全 文 ：选育甘草乌新Ⅰ号的生理特性和基因多态性研究
严 　硕1 ,高文远1 ,2 3 ,路福平2 ,黄 　滔1①
(11 天津大学药物科学与技术学院 ,天津 　300072 ; 21 天津科技大学
中药生物工程研究所 ,天津 　300193)
摘 　要 :目的 　对从野生甘草中选育出的新品种甘草 (乌新 Ⅰ号) 进行种质评价。方法 　观察了其发芽率、可溶性
蛋白量和过氧化物酶活性 ,并与对照组进行了基因组多态性比较。结果 　乌新 Ⅰ号可溶性蛋白量产生了变化 ,过
氧化物酶活性显示乌新 Ⅰ号具有较高活性。通过分子标记简单序列重复技术 ( ISSR)进行多态性分析 ,在所使用的
22 条随机引物中 ,6 条随机引物产生了不同 DNA 条带 ,表明乌新 Ⅰ号甘草与对照组相比产生了基因多态性变化。
结论 　这些变化表明乌新 Ⅰ号是一个具有前景的品种并且能在将来广泛应用。
关键词 :甘草 ;乌新 Ⅰ号 ;育种 ; ISSR
中图分类号 :R28212 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 01 - 0126 - 04
Physiological features and genetic polymorphism of a ne w breed licorice Wuxin No1 1
YAN Shuo1 , GAO Wen2yuan1 ,2 , L U Fu2ping2 , HUAN G Tao1
(11 School of Pharmaceutical Science and Technology , Tianjin University , Tianjin 300072 , China ; 21 College of
Biotechnology , Tianjin University of Science and Technology , Tianjin 300074 , China)
Abstract : Objective 　A new breed of licorice seeds ( Wuxin No11) was selected f rom wild licorice ,
Gl ycy rrhi z a uralensis1 Methods 　It s germination rate , content of soluble p rotein , and peroxidase ( POD)
activities were investigated and compared wit h the wild licorice seeds (cont rol group)1 The leaves of Wux2
in No11 were collected and it s genetic polymorp hism was analyzed by inter2simple sequence repeat tech2
nique ( ISSR)1 Results 　The result s suggested t hat t he seed vitality in Wuxin No11 was higher t han t hat in
the cont rol group1 The change of soluble p rotein and POD activity also demonst rated t hat t he seeds in
Wuxin No11 have t he higher vigor1 ISSR Analysis showed t hat among 22 random primers used in t his ex2
periment , six p rimers generated different DNA band types , which meant t hat t here was genetic polymor2
p hism in Wuxin No111 Conclusion 　All t hese changes indicate t hat Wuxin No11 is a p rospective domestica2
