全 文 ：金银花多糖脱蛋白方法的研究
殷洪梅1 ,尚 　强2 ,萧 　伟2 3 ①
(11 南京中医药大学 ,江苏 南京 　210000 ; 21 江苏康缘药业股份有限公司 ,江苏 连云港 　222001)
摘 　要 :目的 　优选金银花多糖除蛋白工艺。方法 　以多糖损失率和蛋白脱除率为评价指标 ,选用了 3 种方法 :
Sevag 法、酶法和酶2Sevag 法对金银花多糖提取物进行脱蛋白处理。结果 　Sevag 法、酶法、酶2Sevag 法的蛋白脱除
率分别为 85172 %、73128 %、84150 % ,多糖损失率分别为 56157 %、31122 %、29135 %。结论 　酶2Sevag 法是金银花
多糖除蛋白有效、可行方法。
关键词 :金银花 ;多糖 ;脱蛋白 ;正交试验
中图分类号 :R28412 ;R286101 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0420584203
　　金银花为忍冬科植物忍冬 L onicera j a ponica
Thunb1 干燥花蕾或带初开的花[1 ] 。具有清热解
毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆等功能。金银花化
学成分复杂 ,目前已鉴别出的主要有挥发油、黄酮
类、有机酸类、三萜类[2 ] 、环烯醚萜类[3 ] 、甾醇与脂肪
醇类、多糖[ 4 ] 、微量元素。其中活性成分研究主要集
中在有机酸与挥发油等成分 ,对金银花多糖研究报
道不多。目前多糖提取方法较多 ,但在提取过程中
都有蛋白质伴随产生 ,所以除去蛋白质是多糖提取
纯化的一个关键步骤。文献报道脱蛋白的常用方法
为 Sevag 法、TCA 法、酶法、酶法2Sevag 法。其中
Sevag 法较温和 ,是多糖脱蛋白的传统方法 ; TCA
法适用于除去含蛋白质量较高的多糖 ,但对多糖的
结构破坏较大 ;酶法专属性强 ,是目前普遍认为较好
的脱蛋白方法 ;酶法2Sevag 法由于具有试剂用量
小、样品损耗少、快速等特点 ,应用也较为普遍。本
实验结合上述 4 种方法的特点及金银花多糖粗提物
中蛋白质量 ,采用 Sevag 法、酶法、酶2Sevag 法对提
取的金银花多糖进行脱蛋白 ,选择最优的脱蛋白方
法 ,为金银花多糖的进一步分离纯化提供实验依据。
1 　实验材料、试剂与仪器
金银花购自山东平邑流峪镇 ,经南京中医药大
学生药教研室陈建伟教授鉴定 ,批号 Y081202。
无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫
酸、乙醇、磷酸均为分析纯、木瓜蛋白酶 (3 ×106 U/ g ,
广西杰沃利生物公司) 、牛血清白蛋白 (美国 Amres2
co ,p H 值为 512) 、考马斯亮蓝 G2250 (国药集团化学
试剂有限公司) 、D2无水葡萄糖 (中国药品生物制品
检验所 ,批号 1108332200503) 。
BP211D 电子天平 (梅特勒2托利多仪器 (上海)
有限公司) ; p H 计 (振源 (厦门) 工业有限公司) ;
UV —2550 紫外分光光度计 (日本岛津) 。
2 　方法与结果
211 　金银花多糖的提取[5 ] :金银花药材 300 g 加入
10 倍量的 95 %乙醇浸泡 30 min 后回流提取两次 ,
每次 1 h ,滤过 ,药渣依次加入 15 倍、10 倍量的水提
取 2 次 ,每次 1 h ,滤过 ,滤液浓缩至适当体积 ,加入
95 %乙醇使乙醇体积分数达到 80 % ,静置过夜 ,离
心 ,沉淀用有机溶剂洗涤 ,得沉淀经干燥得粗多糖。
212 　金银花多糖的量测定[6 ,7 ]
21211 　对照品溶液的制备 :精密称取 105 ℃干燥至
恒重的无水葡萄糖对照品 114 mg 于 25 mL 量瓶
中 ,加水至刻度 ,摇匀 ,配制成 56μg/ mL 的对照品
溶液。
21212 　标准曲线的制备 : 精密移取对照品溶液
