全 文 ：311 　检测波长的选择 :经二极管阵列检测器分析 ,
丹皮酚分别在 238、274 nm 处有吸收峰 ,而马钱苷
仅在 238 nm 处有吸收峰 ,且在该波长下 ,两成分均
有较大吸收 ,因此 ,选择波长 238 nm 测定本品中马
钱苷、丹皮酚。
312 　流动相的选择 :《中国药典》2005 年版一部中
六味地黄丸有关马钱苷的测定以含有四氢呋喃为流
动相[ 3 ] ,而四氢呋喃对反相色谱系统的柱塞密封圈
有一定的腐蚀性 ,故本实验对马钱苷的色谱条件进
行了系统的研究 ,发现其在以甲醇2水为流动相中可
达到很好的分离 ,且可与丹皮酚在同一的流动相体
系中进行测定 ,最后实现了二者的同时测定。
313 　提取条件的筛选 :本实验考察了超声和回流两 种提取方法 ,结果表明两种提取方法相当 ,因超声提取相对操作简单、方便 ,故确定以超声处理为本实验的提取方式。马钱苷为水溶性成分 ,而丹皮酚为脂溶性成分 ,进一步试验 ,考察不同提取溶剂 (100 %、80 %、50 %、30 %甲醇) ,发现二者在 50 %甲醇的条件下提取率最高 ,所以选择 50 %甲醇作为提取溶剂。在此基础上 ,比较了不同的超声时间 (10、15、30、45 min) ,结果表明超声时间对二者的提取率影响不大 , 可选择超声 15 min 提取马钱苷和丹皮酚。参考文献 :[1 ] 　冯燕芹 ,王振中1 HPLC 测定六味地黄丸 (浓缩) 中熊果酸的含量[J ]1 中草药 ,1999 ,30 (3) :19121921[ 2 ] 　刘德军1 六味地黄丸现代研究与应用[ M ]1 北京 :人民卫生出版社 ,20021[ 3 ] 　中国药典[ S]1 一部120051
女贞子多糖除蛋白工艺的研究
万 　琴1 ,萧 　伟2 3 ① ,王振中2 ,尚 　强2
(11 南京中医药大学 ,江苏 南京 　210046 ; 21 江苏康缘药业股份有限公司 ,江苏 连云港 　222001)
摘 　要 :目的 　筛选女贞子多糖除蛋白的最佳工艺。方法 　以除蛋白率和多糖损失率为指标 ,比较了 3 种不同的
除蛋白方法 (Sevag 法、三氯乙酸法和三氯乙酸2Sevag 法)的效果 ,并用正交试验优选出最佳工艺。结果 　女贞子多
糖除蛋白的最佳工艺为以 1 倍量 10 %三氯乙酸溶液除蛋白 1 次 ,静置 2 h ,离心。结论 　优选出的除蛋白方法效果
较好 ,为女贞子多糖的制备工艺的进一步研究提供了参考。
关键词 :女贞子 ;多糖 ;除蛋白 ;正交试验
中图分类号 :R28412 ;R286101 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0320407204
　　女贞子为木犀科常绿乔木女贞 L i g ust rum l u2
ci d um Ait 的干燥成熟果实 ,始载于《神农本草经》,
是一味常用中药材 ,具有扶正固本、补益肝肾、清热
明目的功效 ,临床主要用于强腰膝、乌须发 ,治疗阴
虚内热、头昏耳鸣等症。现代药理研究明表明[1～3 ] ,
女贞子多糖具有显著的免疫增强和抗氧化、抗衰老
作用。有化学研究表明 ,女贞子多糖 (polysaccha2
ride f rom L i g ust rum l uci d um Ait . , PLL A)主要由
鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖及岩藻糖 4 种糖组成[4 ] 。
近年来 ,对女贞子的研究主要集中在其脂溶性成分
如齐墩果酸、熊果酸等 ,而女贞子多糖的研究较少。
由于粗多糖的水提液在醇沉的过程中蛋白质会一起
沉淀下来 ,影响后续的分离纯化研究 ,因此确定除蛋
白质效率高且多糖损失率小的除蛋白方法是很关键
的环节[ 5 ] 。本实验以多糖损失率和蛋白质清除率为
指标 ,针对女贞子多糖选用了 Sevag 法、三氯乙酸法
( TCA 法) 、三氯乙酸2Sevag 法 3 种不同的除蛋白方
法 ,并采用正交试验法优选了三氯乙酸法除蛋白的工
艺 ,旨在筛选简单、可行的女贞子多糖除蛋白方法 ,为
其他植物多糖的除蛋白工艺研究提供一定的参考。
1 　实验材料
女贞子购于安徽亳州药材市场 ,经江苏康缘药
业股份有限公司吴舟主管药师鉴定。
UV2550 —PC 紫外可见分光光度计 ; TDL —
5 —A 型离心机 ;BP —211D 型电子天平 ;牛血清白
蛋白、考马斯亮蓝 G2250 (国药集团化学试剂有限公