tion species of licorice and may be cultivated widely in t he f ut ure1
Key words : licorice ( Gl ycy rrhi z a uralensis Fisch1 ) ; Wuxin No11 ; breeding ; inter2simple sequence
repeat ( ISSR)
　　甘草 Gl ycy rrhi z a uralensis Fisch1 是豆科多年
生草本植物 ,其根茎具有补脾益气、止咳祛痰、清热
解毒、调和诸药等功效 ,是最常用的中药之一 ,具有
“十方九草”之说。从有历史记载以来 ,它已经被东
西方国家用于治疗疾病。甘草是我国用量最大的药
材之一 ,其资源和栽培问题一直未能解决 ,主要原因
在于缺乏优良的甘草种质资源。人工种植甘草的萌
发率低以及有效成分量低 ,尚不能完全代替野生甘
草 ,选育优良品种是甘草栽培的重要任务[1 ] 。通过
常规育种从野生资源中选育了一种新品种乌新 Ⅰ
号 ,前期对乌新 Ⅰ号甘草主要生物活性成分量分析 ,
结果表明乌新 Ⅰ号甘草一年生根中甘草酸、甘草苷
和甘草多糖的量分别是同期野生的 2. 44、1. 25、
1. 26倍 ,而且在乌新 Ⅰ号中检出了甘草次酸 ,而在野
生的一年生甘草中未检到甘草次酸[2 ] 。本实验在前
期考察了其有效成分量的基础上 ,通过考察乌新 Ⅰ
号的生理活性和基因多态性来综合评价乌新 Ⅰ号的
物种质量 ,选育优良甘草种质资源。
1 　材料
1. 1 　植物材料 :乌新 Ⅰ号和对照组野生甘草均由北
·621· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
①　　收稿日期 :2009204207
　　基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30472148 ,30772732)
　　3 通讯作者　高文远　Tel : (022) 87401895 　Fax : (022) 87401895 　E2mail :pharmgao @tju. edu. cn
京大兴时珍国药研究所提供 ,并经高文远教授鉴定。
1. 2 　化学药品 :引物从上海生工生物工程技术服务
有限公司 (上海 ,中国) 购得 ,用于分析的 T aq 酶 ,
10 ×PCR 缓冲液 ,dN TP 均购于宝生物工程 (大连)
有限公司 ,其他化学试剂均为国产分析纯。
2 　方法
2. 1 　发芽率和胚根长度的比较 :试验是参照《中华
人民共和国农作物种子检验规程》( GB/ T 3543. 2 ,
GB/ T 3543. 3) 。将 60 粒乌新 Ⅰ号甘草种子放置在
培养皿中 ,加入 50 mL 水 ,培养温度 25 ℃,7 d 内记
录萌发数和胚根长度。发芽势 ( GI) = 6 ( Gt/ Dt )
( Gt :发芽种子数量 ;Dt :发芽种子天数) ;发芽指数
(V I) = S ×GI( S 为幼苗平均长度) 。在最低显著性
差异 (L SD) 5 %的可能性水平上进行方法学比较。
2. 2 　可溶性蛋白的量 :将乌新 Ⅰ号种子和野生甘草
种子温水浸泡 30～48 h ,以软化种皮 ,使种子达到
充分吸胀状态。用 70 %酒精消毒 30 s 后再用蒸馏
水冲洗种子数遍 ,1 %次氯酸钠消毒 15 min ,蒸馏水
冲洗干净 ,均匀摆入内覆有两层无菌滤纸的培养皿
中 ,每个培养皿 25 粒 ,分别加入适量蒸馏水和 PEG
6000 溶液 (体积分数为 20 %)置于 25 ℃生化培养箱
中光照培养 7 d ,从萌发起 ,每隔 24 h 取已萌动发芽
的甘草种子 ,去种皮 ,称取约 100 mg 至研钵中 ,加
入 2 mL 磷酸缓冲液 (0. 1 mol/ L ,p H 7. 0)研磨至匀
浆 ,将此匀浆倒入 5 mL 离心管 ,置于离心机中离心
10 min (转速 1 ×104 r/ min) 。取上清液 1 mL 至刻
度试管中 ,再加入 20 mL 磷酸缓冲液 ,进行稀释。
