全 文 ：不同来源竹黄中多糖量的分析与比较
林海萍,殷红福,黄小波, 毛胜凤,刘洪波*
(浙江农林大学 亚热带森林培育省部共建国家重点实验室培育基地,浙江 临安 311300)
摘 要:目的 对不同来源竹黄中多糖的量进行分析比较,可为竹黄的开发利用提供借鉴。方法 采用苯酚-硫酸
法测定了不同生长时期、不同地点、不同寄主的 16 个竹黄样品中多糖量的变化。结果 竹黄中多糖的量与单个竹
黄含多糖的量均在 5 月上中旬达到最大;临近地点短穗竹上寄生的竹黄多糖的量以湿度较高采样点的较高;大多
数不同采样点短穗竹上寄生的竹黄中多糖的量有极显著差异, 单个子座中的竹黄多糖与竹红菌甲素的量没有显著
相关性。结论 5月上中旬是竹黄采收的最佳季节。
关键词:竹黄菌; 多糖;竹红菌甲素
中图分类号: R2841 1 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1549-04
竹黄菌 Shir aia bambusicola P1 Henn1 是一种
寄生于竹子细嫩枝杆上的子囊菌,其子座竹黄为传
统中药,能营气卫血、破瘀止痛、恢复组织机能、增强
体质。主要药理作用有镇痛、抗炎、抗菌、抗癌、护肝
和保护心血管[ 1] 。较高的药用价值与药用潜力使竹
黄在全球日益备受关注[ 2]。竹黄的有效成分为竹红
菌素、竹黄多糖、甘露醇、硬脂酸等 [ 3]。目前国内外
对于竹黄的研究主要集中于竹红菌素, 而近来一些
研究表明真菌多糖具有良好的抗氧化性能和清除自
由基能力,对小鼠的四氯化碳急性肝损伤具有保护
作用,具有良好的开发利用价值 [ 4-5] , 但关于不同来
源竹黄中多糖量的分析与比较的研究在国内外还未
见报道。
本课题组曾研究发现竹黄菌在浙江省广泛分布,
能在短穗竹 Br achystachyum densif lor um ( Reudle)
Keng、苦竹 Pleioblastus mar us ( Keng) Keng f1、雷竹
Phy llostachys p r aecox Chu et Chao 和篌竹 P1 nidu-
laria Munro 4种寄主上寄生,并比较了不同来源竹黄
中竹红菌甲素量的差异[ 6]。本实验在此基础上分析
比较了不同来源竹黄中多糖的量,以期进一步为野生
竹黄的开发利用提供理论指导。
1 材料
1. 1 样品: 竹黄在浙江省 13个采样点定期野外采
集,根据采集地点与寄主的不同归类,共获得来自不
同采样点或寄主的竹黄样品 16个(表 1)。竹黄药
材经浙江林学院真菌学教授张立钦鉴定。
表 1 竹黄的来源
Table 1 Sources of S1 bambusicola
编号 采集地点 寄主 海拔/ m 坡位 坡向 采集时间
Sb1 临安九仙山 短穗竹 78 下坡 阴坡 2008-04- 06
Sb2 临安九仙山 苦竹 81 下坡 阴坡 2008-04- 06
Sb3 临安九仙山 雷竹 76 下坡 阴坡 2008-04- 06
Sb4 临安九仙山 篌竹 78 下坡 阴坡 2008-04- 06
Sb5 临安青山湖 短穗竹 46 谷地 无 2008-04- 06
Sb6 昌化龙井村 短穗竹 93 下坡 阴坡 2008-05
Sb7 昌化白牛乡 短穗竹 121 下坡 阴坡 2008-05
Sb8 昌化天目乡 短穗竹 136 下坡 半阴坡 2008-05
Sb9 宁波鄞县 短穗竹 58 下坡 阴坡 2008-05
Sb10 湖州梅峰镇 短穗竹 72 下坡 半阳坡 2008-05
Sb11 安吉地铺镇 短穗竹 65 下坡 阴坡 2008-05
Sb12 诸暨城关镇 短穗竹 82 谷地 无 2008-05
Sb13 丽水林场 短穗竹 113 下坡 阴坡 2008-05
Sb14 淳安辛桐镇 短穗竹 81 下坡 半阳坡 2008-05
Sb15 苍南灵溪镇 短穗竹 94 下坡 半阴坡 2008-05
Sb16 武义桃溪滩镇 短穗竹 77 谷地 无 2008-05