司) ; D2无水葡萄糖 (中国药品生物制品检定所 ,批
号为 1108332200503) ;氯仿、正丁醇、三氯乙酸、苯
·704·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
①收稿日期 :2009207203　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :万　琴 (1985 —) ,女 ,湖北荆州人 ,硕士 ,南京中医药大学药剂学专业研究生 ,从事中药制剂的研究与开发。
Tel : (0518) 85521930 　E2mail :wanqingood @gmail1com3 通讯作者　萧　伟　E2mail :xw @kanion1com
酚、浓硫酸均为国产分析纯。
2 　方法与结果
211 　女贞子粗多糖的提取 :取女贞子粗粉 4 kg ,加
10 倍体积的乙醇回流提取 2 次 ,每次 2 h ,滤过 ,药
渣挥干乙醇后 ,加 15 倍量的水提取 2 次 ,每次 2 h ,
合并提取液 ,减压浓缩至药液相对密度为 1105
(20～25 ℃) ,加乙醇至体积分数为 80 % ,静置 12 h ,
离心 ,沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤数
次 ,抽滤 ,真空干燥后得到女贞子粗多糖约 240 g。
212 　多糖和蛋白质的测定 :多糖测定采用改良的苯
酚2硫酸法[6 ] ;蛋白质测定采用考马斯亮蓝 G2250 比
色法[ 7 ] 。
21211 　糖标准曲线的制备 :称取干燥至恒重的葡萄
糖对照品 14174 mg 置 100 mL 量瓶中 ,加水溶解并稀
释至刻度 ,制成质量浓度为 14714μg/ mL 储备液。精
密吸取储备液 0、011、013、015、017、019 mL 分别置于
具塞试管中 ,各加蒸馏水使总体积为 110 mL ,再分别
加 6 %苯酚试液 110 mL ,摇匀 ,迅速滴加浓硫酸 510
mL ,摇匀后置沸水浴中加热 15 min ,冰水中 15 min ,
再室温放置 30 min ,取出 ;另以蒸馏水 110 mL 加苯酚
和硫酸 ,同上操作作为空白对照 ,于 490 nm 波长处测
定吸光度 ,以吸光度 ( A) 为横坐标 ,葡萄糖质量浓度
( C)为纵坐标 ,进行回归处理 , 得回归方程为 C =
01010 58 A + 01002 28 , r = 01999 92 ,表明葡萄糖在
0～132166μg/ mL 具有良好的线性关系。
21212 　样品中葡萄糖量的测定 :精密量取样品溶液
1 mL ,自标准曲线的制备项下“再分别加 6 %苯酚试
液 110 mL”起测定其吸光度值 ,平行 3 次。
21213 　蛋白质标准曲线的制备 :称取牛血清白蛋白
15114 mg ,置 10 mL 量瓶中 ,加水溶解后稀释至刻
度制成质量浓度为 15114μg/ mL 贮备液。分别吸
取贮备液 0、011、013、015、017、019 mL ,加水稀释至
1 mL ,向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝 G2250 溶液 ,
混合均匀后以蒸馏水为空白 ,5 min 后在 595 nm 波
长处测定吸光度值。以吸光度 ( A ) 为横坐标 ,牛血
清白蛋白质量浓度 ( C) 为纵坐标 , 得回归方程为 :
C = 01003 23 A - 01037 26 ,相关系数 r = 01999 37 ,
表明牛血清白蛋白在 0～136126μg/ mL 呈良好的
线性关系。
21214 　样品中蛋白质的测定 :精密量取样品溶液 1
mL ,加入考马斯亮蓝贮备液 5 mL ,振摇 ,以 1 mL
水为空白 ,5 min 后在 595 nm 波长处测定吸光度
值 ,平行 3 次。
213 　指标的确定 :采用蛋白质清除率和多糖损失率
作为指标进行考察。
蛋白质清除率 = 脱蛋白前蛋白质的量 - 脱蛋白后蛋白
质的量/ 脱蛋白前蛋白质的量 ×100 %
多糖损失率 = 脱蛋白前多糖的量 - 脱蛋白后多糖的量/
脱蛋白前多糖的量 ×100 %
214 　女贞子多糖除蛋白工艺
21411 　女贞子粗多糖溶液的配制 :取 211 项下制得
的女贞子粗多糖 20 g ,加 200 mL 水超声溶解 ,配制