采用紫外分光光度法在 280、260 nm 波长下测定吸
光度值 ,以磷酸缓冲液为空白调零。按下述公式计
算可溶性蛋白的量。
蛋白质质量浓度 (mg ·mL - 1 ) = 1. 45 A280 - 0. 74 A260
2. 3 　过氧化物酶活性 :将乌新 Ⅰ号和野生甘草种子
温水浸泡 30～48 h ,以软化种皮 ,使种子达到充分
吸胀状态。用 70 %酒精消毒 30 s 后再用蒸馏水冲
洗种子数遍 ,1 %次氯酸钠消毒 15 min ,蒸馏水冲洗
干净 ,均匀摆入内覆有两层无菌滤纸的培养皿中 ,每
个培养皿 25 粒 ,分别加入适量蒸馏水和 PEG6000
溶液 (体积分数为 20 %)置于 25 ℃生化培养箱中光
照培养 7 d。每隔 24 h 取种子去种皮 ,称取约 100
mg 至研钵中 ,加适量磷酸缓冲液 (p H7. 8)研磨至匀
浆 ,取 0. 1 mL 酶液 ,分别加入 2. 9 mL 磷酸缓冲液 ,
1. 0 mL 2 %的 H2 O2 ,0. 05 mL 的愈创木酚溶液 ,在
37 ℃水浴中保温 15 min 后 ,迅速加入 2. 0 mL 三氯
乙酸终止反应 ,以加热煮沸 5 min 的酶液为对照 ,测
定其在 470 nm 处的吸光度 ( A ) , POD 活力以每分
钟内 A 470变化 0. 01 为 1 个活力单位 (U)表示。
过氧化物酶活性 = ΔA 470 ×V TW ×V s ×0. 01 ×t
式中ΔA470为反应时间内吸光度的变化值 ,W 为样品的质量
(g) , t 为反应时间 (min) ,V T 为提取酶液的总体积 ( mL) ,V s
为测定时所取的酶液的体积
2. 4 　基因多态性分析
2. 4. 1 　DNA 基因组提取 :提取新鲜甘草叶片基因
DNA ,提取方法参照 Paterson 法[2 ] 。
2. 4. 2 　ISSR 基因多态性 : PCR 反应 :25μL 反应体
系 ,体系中含有 10μL 模板 DNA (10. 5 ng) ,2. 5μL
10 ×PCR 缓冲液 (包含 Mg2 + ) , 2 μL dN TPs ( 10
mmol/ L) ,1 μL 引物 ( 10 μmol/ L ) , 0. 25 μL T aq
DNA 酶 (5 U/μL) ,9. 25μL dd H2 O。
扩增程序 :94 ℃预变性 5 min 然后进入下列循
环 :94 ℃变性 45 s ,53 ℃退火 60 s ,72 ℃下延伸 90
s ,共计 40 个循环 ,循环结束后在 72 ℃延伸 7 min。
取扩增产物 5μL 点样于 1 %的琼脂糖凝胶电
泳 ,EB 染色后在凝胶成像系统上观察并保存结果。
3 　结果
3. 1 　乌新 Ⅰ号和对照组的种子发芽率、发芽势和活
力指数 :研究乌新 Ⅰ号的发芽过程并与对照组对比。
方差分析 (ANOVA)表明乌新 Ⅰ号和对照组具有显
著性差异 ( P < 0. 05) ,经过 7 d 的培养发芽率已经达
到 97. 45 % ,是对照组的 1. 23 倍 ,乌新 Ⅰ号的发芽
势各自在培养第 2 天达到最高。结果见表 1。
表 1 　乌新 Ⅰ号和对照组的萌发率、萌发潜力
和种子活力指标( …x ±s , n = 3)
Table 1 　Germination rate , germination potential ,
and vigor index of seeds in Wuxin No11
and control group ( …x ±s , n = 3)
物种 时间/ d 发芽率/ % 发芽势 活力指数
乌新 Ⅰ号 1 30. 00 ±3. 71 18. 00 ±1. 15 44. 66 ±0. 71
2 71. 67 ±1. 81 21. 80 ±1. 07 3 126. 48 ±1. 25
3 81. 78 ±1. 24 16. 36 ±1. 42 179. 63 ±0. 91
4 84. 26 ±1. 52 12. 64 ±0. 93 163. 06 ±0. 45
5 89. 56 ±2. 46 10. 75 ±1. 16 205. 11 ±0. 81
