全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 7 期 2011 年 7 月

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我国不同地区天门冬核 DNA ITS 序列分析
欧立军 1, 2, 3，张人文 3，谈智文 3，赵婷婷 3，佘朝文 1, 2, 3
1. 湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室，湖南 怀化 418008
2. 民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南 怀化 418008
3. 怀化学院 生命科学系，湖南 怀化 418008
摘 要：目的 研究我国不同地区天门冬核 DNA ITS 序列差异及其与地理位置的关系，为不同居群天门冬的鉴定和道地产
区的确定提供理论依据。方法 运用 PCR 法对 25 个地区的 75 个样本 ITS 序列扩增后双向测序，用软件 DNAMAN 和 MEGA 4
分析测序结果。结果 每个地区的 3 个样本的 ITS 序列基本相同，不同地区样本间的 ITS 全序列存在一定差异，ITS2 片段
变异高于 ITS1。贵州产天门冬遗传分化度较大，变异位点和信息位点较多。ITS 序列构建的系统树表明，同一个地区的 3
个样本优先聚类，然后是同省的样本聚类，位于北纬 24.6°～36.6°和 22.2°～24.4°的样本分别聚为 1 大支；第 1 大支中包
括青海、湖南和贵州省的样本，第 2 大支则包括浙江、广东、云南和广西 4 省的样本。结论 ITS 序列可鉴定不同产地的天
门冬，贵州省是天门冬药材道地产区之一，不同地区天门冬的亲缘聚类主要与纬度相关，与经度关系不大。
关键词：天门冬；ITS 序列；分子鉴定；道地性；聚类分析
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)07 - 1402 - 05
Nuclear DNA ITS sequence analysis of Asparagus cochinchinensis from different
geographical regions in China
OU Li-jun1, 2, 3, ZHANG Ren-wen3,TAN Zhi-wen3, ZHAO Ting-ting3, SHE Chao-wen1, 2, 3
1. Key Laboratory of Hunan Higher Education for Hunan-western Medicinal Plant and Ethnobotany, Huaihua 418008, China
2. Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources, Huaihua 418008, China
3. Department of Life Science, Huaihua University, Huaihua 418008, China
Abstract: Objective The nuclear DNA ITS sequence variation and its correlation to geographical distribution of Asparagus
cochinchinensis from different populations in China were studied, the aims were to reveal the difference among different populations
and determine the genuineness of A. cochinchinensis. Methods The ITS fragments of 75 samples from 25 populations were amplified
and bidirectional sequenced. And they were analyzed using the software of DNAMAN and MEGA 4. Results ITS sequences of three
samples from the same areas were almost the same and ITS sequence of 25 populations were different from each other. The variation of
ITS2 sequences was bigger than that of ITS1sequences. ITS sequences of Guizhou Province had bigger genetic differentiation and
more variable sites and information sites than other provinces had. Clustering results based ITS sequences showed three samples from
the same area firstly clustered and then populations from a province clustered. All populations were divided into two branches based on
North latitude of 24.6°—36.6°and 22.2°—24.4°, the first branch included the populations of Qinghai, Hunan, and Guizhou
Provinces, the second branch included the populations of Zhejiang, Guangdong, Yunnan and Guangxi Province. Conclusion ITS
sequences could identify the different populations of A. cochinchinensis. Guizhou Province is the place of genuineness of A.
cochinchinensis. Clustering the different populations of A. cochinchinensis primarily relates to the latitude while has little relationship
with the longitude.
Key words: Asparagus cochinchinersis (Lour.) Merr.; ITS sequences; molecular identification; genuineness; clusteraralysis

天门冬 Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.
是百合科天门冬属植物，主产于贵州、云南、浙江、
湖南等省，已有几千年的药用历史，在《神农本草
经》和《千金方》中均有记载，是多个民族的常用
药，有养阴润燥、清肺生津的功效。常用于治疗肺
燥干咳、咽干口渴、肠燥便秘等症[l]，并具有抗菌
和抗肿瘤等药理活性，常被用作滋补品、收敛药使
用[2]。目前对天门冬的研究主要集中在化学成分、