013、016、110、113、117、210 mL ,置于具塞试管中 ,
各以蒸馏水补足至 210 mL ,然后加入 6 %苯酚 110
mL 及浓硫酸 510 mL ,摇匀 ,沸水浴加热 20 min ,冷
却至室温 ,于 490 nm 测吸光度 ,以 210 mL 水按同
样显色操作作为空白 ,以吸光度 ( Y) 对葡萄糖质量
( X) 作回归处理 , 得回归方程 : Y = 01006 87 X -
01009 80 , r = 01999 6。
21213 　样品中多糖测定 :取供试品溶液各 210 mL ,
同时做 3 个重复 ,以空白试剂为参比 ,按上述标准曲
·485· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
①收稿日期 :2009207203　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :殷洪梅 (1982 —)女 ,黑龙江省绥化市人 ,在读硕士研究生 ,研究方向为中药制剂的研发。
Tel :15062987446 　E2mail :yinhongmei 2008 @1261com3 通讯作者　萧　伟　E2mail :wzhzh2nj @tom1com
线的制备法 ,分别测定其吸光度值 ,计算样品中多糖
量和多糖损失率。
　　多糖损失率 = ( Ti - T j) / Ti ×100 %
公式中 Ti 为提取物中多糖的量 , T j 为脱蛋白后多糖的量
213 　金银花多糖中蛋白质的测定[ 8 ,9 ]
21311 　标准溶液的制备 :精确称取牛血清白蛋白
12 mg ,置于 50 mL 量瓶中 ,加水溶解后稀释至刻度
制成 240μg/ mL 贮备液。
21312 　标准曲线的制备 : 分别吸取贮备液 010、
012、014、016、018、110 mL ,加水稀释至 210 mL ,向
各管中加入 10 mL 考马斯亮蓝 G2250 溶液 ,混合均
匀后室温放置 30 min ,以蒸馏水为空白 ,在 595 nm
波长处测定吸光度 ,得吸光度 ( Y) 与蛋白质的质量
( X) 回归方程为 Y = 01 002 67 X + 01015 41 , r =
01999 5。
21313 　样品中蛋白质测定 :取供试品溶液各 210
mL ,同时做 3 个重复 ,以空白试剂为参比 ,按上述标
准曲线的制备法 ,分别测定其吸光度值 ,计算样品中
蛋白质量和蛋白质脱除率。
　　蛋白质脱除率 = ( Ri - R j) / Ri ×100 %
公式中 Ri 为粗多糖中蛋白质的量 , R j 为脱蛋白后多糖中蛋
白质的量
214 　金银花多糖脱蛋白
21411 　Sevag 法 :精确配制 0102 g/ mL 的多糖溶
液 ,向此溶液中加入其体积 1/ 5 的氯仿2正丁醇 (5 ∶
1)溶液 ,震荡 30 min ,经离心去除沉淀后 ,上清液再
加入其体积 1/ 5 的氯仿2正丁醇溶液 ,重复多次 ,直
到无明显的沉淀产生为止 ,结果见图 1。
图 1 　Sevag 法脱蛋白
Fig1 1 　Using Sevag method to remove protein
　　可见经过第 10 次脱蛋白 ,蛋白质的脱除率与多
糖的损失率分别达到 85172 %、56157 % ,之后仍能
除去少量蛋白 ,但同时多糖损失率逐渐加大。每次
除去蛋白质胶状物时 ,都会将少量溶于其中的多糖
一起除去 ,部分与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白
在处理时也会沉淀下来 ,造成多糖大量损失。同时
在用氯仿、正丁醇萃取时 ,对环境污染较大 ,操作繁
琐 ,试剂的损耗量也较大。
21412 　酶法 :精确配制 0102 g/ mL 的多糖溶液 ,依
据正交试验确定的最佳工艺 ,调 p H 值后加入一定
量的木瓜蛋白酶 ,水浴酶解 ,反应完后沸水浴灭酶 5
