全 文 ：葎草酮抑制人胃癌细胞 SGC27901 N2乙酰基转移酶 1
活性的酶动力学研究
高世勇1 ,2 ,郎 　朗1 ,2 ,邹 　翔1 ,2 ,汲晨锋1 ,2 ,季宇彬1 ,2 ,马 　强1 ,2 ,岳 　磊1 ,2 ,曲中原1 ,2 ,尚 　明1 ,2
①
(11 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心 药物研究所博士后科研流动站 ,黑龙江 哈尔滨 　150076 ;
21 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心 ,黑龙江 哈尔滨 　150076)
摘 　要 :目的 　探讨葎草酮对人胃癌 SGC27901 细胞 N2乙酰基转移酶 1 (NA T1) 酶动力学常数的影响。方法 　采
用 HPLC 法 ,以 NA T1 酶特异性底物对氨基苯甲酸 ( PABA) 为底物 ,以 SGC27901 完整细胞及细胞质内 PABA
被 NA T1 乙酰化为 Ac2PABA 的速度为 NA T1 酶的反应速率 ,采用双倒数作图法 ,以底物 PABA 浓度的倒数对
NA T1 反应速率的倒数进行直线回归 ,得出回归方程 ,计算米氏常数 ( Km ) 和最大反应速率 (V max ) 。结果 　酶动
力学研究表明 ,以 PABA 为底物 ,对于 SGC27901 完整细胞 ,阴性对照组的 Km 和 V max 分别为 (31910 ±01087)
μmol/ L 、(01306 0 ±01006 7) pmol (1 ×106 个细胞) ,葎草酮组的 Km 和 V max 分别为 (31830 ±01123) μmol/ L 、
(01275 0 ±01005 8) pmol (1 ×106 个细胞) ,对于 SGC27901 细胞质 ,阴性对照组的 Km 和 V max 分别为 (76012 ±
21012) μmol/ L 、(01191 0 ±01043 7) pmol/ (mg ·min) ,葎草酮组的 Km和 V max分别为 (44910 ±7219) μmol/ L 和
(01094 0 ±01010 4) pmol/ (mg ·min) ,数据经统计学处理表明对 SGC27901 完整细胞或细胞质中的 NA T1 酶 ,阴
性对照组和葎草酮组的 Km没有统计学差异 ,而 V max有显著差异。结论 　葎草酮是 SGC27901 人胃癌细胞 NA T1
酶 PABA 底物的非竞争性抑制剂。
关键词 :葎草酮 ; 人胃癌细胞 SGC27901 ; N2乙酰基转移酶 1 (NA T1) ; 米氏常数 Km ; 最大反应速率 V max
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 04 - 0931 - 04
Effects of humulon on kinetic constants of NAT1 in SGC27901 cells
GAO Shi2yong1 ,2 , L AN G Lang1 ,2 , ZOU Xiang1 ,2 , J I Chen2feng1 ,2 , J I Yu2bin1 ,2 ,
MA Qiang1 ,2 , YU E Lei1 ,2 , QU Zhong2yuan1 ,2 , SHAN G Ming1 ,2
(11 Post2doctoral Research Station , Institute of Materia Medica , Center of Research and Development on Life Sciences
and Environment Sciences of Harbin University of Commerce , Harbin 150076 , China ; 2. MO E Engineering
Research Center of Natural Anticancer Drugs , Harbin University of Commerce , Harbin 150076 , China)
Abstract : Objective 　To explore t he effect s of humulon on kinetic parameters of N2acetylt ransferase21
(NA T1) of human gast ric cancer SGC27901. Methods 　Employing HPL C , using para2aminobenzoic acid
( PABA) as subst rate , in intact SGC27901 cells and t heir cytoplasm , taking t he speed of PABA being
acetylated to Ac2PABA by NA T1 as t he rate of NA T1 , using double recip rocal plot , taking t he recip rocal
of concent ration of PABA and reaction rate of NA T1 as coordinates , regression equation was obtainied and
the Michaelis constant ( Km ) and maximum reaction velocity (V max ) were calculated. Results 　St udy on en2
zyme kinetics demonst rated , as for intact SGC27901 cells , Km and V max of cont rol group were (3. 910 ±
0. 087) μmol/ L and (0. 306 0 ±0. 006 7) p mol/ L (1 ×106 cells) , respectively , Km and V max of the humulon
group were (3. 830 ±0. 123) μmol/ L and (0. 275 0 ±0. 005 8) p mol (1 ×106 cells) , respectively. As for the
cytoplasm of SGC27901 cells , Km and V max of cont rol group were (760. 2 ±210. 2) μmol/ L and (0. 191 0 ±
0. 043 7) p mol/ ( mg ·min) , Km and V max of t he humulon group were ( 449. 0 ±72. 9 ) μmol/ L and
(0. 094 0 ±0. 010 4) p mol/ (mg ·min) . Statistically , as for intact SGC27901 cells or t heir cytoplasm , t here
was no difference of t he Km between cont rol group and humulon group , but t here was remarkable differ2
ence of V max between cont rol group and humulon group , P < 0101 for intact cell and P < 0105 for cyto2
plasm. Conclusion 　Humulon is a noncompetitive inhibitor of NA T1 in SGC27901 cells.