6 97. 41 ±2. 13 9. 42 ±1. 62 229. 11 ±0. 72
7 97. 45 ±1. 15 3 9. 45 ±0. 81 229. 16 ±0. 64 3
野生甘草 1 20. 00 ±1. 46 12. 00 ±0. 95 29. 88 ±0. 76
2 53. 30 ±1. 82 15. 99 ±1. 53 101. 70 ±0. 25
3 67. 08 ±1. 17 13. 42 ±1. 28 123. 73 ±0. 43
4 68. 00 ±1. 31 10. 20 ±0. 96 148. 51 ±0. 31
5 75. 41 ±2. 00 9. 05 ±1. 72 147. 06 ±0. 52
6 78. 21 ±3. 15 7. 82 ±1. 30 145. 61 ±0. 67
7 79. 43 ±2. 56 7. 94 ±1. 02 145. 46 ±0. 88
　　3 显著水平可能性选在 0. 05 , P < 0. 053 Significance at 0. 05 probability level , P < 0. 05
·721·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
3. 2 　萌发期间可溶性蛋白的变化 :萌发期间的可溶
性蛋白的变化结果见图 1。可溶性蛋白波动如“V”
字形 ,在第 2 天开始减少 ,在第 4 天增加 ,经过最初
2 d 的萌发期 ,乌新 Ⅰ号种子可溶性蛋白比对照组
急剧减少 ,发芽势达到最高 ,见表 11 ;经过 2 d 萌发 ,
乌新Ⅰ号中可溶性蛋白的量比对照组高 ,这种结果
表明 ,可溶性蛋白的变化反映了萌发期间的种子活
力的变化。
3. 3 　萌发 7 d 过氧化物酶活性变化 :本实验研究发
现乌新 Ⅰ号和对照组在过氧化物酶的活力上有显著
的区别 (图 2) ,但是 ,在 7 d 萌发期间乌新 Ⅰ号的过
氧化物酶的活性比对照组种子高。
3. 4 　ISSR 基因多态性分析 :本实验选用了 22 条引
物 ,引物合成参照文献方法[3 ] ,在乌新 Ⅰ号和对照组
比较中 ,16 条产生了相同的 DNA 条带 ,6 条产生了
不同的 DNA 条带。表 2 显示了 ISSR 引物序列 ,22
条 ISSR 引物在 300～1 000 bp 共有 124 条带 ,每条
引物扩增出 5～11 条带。21 条带产生了多态性占
多样性的 16. 9 % ,无论哪种情况 ,多态性是由于扩
增条带的丢失和增加引起的。引物 T13765 圹增出
7 个条带 ,其中两条产生了多态性 ;相对于对照组 ,
乌新 Ⅰ号在 350 bp 产生了一个额外的条带并且在
50 bp 条带缺失了一条带 (图 3) 。
表 2 　6 种多态性 ISSR引物和序列
Table 2 　Six polymorphic ISSR primers and their sequence
序列号 　　　序列顺序 (5′23′)
T13761 CACACACACACACACA G
T13762 GT GT GT GT GT GT GT GTC
T13763 A GA GA GA GA GA GA GA GC
T13764 GA GA GA GA GA GA GA GAA
T13765 A T GA T GA T GA T GC
T13766 CCCTCCCTCCCTCCCT
图 3 　引物 T13765 产生的 ISSR图
Fig. 3 　ISSR Patterns generated by primer T13765
4 　讨论
命名为乌新 Ⅰ号甘草新物种是直接从野生甘草
中常规选育出来的优良品种 ,本实验研究了其生理
特性和基因稳定性。种子萌发是植物生长周期的开
始阶段 ,发芽率和活力指数是评价种子质量的重要
指标。研究乌新 Ⅰ号的发芽过程并与对照组相比 ,
表明乌新 Ⅰ号可溶性蛋白量产生了变化。作为种子
成分的主要部分 ,可溶性蛋白在种子萌发期间由于
代谢活力的增加可能经历相当大的变化[4 ] ,萌发期
间的可溶性蛋白的变化结果表明 ,可溶性蛋白波动
如“V”字形。胞内或者胞外的过氧化物酶在植物细