min ,离心。
根据文献资料与预实验结果选取酶用量、温度、
时间、p H 值 4 个因素 ,各 3 个水平 ,以蛋白质的脱
除率为指标进行 L 9 (34 )正交试验 ,因素水平见表 1 ,
结果见表 2、3。
表 1 　酶法脱蛋白因素水平
Table 1 　Factors and levels of enzymatic removal of protein
水平
因　素
A 酶量/ % B 温度/ ℃ C 时间/ h D p H
1 1 40 2 510
2 2 50 3 515
3 3 60 4 610
表 2 　正交试验结果
Table 2 　Results of orthogonal test
序号 A B C D 蛋白质脱除率/ %
1 1 40 2 5 　 63175
2 1 50 3 51 5 62172
3 1 60 4 6 　 68133
4 2 40 3 6 　 68189
5 2 50 4 5 　 70145
6 2 60 2 51 5 72101
7 3 40 4 51 5 69142
8 3 50 2 6 　 67133
9 3 60 3 5 　 68159
K1 641933 671 353 671 697 671597
K2 701450 661 833 661 733 681050
K3 681447 691 643 691 400 681183
R 51517 21 810 21 667 01586
表 3 　方差分析
Table 3 　Analysis of variance
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 　 461790 2 821522 P < 0101
B 　 131411 2 231653 191000 P < 0105
C 　 101940 2 191295
D 　 01567 2 11000
误差 01 57 2
　　由表 2 分析可知 ,以蛋白质的脱除率为评价指
标进行判断时 , A2 > A3 > A1 、B3 > B1 > B2 、C3 >
C1 > C2 、D3 > D2 > D1 ,影响因素为 : A > B > C > D ,
故直观分析最佳脱蛋白工艺为 :A2B3 C3 D3 。
由表 3 方差分析结果可知 ,酶的用量对蛋白去
除率的影响特别显著 ,温度对蛋白去除率的影响较
显著 ,时间对蛋白去除率有一定的影响 ,而 p H 值的
影响不大 ,这与极差分析结果一致。在 p H 5～6 时
对蛋白的去除率几乎没有影响 ,故选用 D3 或 D2 几
乎不影响蛋白去除率。所以酶法脱蛋白的最佳工艺
为 A2B3 C3 D3 即 :酶用量 2 % ,温度 60 ℃,时间 4 h ,
p H 值为 6。
·585·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
21413 　酶2Sevag 法 :精确配制 0102 g/ mL 的多糖
溶液 ,酶法水解后高温灭活 ,离心 ,上清液再采用
Sevag 法 ,重复多次 ,直到无变性蛋白产生为止。结
果见图 2。
图 2 　酶法2Sevag 法除蛋白
Fig12 　Using enzyme2Sevag method to remove protein
　　经过 5 次萃取后蛋白的脱除率与多糖损失率分
别为 84150 %、29135 % ,随着萃取次数的增加两相
指标变化不大 ,蛋白质几乎全部除去。
3 　讨论
3 种除蛋白方法都能在一定程度上脱除金银花
多糖中的蛋白质。除蛋白目的在于为金银花多糖分
离纯化与理化性质研究提供实验依据 ,故在兼顾多
糖损失的同时尽可能除去其中的蛋白质。从表 4 获
知 ,采用 Sevag 法脱蛋白 ,蛋白质的脱除率最高 ,但
同时多糖损失率也最高 ;采用酶法脱蛋白 ,蛋白的脱
除率最低 ;酶2Sevag 法脱蛋白 ,蛋白质的脱除率与
Sevag 法接近 ,但多糖损失率仅为 Sevag 法的 1/ 2。