#1549#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 11-10 基金项目:浙江省教育厅资助项目( 227100027) ;浙江农林大学科研启动基金( 2010FR026)作者简介:林海萍( 1973 ) ) ,女,浙江省台州市人,浙江农林大学森林保护省级重点学科负责人,副教授,博士,从事微生物学教学与科研工作。 T el: ( 0571) 63732760 Fax : ( 0571) 63740809 E-mail: zjl xylhp@ 163. com
1. 2 试剂:葡萄糖标准品(批号 200808260)、苯酚、
铝片、碳酸氢钠、浓硫酸、乙醇、氯仿、正丁醇均为分
析纯;考马斯亮蓝 G-250为化学纯。
1. 3 仪器: 岛津 2401PC 紫外可见分光光度计;
DZF ) 6050型真空干燥箱; M IKRO 22R 台式高速
冷冻离心机。
2 方法与结果
2. 1 竹黄样品的制备:竹黄的采集方法为野外人工
采集。在浙江省临安市选择了九仙山(短穗竹、苦
竹、雷竹、篌竹)、青山湖(短穗竹)为采样点, 从 2008
年 4月 12日 ) 2008年 6月 6日,每隔 5 d野外采集
样品( Sb1~ Sb5)各一次。2008年 5月 7 日, 采集了
浙江省其他 11个采样点的寄生在短穗竹上的竹黄
样品( Sb6~ Sb16)。任取采得的同类竹黄 10 个, 洗
净无菌水冲洗 3次, 真空干燥( 50 e 、- 0. 1 M Pa)至
恒重,粉碎后过 60目筛, 获得竹黄粉,备用。
2. 2 标准曲线的绘制: 称取苯酚 100 g, 加铝片 0. 2
g、碳酸氢钠 0. 1 g, 常压蒸馏,收集 182 e 的馏分,称
取 2. 5 g 该馏分置于棕色瓶中, 加蒸馏水 50 mL,混
匀即得质量浓度为 50 g/ L 的苯酚溶液。
精密称取 105 e 干燥至恒重的葡萄糖标准品
25. 0 mg, 转入 25 mL 量瓶中, 加蒸馏水定容, 即得
1. 0 mg / mL 葡萄糖标准溶液。分别精密吸取葡萄
糖标准溶液 0. 0、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、
0. 8 mL至 10 mL 量瓶中, 定容。分别吸取 2. 0 mL,
加苯酚溶液 1 mL, 摇匀, 迅速加入 5. 0 mL 浓硫酸,
摇匀后放置10 min,再置沸水浴中加热 15 min, 取出
冷却至室温,于 490 nm 处测定吸光度( A )值。以不
加标准溶液的反应体系作为空白对照。实验重复 3
次。以 A 值为横坐标, 葡萄糖质量浓度为纵坐标,绘
制标准曲线,得回归方程为 Y= 182. 61 X+ 0. 027 8
( r= 0. 999 0) ,结果表明葡萄糖在 0. 0~ 80. 0 Lg/ mL
内与吸光度间呈良好的线性关系。
2. 3 竹黄多糖提取: 精密称取干燥竹黄粉 20. 0 g,
置于 100 mL 量瓶中, 加蒸馏水 40 mL, 85 e 恒温水
浴加热 2 h,滤过, 滤渣再加蒸馏水 40 mL 按上述方
法加热 2 h,滤过, 滤液合并入量瓶,冷却至室温后定
容。量取上述滤液 5. 0 mL,加入 20 mL 无水乙醇, 4
e 静置过夜, 4 000 r/ min离心 20 min,弃上清液,沉
淀分别用 10 mL 无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤 2次, 均
用同样条件离心去除有机溶剂, 真空干燥( 50 e 、
- 0. 1MPa)得竹黄多糖粗制品。将竹黄多糖粗制品
用适量蒸馏水溶解, 用氯仿-正丁醇( 4 B 1)的 Sevage
试剂除蛋白, 其中糖液-Sevage液 ( 5 B 1) , 至考马斯
亮蓝 G-250法检测无蛋白被测出。上清液加 4倍体
积无水乙醇 4 e 静置过夜沉淀多糖、4 000 r/ min、
4 e 离心10 min, 沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚
洗涤 2次,均用同样条件离心去除有机溶剂, 真空干
燥( 50 e 、- 0. 1 MPa)得精制竹黄多糖。