胞抗氧化反应和植物呼吸作用、光合作用中具有重
要作用[5 ,6 ] 。据报道植物种子的生存能力和过氧化
物酶有密切联系[ 7 ] 。高文远等[8 ]报道了在种子萌发
期间甘草的过氧化物酶活性随着时间增加 ,本实验
过氧化物酶活性显示乌新 Ⅰ号具有较高活性。通过
分子标记简单序列重复技术 ( ISSR) 进行多态性分
析 ,在所使用的 22 条随机引物中 ,6 条随机引物产
生了不同 DNA 条带 ,表 2 显示了 ISSR 引物序列 ,
22 条 ISSR 引物在 300～1 000 bp 有 124 条带 ,每条
引物扩增出 5 到 11 条带。21 条带产生了多态性占
·821· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
多样性的 16. 9 % ,多态性是由于扩增条带的丢失和
增加引起的。引物 T13765 扩增出 7 个条带 ,其中
两条产生了多态性。相对于对照组 ,乌新 Ⅰ号在
350 bp 产生了一个额外的条带并且在 50 bp 缺失了
一条带。表明乌新 Ⅰ号甘草与对照组相比产生了基
因多态性变化 ,乌新 Ⅰ号和对照组在基因数量、大
小 ,以及 DNA 扩增片段密度上有本质的区别。生
理特性分析结合 ISSR 分析表明乌新 Ⅰ号和野生物
种是不同基因类型 ,这些变化表明乌新 Ⅰ号是一个
具有前景的品种 ,并且能在将来广泛应用。
前期对乌新Ⅰ号甘草主要生物活性成分的量进行
分析 ,结果表明乌新Ⅰ号甘草一年生根中甘草酸、甘草
苷和甘草多糖的量分别是同期野生的 2. 44、1. 25、
1. 26倍 ,而且在乌新Ⅰ号中检出了甘草次酸 ,而在野生
的一年生甘草中未检到甘草次酸[2 ] 。李慧超等[9 ] 测
定了内蒙古扎鲁特地区栽培的甘草一年生根中甘草
酸的质量分数为 3. 93 mg/ g ,要低于乌新Ⅰ号的 4. 45
mg/ g ,乌新Ⅰ号中甘草苷的量和内蒙古赤峰 3 年生甘
草中甘草苷的质量分数相当 ,这些说明所选育的乌新
Ⅰ号其主要生物活性成分积累速度较快。
本实验研究乌新 Ⅰ号种子的发芽率和活力实验
表明 ,其种子的发芽率、活力和萌发中的过氧化物酶
的活性要明显高于野生的对照组 ,前期研究表明乌
新 Ⅰ号甘草根中的主要生物活性成分的量也高于野
生甘草 ,这克服了一些甘草种植栽培中的关键问题 ,
预示着乌新 Ⅰ号具有良好的应用前景。
参考文献 :
[1 ] 　Fiore C , Eisenhut M , Ragazzi E1 A history of t he t herapeutic
use of liquorice in Europe [J ]1 J Ethnopharmacol , 2005 , 99 :
31723241
[2 ] 　李克峰 , 高文远 , 陈海霞1 选育甘草乌新 Ⅰ号主要生物活性
成分的含量分析 [J ]1 中国中药杂志 , 2007 , 32 ( 5 ) :
44724481
[3 ] 　Paterson A , Brubaker C , Wendel J1 A rapid met hod for ex2
t raction of ( Gossy pium spp1 ) genomic DNA suitable for
RFL P or PCR analysis [J ]1 Plant Mol B iol Rep , 1993 , 11
(2) : 12221271
[4 ] 　Vardhini V B , Rao R1 S1 S1 Amelioration of osmotic st ress
by brassinosteroids on seed germination and seedling growt h
of t hree varieties of sorghum [J ]1 Plant Growth Regulat ,
2003 , 41 : 252311
[5 ] 　Sharma P , Dubey R1 Drought induces oxidative st ress and
enhances t he activities of antioxidant enzymes in growing rice