酶2Sevag 法是利用木瓜蛋白酶来酶解蛋白 ,使
其成为相对分子质量较小多肽或者更为彻底的氨基
表 4 　3 种脱蛋白方法结果比较
Table 4 　Comparison of three kinds of method
for protein removal
除蛋白方法 多糖损失率/ % 蛋白质脱除率/ %
Sevag 法 561 57 851 72
酶法 311 22 731 28
酶2Sevag 法 291 35 841 50
酸 ,再进行醇沉 ,则大分子的多糖绝大多数得到沉
淀 ,而相对分子质量较小的多肽和氨基酸大部分保
留在溶液中 ,再结合 Sevag 法经过 5 次萃取后多糖
中蛋白质的脱除率达到 84150 % ,由于萃取次数与
单纯的 Sevag 法相比大大减少 ,多糖损失率仅为
29135 % ,进而证明酶2Sevag 法是金银花多糖脱蛋
白可行的方法。
参考文献 :
[ 1 ] 　中国药典[ S]1 一部1 20051
[ 2 ] 　Kwak W J , Hart C K , Chang H W , et al1 Loniceroside C ,
antiinflammatory saponin f rom L onicera j aponica [J ]1 Chem
Pharm B ull , 2003 , 51 (3) : 33323351
[ 3 ] 　毕跃峰 ,田　野 ,裴姗姗 ,等1 金银花中裂环环烯醚萜苷类化学
成分研究[J ]1 中草药 ,2008 ,39 (1) :182211
[ 4 ] 　王　琦1 金银花的化学成分研究 [ D ]1 沈阳 :沈阳药科大学 ,
20081
[ 5 ] 　邓庆华1 用正交试验法优化金银花多糖提取工艺[ D ]1 长春 :
东北师范大学 ,20081
[ 6 ] 　司梁宏 ,谈恒山1 苯酚2硫酸显色法测定枸杞益肾胶囊中多糖
含量[J ]1 中国医院药学杂志 ,2007 ,27 (6) :83628371
[ 7 ] 　张维杰1 复合多糖生化研究技术[ M ]1 上海 :上海科学技术出
版社 ,19871
[ 8 ] 　李建武 ,陈丽荣 ,袁明秀1 生物化学实验原理和方法 [ M ]1 北
京 :北京大学出版社 ,19941
[ 9 ] 　史德芳 ,韩淑琴1 仙人掌多糖提取过程中三种脱蛋白方法的比
较研究[J ]1 现代食品科学 ,2006 ,22 (4) :932951
降脂灵分散片溶出度的研究
楼超群1 ,戴德雄2 ,朱 　莹2 3 ①
(11 湖州市安吉县中医院 ,浙江 湖州 　313300 ; 21 浙江维康药业有限公司 ,浙江 丽水 　323000)
摘 　要 :目的 　建立降脂灵分散片溶出度的测定方法。方法 　以水作为溶出介质 ,采用桨法 ,100 r/ min ,以高效液
相色谱法测定累积溶出率 ,绘制降脂灵分散片的累积溶出曲线 ,并进行样品的溶出度测定。结果 　二苯乙烯苷在
01057 2～01572μg 时进样量与峰面积呈良好的线性关系 ( r = 01999 9) ;对 3 批降脂灵分散片进行溶出度测定 ,二
苯乙烯苷 15 min 的溶出量均达 70 %以上。结论 　所用方法具有灵敏、准确、快速的优点 ,适用于降脂灵分散片的
质量控制。
关键词 :降脂灵分散片 ;二苯乙烯苷 ;溶出度 ;高效液相色谱
中图分类号 :R28412 ;R286. 02 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0420586202
　　降脂灵分散片处方来源于部颁标准降脂灵片
( WS32B23260298) ,由何首乌、枸杞子、黄精、山楂、 决明子 5 味中药组成 ,以何首乌为主药 ,可用于肝肾阴虚 ,头晕 ,目昏 ,须发早白 ,高血脂等症。该制剂中
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①收稿日期 :2009210212