2. 4 换算因子的测定:由于竹黄多糖的测定与葡萄
糖是有差别的, 需测定换算因子进行换算。精密称
取干燥至恒重的精制竹黄多糖 25. 0 mg ,置 100 mL
量瓶中,加蒸馏水溶解并定容。精密吸取100 LL,测
定吸光度,由回归方程求出葡萄糖的浓度, 按下式计
算换算因子: f = W (C @ D) , 式中 W 为多糖的质量
(Lg) , C为多糖溶液中葡萄糖的质量浓度(Lg / mL) ,
D为多糖溶液的稀释倍数,测得 f = 1. 68。
2. 5 精密度试验: 精密吸取竹黄多糖待测液 1. 0
mL,连续测定吸光度 5次, 结果 RSD为 0. 985%。
2. 6 重现性试验:平行精密吸取 5份竹黄多糖待测
液,每份各 1. 0 mL,测定吸光度, RSD为 2. 143%。
2. 7 稳定性试验: 精密吸取竹黄多糖待测液 1. 0
mL, 分别在 0、10、20、30、60 m in 测 定, RSD
为0. 731%。
2. 8 回收率试验:精密称取干燥至恒重的竹黄粉末
5份,每份为 1. 0 g ,分别精密添加不同量葡萄糖标准
对照溶液,按照 2. 3的方法制备竹黄待测液, 按 2. 2
方法测定吸光度, 结果得平均回收率 98. 79%, RSD
为 1. 624%。
2. 9 不同来源竹黄中多糖量的测定: 采用苯酚-硫
酸法[ 7-8] 测定不同来源竹黄(不同生长时期、不同地
点、不同寄主)中多糖的量。将竹黄多糖粗制品转移
至 50 mL 量瓶中,加蒸馏水溶解定容,混匀,此溶液
即为竹黄多糖待测液。精密量取上述待测液适量,
加蒸馏水至 2. 0 mL, 测定吸光度, 重复 3 次。用回
归方程计算待测样品溶液中葡萄糖的质量浓度, 按
下式计算样品中多糖的量: 多糖量= ( C @ D @ f / W )
@ 100%。
2. 9. 1 不同寄主上生长的竹黄多糖量随时间的变
化:临安九仙山短穗竹、苦竹、雷竹、篌竹上寄生的竹
黄(分别为 Sb1、Sb2、Sb3和 Sb4)多糖量随时间的变
化见图 1。
由图 1可见, Sb1、Sb3 和 Sb4竹黄多糖的量均
在 5月上旬达到最大, 而 Sb2则在 5月中旬达到最
高。不同寄主以雷竹上寄生的竹黄多糖的量为最高
( 6. 79%) , 苦竹次之, 再是 篌竹, 短穗竹最低
( 4. 68%, 为雷竹竹黄的 68. 9%)。这与竹红菌甲素
的变化规律不同, Sb1、Sb3和 Sb4 竹红菌甲素的量
#1550# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
图 1 同一地点不同竹种上寄生的竹黄
多糖量随时间的变化
Fig. 1 Variation of polysaccharide in S1 bambusicola
stroma parasitizing at different bambooes
f rom same place in different time
( Sb2未测)均在 4 月下旬达到最大, 且以篌竹上寄
生的竹黄竹红菌甲素的量最高, 短穗竹次之, 雷竹最
低(这与多糖的规律正好相反) [ 6]。
考虑到不同寄主、不同菌龄的竹黄个体大小差
异较大,只简单地考虑竹黄多糖的量而不考虑单个
竹黄含多糖的量并不全面,尤其如果从生产、采收的
角度考虑,后者比前者更重要。因此将所得结果结
合单个竹黄干质量, 得到不同寄主上寄生的单个竹
黄多糖量随时间的变化规律见图 2。
图 2 同一地点不同竹种上寄生的单个竹黄多糖量
随时间的变化
Fig. 2 Variation of polysaccharide in each S1 bambusicola
stroma parasitizing at different bambooes
from same place in different time
从图 2可以看出 Sb1、Sb2单个子座多糖的量在
5月上旬达到最高值, 而 Sb3、Sb4 均在 5 月中旬达
到最高值, 此规律与竹黄多糖的量随时间变化规律
基本一致。值得一提的是, Sb1、Sb3和 Sb4单个子