3 份质量浓度为 10 %的女贞子粗多糖水溶液。
21412 　Sevag 法 :按照女贞子粗多糖水溶液、氯仿、
正丁醇的体积比为 16 ∶4 ∶1 加入氯仿与正丁醇 ,手
摇 20 min 后于分液漏斗中静置 2 h ,离心取上清液 ,
浓缩至相对密度为 1105 (20～25 ℃) ,加入乙醇至体
积分数达 80 % ,静置 12 h ,离心得沉淀物 ,依次用适
量无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤 ,抽滤 ,干燥后得女贞子
多糖 ,测定多糖和蛋白质 ,结果见图 1。
21413 　三氯乙酸法 : 配制 3 %、5 %、7 %、10 %、
15 %、20 %质量浓度的三氯乙酸溶液 ,分别与女贞子
粗多糖水溶液等体积混合 ,充分搅匀 ,4 ℃静置 2 h ,
离心 ,上清液用 1 mol/ L NaO H 溶液中和至 p H 中
性 ,浓缩至相对密度为 1105 (20～25 ℃) ,加入乙醇
至体积分数达 80 % ,静置 12 h ,离心得沉淀物 ,依次
用适量无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤 ,抽滤 ,干燥后得女
贞子粗多糖 ,测定多糖和蛋白质 ,结果见图 1。
21414 　三氯乙酸2Sevag 法 :按照女贞子粗多糖水
溶液、10 %三氯乙酸、Sevag 试剂 [氯仿2正丁醇 (4 ∶
1) ]的体积比为 4 ∶4 ∶1 加入 10 %三氯乙酸和
Sevag 试剂 ,手摇 20 min 后于分液漏斗中 4 ℃静置
2 h ,离心 ,上清液用 1 mol/ L NaO H 溶液中和至 p H
中性 ,浓缩至相对密度为 1105 (20～25 ℃) ,加入乙
醇至体积分数达 80 % ,静置 12 h ,离心得沉淀物 ,依
次用适量无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤 ,抽滤 ,干燥后得
女贞子粗多糖 ,测定多糖和蛋白质 ,结果见图 1。
21415 　结果比较 :由图 1 可知 ,女贞子多糖采用
Sevag 法除蛋白 ,反复处理 4 次可以使多糖损失相
对较少 ,而蛋白质的清除率较高 ,6 次除蛋白总的清
除率为 34157 % ,而多糖的损失率达到了 39119 %。
除蛋白的主要效果在前 4 次 ,蛋白质清除率达到了
30136 % ; TCA 法除蛋白 ,蛋白质的清除率和多糖损
失率随着三氯乙酸浓度的升高而升高 ,但是多糖损
失率的增长幅度比较大。如 3 %三氯乙酸溶液的蛋
白清除率达到了 75123 % , 而多糖损失率只有
6121 %。三氯乙酸浓度越高 ,多糖的降解率就越大 ,
损失也越多。综合各种因素考虑 ,10 %的三氯乙酸
·804· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
除蛋白效果较为理想 ;三氯乙酸2Sevag 法第一次蛋
白质的清除率为 50124 % ,多糖损失率为 9131 %。
总体上比较 ,该法的蛋白质清除率介于 Sevag 法和
三氯乙酸法之间 ,且以第 3 次效果比较好。
　　由上述数据可以得出 ,3 种除蛋白的方法各有
利弊。在除蛋白的过程中 ,氯仿和正丁醇使蛋白质
变性形成凝胶物 ,部分多糖物质也会随之沉淀 ,造成
多糖的损失 ;此外 ,Sevag 法也很难除清少量与多糖
结合很牢或被多糖包裹的蛋白质。因此经典的
Sevag 法虽然温和且在避免多糖的降解方面有较好
的效果 ,但该法效率低 ,需要消耗大量的有机试剂 ,
对于蛋白质量较高的女贞子多糖来说并不是较好的
除蛋白方法。三氯乙酸法除蛋白效率较高 ,但是由
于三氯乙酸的酸性较强 ,容易导致多糖的降解 ,因此
控制好三氯乙酸的浓度尤为重要。综合上述结果 ,
在兼顾多糖损失率和蛋白质清除率的情况下 ,本实
验选用三氯乙酸法用于去除女贞子粗多糖中的蛋白
质 ,并进一步设计正交试验来优化其除蛋白的工艺。
图 1 　Sevag 法( A) 、TCA法( B) 和 TCA2Sevag 法( C) 除蛋
白的效果
Fig11 　Results of removing protein by Sevag method ( A) ,
trichloroacetic acid ( TCA) method ( B) , and com2
bination of TCA with Sevag method ( C)