收稿日期：2010-12-06
基金项目：湖南省高校创新平台开放基金项目（09K106）；湖南省科技计划重点项目（2009FJ2008）
作者简介：欧立军（1976—），男，湖南长沙人，博士，主要研究方向为药用植物遗传与分子生物学。Tel: 15974048762 E-mail: ou9572@126.com
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药理药效及临床应用等方面，多项研究表明天门冬
的主要成分为糖类[3-4]、氨基酸类[5]、皂苷类[6]等，天
门冬的临床作用主要表现在治疗乳腺小叶增生[7]、恶
性淋巴肉瘤[8]、镇咳、祛痰及平喘等[9]方面。
高等植物编码核糖体 RNA 的基因是高度重复
的串联序列，其中编码 18、5.8、26 S 的 rDNA 为 1
个转录单位，在该转录单位中， ITS（ internal
transcribed spacer）是介于 18 S 和 5.8 S 之间（ITS1）
以及 5.8 S 和 26 S 之间（ITS2）的非编码转录区，
其转录产物在 rRNA的加工过程中被切掉。编码 18、
5.8、26 S 的序列为高度保守区，ITS 序列为进化速
度较快的中度保守序列，且各重复单元间具有同步进
化的特点。因此，ITS 作为基因标记很快成为在序列
水平上探讨系统发育和进化研究的有效手段[10-12]，但
该序列在天门冬的研究中尚未见报道。本研究收
集我国 7 个省的 25 个不同地区的天门冬，通过
测定其 DNA 序列，比较不同地理区域天门冬
DNA 序列的差异，为天门冬的分子鉴别、道地
药材的引种和栽培提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
我国主要产区的不同天门冬 25 个居群，每个
居群 3 个样本，分布于贵州、湖南和浙江等 7 个省，
按照纬度从高到低进行排列和编号，所有材料由怀
化学院曾汉元教授鉴定，见表 1。
1.2 方法
采取 CTAB 法进行 DNA 的提取。ITS 引物参
考 White 等[13]方法设计，采用 5’-TCCTCCGCTTA
TTGATATGC-3’和 5’-GGAAGGTAAAAGTCAAG
G-3’，反应体系包括 10×PCR 缓冲液 5 μL，10
mmol/L dNTP 1 μL，50 mmol/L 引物各 1 L，DNA 40
ng，Taq DNA 聚合酶 0.4 L，补充双蒸水至 50 L。
反应程序为：95 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 45 s，
56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，35 个循环；72 ℃
后延伸 10 min。PCR 产物纯化采用生工生物工程
（上海）有限公司的 DNA 纯化试剂盒，纯化产物鉴
定后双向测序，重复 3 次。所得序列采用 DNAMAN
和 MEGA.4 软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 ITS 序列长度和 GC 分析
75 个样本的 ITS 序列全长为 609～622 bp，长
度变化为 13 bp，GC 量在 56.7%～62.8%；ITS1 和
ITS2 片段长度主要为 249 bp 和 240 bp，ITS2 的 GC
表 1 天门冬来源及地理位置
Table 1 Source and location of A. cochinchinensis
居群 来源地 品种 北纬/( ° ) 东经/( ° )
XN 青海西宁 野生 36.567 101.814
YS 青海玉树 野生 31.910 89.450
HZ 浙江湖州 栽培 30.367 119.233
ZH 浙江杭州 栽培 29.183 118.350
YH 贵州沿河 野生 28.211 108.005
HS 湖南衡山 野生 27.284 112.706
XH 湖南新晃 野生 27.067 108.787
QX 贵州黔西 野生 26.902 105.683
WA 贵州瓮安 野生 26.883 107.284
FQ 贵州福泉 野生 26.681 107.516
HX 贵州花溪 野生 26.428 106.675
KL 贵州凯里 野生 26.410 107.683
XI 湖南新宁 野生 26.251 110.301
TD 湖南通道 野生 25.911 109.742
YQ 贵州余庆 野生 25.317 107.283
DS 贵州独山 野生 25.011 108.310
YZ 湖南永州 野生 24.650 111.001
XY 贵州兴义 野生 24.633 104.851
KM 云南昆明 野生 24.383 102.167
QJ 云南曲靖 野生 24.317 102.710
GL 广西桂林 栽培 24.250 109.060
YX 云南玉溪 野生 23.316 101.267
GZ 广东广州 栽培 23.105 113.251
NN 广西南宁 栽培 22.217 107.901
ZS 广东中山 栽培 22.183 113.151
量较高，几乎都为 65%，见表 2。序列比对发现，
居群内 3 个样本的 ITS 序列长度完全相同，仅仅存
在个别位点碱基的变化。居群间样本则存在较明显
的变异，可见 ITS 序列能较好地反映不同居群天门
冬差别，是鉴别不同居群天门冬的良好分子标记。
2.2 天门冬变异位点分析
不同天门冬居群的 ITS1 和 ITS2 序列变异位点
数目存在差异，ITS1 序列的变异位点数目少于 ITS2
序列的变异位点数目，ITS1 序列平均变异位点数目
为 9.64 个，ITS2 序列平均变异位点数目明显高于
ITS1 序列，达到 14.6 个；ITS 序列变异率最高为瓮
安居群和福安居群，为 5.93%，湖州和桂林居群为
最低，变异率为均 3.88%，见表 3。
不同省之间的变异位点数目和变异率同样存
在差异，贵州省的天门冬居群 ITS1 和 ITS2 的变异
位点比率分别达到 4.19%和 6.75%，高于其他省的
天门冬，见图 1。
2.3 天门冬 ITS 序列信息位点分析