座竹红菌甲素( Sb2未测)达到最高值的时间与多糖
达到最高值的时间基本一致[ 6] 。
与图 1结果不同, 单个竹黄所含多糖的量以 Sb2
最高( 9. 67 mg/个、Sb1与 Sb3居中,两者非常接近,
分别在 5月 7日达到 6. 35 mg /个与 5月 12日达到
6. 33 mg/个, Sb4 最低 ( 2. 03 mg /个, 仅为 Sb2 的
21. 0%) , 可见不同竹种单个竹黄所含多糖的量差异
更明显。这是因为 Sb1 与 Sb2, 特别是 Sb2子座较
大, Sb3居中,而 Sb4较小。
如从生产上考虑, 应该认为 5 月上中旬是采集
竹黄的最好时期,这时候竹黄个大, 含竹黄多糖与竹
红菌甲素均最高。
2. 9. 2 同种寄主上竹黄多糖的量随时间的变化:临
安九仙山短穗竹与青山湖短穗竹上寄生的竹黄(分别
为Sb1与 Sb5)的多糖量随时间的变化规律见图 3。
图 3 临近地点短穗竹上寄生竹黄多糖量随时间的变化
Fig. 3 Content variation of polysaccharide in S1 bambu-
sicola stroma parasitizing at B1 densif lorum
from near spot in dif ferent time
由图 3可见,邻近地点、同一寄主上竹黄多糖的
量随时间的变化趋势基本相同, 均在 5 月中旬达到
最高值,而绝对值以青山湖的竹黄较高,其最高值为
九仙山竹黄的 1. 13 倍。这可能是因为多糖的量受
小环境的影响, 青山湖环境相对湿度较大, 有利于多
糖的形成。
将图 3的结果结合单个竹黄质量, 得到邻近地
点短穗竹上单个竹黄含多糖随时间的变化曲线, 见
图 4。
由图 4 可见, Sb5 单个子座多糖的量最高值
明显比Sb1的高( 1. 35倍) ,比竹黄多糖的量的差异明
图 4 临近地点短穗竹上单个竹黄多糖量
随时间变化曲线
Fig. 4 Variation of polysaccharide in S1 bambusicola
stroma parasitizing at B1 densif lorum from near
sport in diff erent time
#1551#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
显,主要是因为 Sb5 子座普遍比 Sb1的大。这可能
是因为青山湖湿润的环境不但有利于多糖合成, 也
有利于竹黄菌的生长,形成较大子座。
2. 9. 3 不同采样点短穗竹上单个竹黄多糖的量比
较: 不同采样点短穗竹上生长的单个竹黄多糖与竹
红菌甲素的量见表 2。
表 2 不同采样点短穗竹上单个竹黄多糖
与竹红菌甲素的量(…x ? s, n= 3)
Table 2 Content of polysaccharide and hypocrellin A in each
S1 bambusicola stroma parasitizing at B1 densif lo-
rum from different sampling areas (…x ? s, n= 3)
编号 多糖/ ( mg # 个- 1) 竹红菌甲素/ ( Lg # 个- 1)
Sb1 6. 35 ? 0. 14 J j* 10. 62 ? 0. 16 Cc
Sb5 8. 59 ? 0. 16 Ee 9. 23 ? 0. 21 Ee
Sb6 9. 21 ? 0. 19 Cc 8. 40 ? 0. 18 Ff
Sb7 8. 42 ? 0. 20 Ff 9. 23 ? 0. 25 Ee
Sb8 7. 96 ? 0. 11 H h 10. 30 ? 0. 13 Dd
Sb9 6. 89 ? 0. 14 Ii 2. 62 ? 0. 05 Ll
Sb10 4. 50 ? 0. 05 Kk 6. 47 ? 0. 10 Ii
Sb11 7. 88 ? 0. 12 H h 6. 77 ? 0. 13 H h
Sb12 6. 92 ? 0. 08 Ii 5. 31 ? 0. 10 Jj
Sb13 9. 07 ? 0. 09 Dd 3. 22 ? 0. 07 Kk