215 　三氯乙酸法除蛋白工艺优化
21511 　正交试验设计 :根据文献资料及预实验结
果 ,选取 10 %三氯乙酸的用量、除蛋白次数、静置时
间为考察因素 ,每个因素选择 3 个考察水平 ,进行
L 9 (3) 4 正交试验 ,以多糖量和蛋白质清除率优选三
氯乙酸除蛋白的工艺 ,因素水平见表 1。
表 1 　因素与水平
Table 1 　Factors and levels
水平
因　素
A 三氯乙酸用量/ 倍 B 除蛋白次数/ 次 C 静置时间/ h
1 1 1 2
2 2 2 4
3 3 3 6
21512 　试验结果 :准确称取 9 份女贞子粗多糖各
20 g 于具塞试管 ,加入 200 mL 水 ,充分振摇使溶
解 ,按照正交试验安排进行女贞子粗多糖除蛋白、醇
沉、减压干燥、精密称定 ,测定各实验多糖粗品中多
糖和蛋白质 ,以综合评分 (综合评分 = 多糖质量分
数 ×50 % + 蛋白质清除率 ×50 %)为指标 ,试验安排
及试验结果见表 2 ,方差分析见表 3。
表 2 　L9 ( 3) 4 正交试验及试验结果
Table 2 　Results of L9 ( 3) 4 orthogonal test
试验号 A B C D
多糖量
/ %
蛋白质清
除率/ %
综合评
分/ %
1 1 1 2 1 38123 82181 601 52
2 1 2 4 2 30159 77131 531 95
3 1 3 6 3 25171 80150 511 85
4 2 1 4 3 21110 76104 481 57
5 2 2 6 2 17115 76123 461 69
6 2 3 2 1 16199 69197 431 48
7 3 1 6 2 14165 80103 471 34
8 3 2 2 3 12199 73195 431 47
9 3 3 4 1 10198 70144 401 71
K1 55144 52114 49116 491 31
K2 46125 48104 47174 481 26
K3 43184 45135 48163 471 96
R 11160 6180 1141 11 34
表 3 　方差分析
Table 3 　Analysis of variance
方差来源
离均差
平方和
自由度 F比
F临界值
(α= 01 05) 显著性
A 2241869 2 751132 191 000 P < 0105
B 701295 2 231486 191 000 P < 0105
C 31059 2 11022 191 000
误差 21330 2
　　3 种因素对女贞子粗多糖除蛋白的主次顺序依
次为三氯乙酸用量、除蛋白次数、放置时间。在兼顾
多糖质量分数和蛋白质清除率的情况下 ,选取各影
响因素的最优水平组合为 A1B1 C1 ,即以 1 倍量的三
氯乙酸除蛋白 1 次 ,静置 2 h ,离心为女贞子粗多糖
除蛋白的优选工艺。
3 　讨论
多糖主要以两种形式存在 ,一是纯糖链 ,另一种
是糖链与肽链结合 ,形成的糖肽或糖蛋白。多糖常
·904·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
用的除蛋白方法如 Sevag 法、三氯乙酸法、酶法等并
不能彻底去除去蛋白质 ,只能部分除去游离的蛋白
质 ,这些方法在不同程度上都会造成多糖2蛋白复合
物的损失 ,还可能影响到多糖的得率或活性。本实
验通过比较筛选出了女贞子多糖除蛋白的优选工艺
为 :以 1 倍量的 10 %三氯乙酸溶液除蛋白 1 次 ,静
置 2 h 后离心。该方法是否影响到女贞子多糖的结
构及活性 ,还有待于进一步深入的研究。
参考文献 :
[ 1 ] 　李　璘 ,丁安伟 ,孟 　丽 1 女贞子多糖的免疫调节作用研究