Key words : humulon ; human gast ric cancer SGC27901 cells ; N2acetylt ransferase21 ( NA T1 ) ;
Michaelis constant ( Km ) ; maximum reaction velocity (V max )
·139·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
①收稿日期 :2010201218　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :黑龙江省教育厅重点项目 (11511102)
作者简介 :高世勇 (1975 —) ,男 ,博士 ,副研究员 ,硕士生导师 ,哈尔滨商业大学药物研究所所长 ,研究方向为肿瘤药理学。
E2mail : sygao2002 @163. com
　　葎草酮为大麻科植物啤酒花中的一种主要化学
成分 ,在桑科植物葎草的球果中量也较高。啤酒花
是一种重要的传统中药 ,也是酿造啤酒的重要原料 ,
其中α2酸及β2酸是啤酒花苦味的主要来源 ,因其独
特的药用价值而成为近年研究的热点[ 1 ] 。葎草酮作
为啤酒花α2酸的主要成分之一 ,有研究表明其对化
学方法诱导的小鼠皮肤癌有较好疗效[2 ] ,与影响环
氧化酶 2 ( COX22) 活性及基因表达有关[3 ] , Tobe
等[ 4 ]报道葎草酮能够诱导 HL260 细胞凋亡。另有
研究[5 ]发现葎草酮抑制肿瘤新生血管的生成从而达
到抗肿瘤的作用。
本课题组前期研究表明葎草酮对人胃癌细胞
SGC27901 有较好的抑制作用 ,作用机制与抑制肿
瘤细胞内 N2乙酰基转移酶 1 (NA T1) 的活性和基
因表达有关[6 ] ,即葎草酮是一种 NA T1 酶抑制剂。
酶的抑制剂一般分为 3 类 :竞争性抑制剂 ,非竞争性
抑制剂和反竞争性抑制剂。不同类型的抑制剂影响
酶活性的机制是截然不同的 ,因此 ,为了深入探讨葎
草酮抑制 NA T1 酶活性的进一步机制 ,首先研究葎
草酮属于哪种 NA T1 酶抑制剂类型是非常必要的。
因此本实验主要研究葎草酮对人胃癌细胞 SGC2
7901 NA T1 酶动力学相关常数的影响 ,揭示葎草酮
作为酶抑制剂的类型 ,为进一步探讨葎草酮是如何
抑制 NA T1 酶活性而发挥抗肿瘤作用提供依据。
1 　材料
111 　细胞株 :人胃癌 SGC27901 细胞株 ,购自美国
A TCC ( American Type Cult ure Collection) ,由黑
龙江省肿瘤医院肿瘤研究所保种提供。
112 　药品与试剂 :葎草酮 (质量分数 95 %) 购自北
京豪盛酒花制品厂。对氨基苯甲酸 ( PABA) 、Tris、
AcCoA、BSA、乙酰肉毒碱、肉毒碱乙酰转移酶购于
美国 Sigma 公司 ;Ac2PABA 购于美国 FL U KA 公
司 ;RPMI 1640 细胞培养液、胰酶购于美国 Gibco
公司 ; PMSF ,亮抑酶肽购于上海华舜生物工程有限
公司 ;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限
公司 ;D T T 购于国药集团化学试剂有限公司 ; ED2
TA 购于天津市福晨化学试剂厂。
113 　仪器 :CO —150 型 CO2培养箱 (美国 NBS 公
司) ; SW2CJ —2F 型超净工作台 (苏州净化设备
厂) ; Olymp us IX70 型倒置显微镜 ( Olymp us 公
司) ; Waters 2695 型高效液相色谱仪、Symmetry2
Shield C18逆向色谱柱 (250 mm ×4. 6 mm , 5μm) ,
美国 WA TERS 公司 ;LD5 —2 型离心机 (北京医用
离心机厂) ; 6R 型台式冷冻离心机 (美国 B EC K2
MAN2COUL TER 公司) ; AS —2060B 型超声波提
取器 (天津奥特赛恩斯仪器有限公司) 。
2 　方法
211 　细胞培养 : SGC27901 细胞以适量浓度接种于