经过序列比对，不同省的天门冬居群的信息位
点存在数量上的差异，ITS1 片段的信息位点数少于
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表 2 不同居群天门冬的 ITS 长度和 GC 量比较
Table 2 Length and GC content of ITS sequences of A. cochinchinensis from different populations
ITS ITS1 ITS2 居群
长度/bp GC/% 长度/bp GC/% 长度/bp GC/%
XN 617 56.7 246 59.4 241 59.8
YS 616 56.7 246 59.4 240 59.8
HZ 619 62.1 249 63.0 240 65.0
ZH 622 61.5 249 61.4 243 65.0
YH 619 62.1 249 63.0 240 65.0
HS 619 62.0 249 63.0 240 64.6
XH 619 62.7 249 64.2 240 65.0
QX 619 62.5 249 63.0 240 65.9
WA 619 62.5 249 63.4 240 65.5
FQ 619 62.1 249 63.0 240 65.0
HX 619 62.1 249 62.6 240 65.5
KL 621 61.5 250 62.0 241 65.1
XI 619 62.1 249 63.4 240 64.6
TD 621 62.7 250 62.8 241 65.1
YQ 619 62.0 249 63.4 240 65.0
DS 619 62.1 249 63.0 240 65.0
YZ 619 61.7 249 63.0 240 64.1
XY 618 62.8 249 64.2 239 65.3
KM 619 62.1 249 63.0 240 65.0
QJ 621 62.3 249 63.8 242 66.1
GL 619 62.1 249 63.0 240 65.0
YX 619 62.1 249 63.0 240 65.0
GZ 622 62.1 249 62.6 243 65.0
NN 609 61.7 239 61.5 240 65.5
ZS 619 62.1 249 63.0 240 65.0
ITS2，ITS2 片段的信息位点都为单核苷酸位点
（Single nucleotide sites, SNP）。贵州省信息位点数较
多，ITS1 的 184～186 位点为 T，其他省居群都为 C，
ITS2 片段的 30 位点为 G，其他省居群都缺失（云
南省居群为 A），75、83、132、197 和 229 位点分
别为 T、C、A、T 和 A，见表 4。
2.4 基于 ITS 序列的系统树
根据 ITS 序列构建 75 个天门冬样本的系统树
发现，同一居群内的 3 个样本优先聚类，然后是同
省的居群聚类。位于北纬 24.633°～36.567°和
22.183°～24.383°的天门冬居群分别聚为 1 大支，
第 1 大支中包括青海、湖南和贵州省的居群，第 2
大支则包括浙江、广东、云南和广西 4 省的居群，
见图 2。
3 讨论
核糖体 DNA ITS 序列相对保守，同时进化速率
较快，可以提供较丰富的变异位点，不仅广泛用于
物种间的鉴定，而且也被用于种内居群间的差异性
分析[14-16]。本实验对天门冬不同地区的分析结果表
明，相同居群的 3 个样本的 ITS 序列几乎不存在差
异，这说明居群内样本的 ITS 序列基本完成了趋同
进化；不同居群的 ITS 序列较保守，变异为 2.13%，
没有完全相同的 2 个序列，说明这个序列有较好的
区分度，能区分不同居群天门冬。此外，天门冬 ITS2
片段长度仅为 240 bp，稍短于 ITS1 片段长度，但
其变异率和信息位点却多于 ITS 片段，说明 ITS2
容易扩增和分析比较，是天门冬 DNA 条形码的简
单有效片段之一。
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表 3 不同居群天门冬 ITS1 和 ITS2 的变异位点数目和变异率
Table 3 Variable sites and mutation rate of ITS1 and ITS2 sequences of A. cochinchinensis from different populations
ITS1 ITS2居群 变异位点数/个 变异率/% 变异位点数/个 变异率/% 总变异位点数/个 变异率/%
XN 8 3.25 14 5.81 22 4.51
YS 11 4.47 16 6.67 28 5.76
HZ 7 2.81 12 5.00 19 3.88
ZH 9 3.61 15 6.17 24 4.87
YH 11 4.42 17 7.08 28 5.72
HS 12 4.82 15 6.25 27 5.52
XH 8 3.21 17 7.08 25 5.11
QX 10 4.06 16 6.67 26 5.31
WA 13 5.22 16 6.67 29 5.93
FQ 7 2.81 22 9.17 29 5.93
HX 9 3.61 16 6.67 25 5.11
KL 9 3.60 13 5.39 22 4.48
XI 11 4.41 15 6.25 26 5.31
TD 8 3.20 13 5.39 21 4.27
YQ 10 4.01 16 6.67 26 5.31
DS 13 5.22 14 5.83 27 5.52
YZ 11 4.41 16 6.67 27 5.52
XY 12 4.82 16 6.69 28 5.73
KM 9 3.61 14 5.83 23 4.70
QJ 7 2.81 13 5.37 20 4.07
GL 8 3.21 11 4.58 19 3.88
YX 9 3.61 13 5.42 22 4.49
GZ 9 3.61 11 4.52 20 4.06
NN 11 4.60 13 5.42 24 5.01
ZS 9 3.61 11 4.58 20 4.08