[J ]1中药药理与临床 ,2001 , 17 (2) : 112121 [ 2 ] 　张振明 ,蔡曦光 ,葛 　斌 ,等 1 女贞子多糖的抗氧化活性研究[J ]1 中国药师 ,2005 ,8 (6) : 48924911[ 3 ] 　张振明 ,葛　斌 ,许爱霞1 女贞子多糖的抗衰老作用[J ]1 中国药理学与毒理学杂志 , 2006 ,20 (2) : 10821111[ 4 ] 　Wang Q J , Yu H , Zong J , et al1 Determination of t he compo2sition of Chinese L i gust rum luci dum polysaccharide by capil2lary zone elect rophoresis wit h amperomet ric detection [J ]1 JPharm B iomed A nal , 2003 , 31 : 47324801[5 ] 　中国科学院上海药物所1 中草药有效成分的提取与分离[ M ]1北京 :化学工业出版社 ,19831[6 ] 　张惟杰1 复合多糖生化研究技术 [ M ]1 上海 :上海科学技术出版社 ,19871[ 7 ] 　王文平 ,郭祀远 ,李　琳1 考马斯亮蓝法测定野木瓜多糖中蛋白质的含量[J ]1 食品研究与开发 , 2008 , 29 (1) :11521171
莲必治注射液中细菌内毒素检查法的研究
陈宜鸿 ,白 　林
①
(解放军总医院医学保障部 ,北京 　100853)
摘　要 :目的 　建立莲必治注射液细菌内毒素检查 (BET)方法。方法 　参照《中国药典》2005 年版细菌内毒素检测
方法及其指导原则中干扰试验的基本原理和检测方法。结果 　莲必治注射液稀释 25 倍 (2 mg/ mL) ,采用灵敏度
01125 EU/ mL 的鲎试剂经干扰实验无增强、抑制作用。结论 　实验具有准确性、可靠性 ,细菌内毒素检查法适用
于检测莲必治注射液中的内毒素。
关键词 :莲必治注射液 ;鲎试剂 ;细菌内毒素检查
中图分类号 :R28412 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0320410202
　　莲必治注射液具有清热解毒、抗菌消炎的功效 ,
用于细菌性痢疾、肺炎、急性扁桃体炎等。细菌内毒
素检测法 , 具有灵敏 , 快速 , 简便易行等诸多优
点[1 ,2 ] ,因此本实验探讨了采用细菌内毒素检查法
检测莲必治注射液中细菌内毒素的可行性。
1 　材料与仪器
　　细菌内毒素工作标准品 (10 EU/ 支 ,厦门鲎试
剂厂 , 批 号 050301 ) ; 鲎 试 剂 ( 灵 敏 度 01125
EU/ mL ,厦门市鲎试剂实验厂有限责任公司 ,批号
051138 ;灵敏度 01125 EU/ mL ,湛江安度斯生物有
限责任公司 ,批号 0503070) ;细菌内毒素检查用水
(B ET 水 ,2 mL/ 支 ,湛江博康海洋生物有限公司 ,内
毒素 < 01005 EU/ mL ,批号 050804) ;莲必治注射液
(2 mL ∶011 g ,无锡山禾药业股份有限公司 ,批号
050302、050517、050912) 。
　　超净工作台 (四达净化技术研究所) ;电热恒温
水浴锅 (上海沪南科学仪器联营厂) ;旋涡混合器 (江
苏海门市麒麟医用仪器厂) 。
2 　方法与结果
211 　鲎试剂 ( TAL ) 灵敏度 (λ) 复核试验 :按《中国
药典》2005 年版附录细菌内毒素检查法复核试验用
TAL 的灵敏度 ,2 批 TAL 灵敏度复核结果显示λc
均在 015λ～210λ,均符合《中国药典》规定 ,可用于
细菌内毒素检查 ,并以其标示值为灵敏度[1 ] 。
212 　供试品细菌内毒素限值 (L )的确定
21211 　按人用最大剂量确定 :《中国药典》2005 年
版规定注射剂的致热阈值 ( K)为 510 EU/ (kg ·h) ,
根据临床用法 ,人一次应用最大剂量 ( M ) 为 600
mg/ (60 kg ·h) ,则其细菌内毒素理论限值 ( L′) 为 :
L′= K/ M = 510/ (600 ×60) = 015 EU/ mg。
21212 　按静脉滴注用药细菌内毒素总限量确定 :根
据本品临床用法 ,成人一次 500～600 mg ,溶于 250
mL 019 %氯化钠注射液中 ,静脉滴注 ,按 600 mg 莲
必治注射液与 250 mL 019 %氯化钠注射液 (细菌内
毒素限值 LNaCl为 015 EU/ mL)静脉滴注作为 1 h 的最
大剂量计算 ,混合药液的细菌内毒素总限量应小于或
等于《中国药典》规定的 K 值 (510 EU/ kg ·h) ,即
(600 mg ×L + 250 mL ×L NaCl ) / (60 kg ·h) ≤K ,计
·014· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
①收稿日期 :2009207215