Sb14 8. 16 ? 0. 18 Gg 16. 60 ? 0. 29 Aa
Sb15 12. 43 ? 0. 21 Aa 7. 48 ? 0. 17 Gg
Sb16 10. 25 ? 0. 23 Bb 11. 22 ? 0. 24 Bb
* 不同大写字母标注的数字表示在 0. 01 水平差异极显著,不同
小写字母标注的数字表示在 0. 05水平差异显著
* Data marked with different capital letters m ean very signif icant
di ff erence at 0. 01 level , data marked wi th dif ferent small let ters
m ean signif icant dif f erence at 0. 05 level
由表 2可见,除个别差异性不显著外, 大多数不
同采样点短穗竹上寄生的竹黄在同一时期不论是
多糖还是竹红菌甲素的量均存在极显著的差异,可见
竹黄中这 2种主要有效成分的量受环境的影响较
大。那么不同采样点短穗竹上单个竹黄多糖与竹红
菌甲素的量之间是否存在相关性, 分析结果表明相
关性系数 R= 0. 143< R0. 01 = 0. 641, 可见两者之间
的相关性不显著, 可能是因为多糖与竹红菌甲素的
合成途径不同。
3 讨论
经查阅国内外文献, 未见有关竹黄菌子座多糖
量的报道。本实验分析比较了不同来源竹黄的多糖
量,并进行了差异性与相关性分析, 不但初步揭示了
竹黄多糖的变化规律, 而且为中药材竹黄的开发利
用提供了一定的理论依据与指导。
在竹黄多糖的测定中, 多糖的提取工艺与测定
方法对结果的准确性至关重要, 而对于竹黄多糖的
提取与分析,很少有现成的文献可供参考, 本实验经
过试验摸索,筛选出了以上的工艺与方法, 经验证其
精密度、重现性、稳定性、回收率等均较理想, 证明试
验方法稳定可行。
参考文献:
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促进剂组合对中国红豆杉细胞悬浮培养紫杉醇合成的影响
李干雄1, 2 ,张京维1, 2 ,骆雪兰1, 2 ,侯云屏1, 2 ,黄巧明1, 2*
( 11 梅州市杉维生物医药工程研究有限公司,广东 梅州 514031; 21 紫杉醇产业工程技术研究开发中心,广东 梅州 514031)
摘 要:目的 研究中国红豆杉 Taxus chinensis 细胞悬浮培养中蔗糖、柠檬酸三铵、水杨酸和氨基酸前体组合对细
胞生长和紫杉醇( tax ol)积累的影响。方法 采用 L9 ( 34 )设计试验,考察了第 9 天添加蔗糖( 10、16、22 g / L )、柠檬
酸三铵( 0、154、1 540 mg/ L) ,第 21 天添加蔗糖( 20、26、0 g/ L)和不同时间组合添加水杨酸及氨基酸前体 4 个因素
对红豆杉细胞悬浮培养和紫杉醇合成的影响。结果 当在细胞培养的第 0 天添加 11 67 mg / L 硝酸银, 第 9 天添加
10 g / L蔗糖 ,第 9 天添加 1 540 mg / L 柠檬酸三铵, 紫杉醇达到最高, 在此最优组合处理时紫杉醇质量浓度达到
391 2 mg / L ,相对于最差组合处理的( 21 1 mg/ L )时提高 181 7 倍。结论 促进剂组合对中国红豆杉细胞悬浮培养的
生长和紫杉醇的合成都有很明显的影响。
#1552# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 11-04 基金项目:中小企业创新基金(国防科发计字[ 2008] 434号) ;山区及东西两翼技术创新项目( 2007915226)作者简介:李干雄( 1972 ) ) ,男,广东省五华人, 1994毕业于四川大学生物工程系微生物专业,生物技术工程师,主要从事红豆杉植物细胞大量培养生产紫杉醇的研究。Tel: ( 0753) 2183210 Fax: ( 0753) 2183269 E- mail : ganx ion gli@ hotmail1 com