seedlings [J ]1 Plant Growth Regulat , 2005 , 46 : 20922211
[6 ] 　Radotic K , Ducic T , Mutavdzic D1 Changes in peroxidase ac2
tivity and isoenzymes in spruce needles after exposure to dif2
ferent concent rations of cadmium [J ]1 Envi ron Ex per B ot ,
2000 , 44 : 10521131
[7 ] 　汤菊香 , 李广领 , 彩改玲 , 等1 花生种子活力与生理生化性
状关系的研究 [J ]1 河南农业大学学报 , 2005 , 39 ( 3 ) :
30023031
[8 ] 　高文远 , 李志亮 , 尚培根1 甘草种子萌发初期过氧化酶的研
究 [J ]1 中国中药杂志 , 1998 , 23 : 21222191
[9 ] 　李慧超 , 于淑华 , 闫凤杰 , 等1 高效液相色谱法测定野生甘
草及栽培甘草中甘草酸的含量 [J ]1 中国药事 , 2002 , 16
(5) : 3041
白术不同采收期内酯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ量的动态变化研究
白 　岩1 ,2 ,陈 　磊1 ,王晓妮1 ,杨潮锋1 ,何福基1 ,田 　薇1
①
(11 浙江林学院林业与生物技术学院 ,浙江 临安 　311300 ; 21 河北农业大学农学院 ,河北 保定 　071001)
摘 　要 :目的 　以白术内酯 Ⅰ、Ⅱ和 Ⅲ的量作为指标 ,考察不同采收期白术内酯量的动态变化 ,为其标准化栽培及
采收加工技术提供科学依据。方法 　采用 HPLC 法测定白术中的 3 种内酯成分。白术内酯 Ⅰ和 Ⅲ色谱柱 :
xBridge2C18柱 ;流动相 :甲醇2水 (65 ∶35) ;检测波长 :220 nm ;体积流量 :1. 0 mL/ min ;白术内酯 Ⅱ色谱柱 : Kromasil2
C18柱 ;流动相 :甲醇2水 (80 ∶20) ;检测波长 :276 nm ;体积流量 0. 6 mL/ min。结果 　白术内酯 Ⅰ、Ⅱ和 Ⅲ平均回收
率分别为 103. 52 %、88. 16 %和 99. 61 % ;RSD 分别为 0. 37 %、1. 8 %和 0. 16 %。不同采收期白术内酯 Ⅰ、Ⅱ和 Ⅲ量
的变化与采样时期具有相关性。结论 　白术中白术内酯量最高的时期在 5 月下旬至 6 月上旬摘蕾前。
关键词 :白术内酯 Ⅰ;白术内酯 Ⅱ;白术内酯 Ⅲ;高效液相色谱法 ;采收期
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 01 - 0129 - 03
　　白术始载于《神农本草经》,被列为上品 ,以菊科
苍 术 属 植 物 白 术 A t ract y lodes m acrocep hal a
Koidz1 的二年生干燥根茎入药[1 ] ,为“浙八味”之
一。白术具有燥湿利水、和胃安胎的功效 ,其内酯类
成分具有较强的增强唾液淀粉酶活性的作用[ 2 ] ,可
调节胃肠道功能以及促进营养物质的吸收[3 ] ,为白
术的主要活性成分。本研究利用 H PL C 法对不同
采收时期白术根茎中内酯类成分进行测定 ,明确白
·921·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
①　　收稿日期 :2009203210
　　基金项目 :白术良种选育中其药效成分的定量控制 (20070947)
　　作者简介 :白　岩 (1977 —) ,女 ,吉林长春人 ,浙江林学院林业与生物技术学院讲师 ,博士 ,主要从事中药资源开发与利用、药用植物栽培
与药用植物生理的研究和教学工作。　Tel : (0571) 63741273 　Fax : (0571) 63741273 　E2mail :baiyan814 @yahoo. com. cn