图 1 不同省天门冬居群 ITS 序列变异率
Fig. 1 Mutation rate of ITS sequences of A. cochinchinensis from different provinces
表 4 不同省天门冬居群信息位点比较
Table 4 Informative sites of A. cochinchinensis from different provinces
ITS1 信息位点 ITS2 信息位点 省份
53～55 94～96 184～186 30 43 75 83 132 197 207 229 239
贵州 GGC TGC T G A T C A T G A C
广西 AGC TGT C − − G T G A A C T
浙江 AGC TGC C − A G T C A G C C
青海 CGC TGC C − A A T C A G T C
云南 GGC AAC C A A G T C A G C C
湖南 GGA TGT C − − G T G A A C T
广东 AGC TGT C − A G T C A G C C
“−”为缺失
“−” lack base or deletion
10

8

6

4

2

0
变
异
率
/%

贵州
广西
浙江
青海
云南
湖南
广州
ITS1 ITS2
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图 2 基于 ITS 序列的天门冬系统树
Fig. 2 Dendrogram of A. cochinchinensis based on ITS sequences
植物的分布与系统发育一般与地理位置（特别
是纬度）存在一定的关系[17-18]。本实验的不同产地
天门冬居群被北纬 24.5°划分为 2 大群，说明天门
冬的种间变异主要受纬度的影响，与经度关系不
大。浙江、广东、广西的天门冬居群来自人工栽培，
与云南天门冬居群聚在一起，这可能是由于随着栽
培时间的推移，其 ITS 序列逐渐受到纬度的影响而
趋同进化，或者是这些天门冬居群直接引种于云
南，因此与云南居群亲源较近。
天门冬药材主要利用野生天门冬资源，近年来
由于其需求量越来越大，野生资源日益枯竭，必须
依靠人工栽培种植，而人工栽培品种主要靠异地引
种。中药材一个重要特点是存在道地性，不同产地
的药材，有效成分组成与量存在很大差异，因此天
门冬药材道地性的确定是指导引种和良种选育的
重要前提，而 DNA 序列分析技术是药材道地性鉴
定的手段之一。本研究的结果表明，贵州省产天门
冬遗传多样性较多，其 ITS 序列变异率和信息位点
都相对较高，说明贵州是天门冬药材的道地产区之
一，ITS 序列可以从分子水平上阐明其遗传背景，
克服由于品种混杂导致产量、品质下降和种质退化
等问题，并指导天门冬的资源管理和引种栽培。
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XN
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TD
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XI
HS
YZ
XY
QX
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KL
YH
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24.6°
24.4°
22.2°
36.6°