（80∶20，70∶30，60∶40）对分离效果
的影响。结果发现体积流量小时样品保留时间长，
所需流动相的量增加，体积流量大时分离效果差；
进样量小时分离效果好，但流动相用量大，造成浪
费，进样量大时蛇床子素分离度降低，纯度低；甲
醇-水为 80∶20 时，制备分离效果低，甲醇-水为
60∶40 时，分离用时长，造成流动相浪费；用乙腈-
水-三乙胺做流动相不利于试剂的回收且蛇床子素
的纯度低。本实验选取甲醇-水（70∶30）作为流动
相时，体积流量为 15 mL/min，进样体积为 5 mL，
蛇床子素与其他成分的分离效果好，有利于溶剂甲
醇的回收，且所收集的样品的质量分数达 98.8%。
周则卫等[14]报道利用大孔吸附树脂脱色、富集
及树脂分离纯化蛇床子素质量分数达 98%以上。本
实验利用 PHPLC 法分离纯化蛇床子素单体，进样
量大，操作简便、重现性好、省时、样品纯度高，
可用于大规模制取蛇床子素标准品。
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