细胞培养瓶中 ,加入含 10 % 胎牛血清的 RPMI
1640 培养液 ,置于 37 ℃恒温、5 % CO2及饱和湿度
的二氧化碳培养箱中培养 ,细胞贴壁生长 ,每 2～3
d 传代 1 次 ,取对数生长期细胞备用。
212 　葎草酮对 SGC27901 完整细胞 NA T1 酶动力
学常数的影响
21211 　分组及给药 :取处于对数生长期的 SGC2
7901 细胞 ,0125 % 胰酶消化后 ,用含 10 % 胎牛血
清的 RPMI 1640 细胞培养液调整细胞浓度为 5 ×
105 / mL ,铺入 24 孔板中 ,每孔 1 mL ,24 h 后分别加
入相应的试剂。实验分为 5 个不同底物浓度的阴
性对照组和 5 个不同底物浓度的葎草酮组 ,阴性对
照组及葎草酮组分别给予不同浓度的底物 PABA
(终浓度分别为 51625、11125、2215、45、6715μmol/
L) 。阴性对照组不加葎草酮 ,而给予相同体积的
RPMI 1640 细胞培养液。葎草酮组加入终浓度 28
μmol/ L 的葎草酮[6 ] 。置于 37 ℃恒温、5 % CO2 及
饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养 24 h 后 HPL C
法测定 Ac2PABA 的生成量。
21212 　活性测定 : 24 h 后吸取各组的细胞培养上
清液 ,3 500 ×g 离心 10 min ,加 012 mL 10 % 三氯
乙酸沉淀蛋白 ,静置 6 h , 12 000 ×g 高速离心 5
min ,取 20μL 上清液 HPL C 自动进样进行检测。
色谱条件 :流动相 50 mmol/ L 醋酸2乙腈 (86 ∶14) ,
体积流量 018 mL/ min ,2487 紫外检测器 ( UV) ,检
测波长 266 nm ,柱温 (25 ±5) ℃,Ac2PABA 保留
时间约为 1315 min。经由 HPL C 分析 Ac2PABA
的量来反映 NA T1 活性的变化。活性用 1 ×106 细
胞生成的 Ac2PABA 的量 ( nmol) 表示。采用双倒
数作图法计算最大反应速率 ( V max ) 和米氏常数
( Km ) 。
213 　葎草酮对 SGC27901 细胞质中 NA T1 酶动力
学常数的影响
21311 　细胞质的提取 :取处于对数生长期的 SGC2
7901 细胞 1 ×107 个 ,胰酶消化后 , PBS 洗两遍 ,沉
淀的细胞悬浮在 2 mL 裂解液 [ 20 mmol/ L Tris2
HCl (4 ℃、p H 7. 5) ,1 mmol/ L D T T , 1 mmol/ L
ED TA , 50μmol/ L PMSF , 10μmol/ L 亮抑酶肽 ]
中。4 ℃下超声波破碎 20 min 后 ,先以 9 000 ×g
离心 1 min ,取上清液 ,再以 10 000 ×g 离心 60
·239· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
min ,取上清液置于冰浴中用于蛋白定量和测定
NA T1 活性 ,蛋白定量采用 Bradford 方法 ,BSA 作
为蛋白标准。
21312 　分组及给药 :实验设 5 个不同底物浓度的阴
性对照组和 5 个不同底物浓度的葎草酮组 ,分别给
予不同浓度的底物 PABA (终浓度分别为 20145、
40190、81180、163160、327120 μmol/ L ) ,阴性对照
组不加葎草酮 ,而给予相同体积 RPMI 1640 细胞培
养液。葎草酮组加入终浓度 28μmol/ L 的葎草酮。
另设空白对照组 ,空白对照组中不加 AcCoA ,用以
验证实验方法。
21313 　活性测定 :反应混合液总体积 550μL ,包括
250μL 细胞质液 ,100μL 乙酰辅酶 A 循环混合液
[ 50 mmol/ L Tris2HCl (p H 7. 5 ) , 0. 2 mmol/ L
ED TA , 2 mmol/ L D T T , 15 mmol/ L 乙酰肉毒碱 ,
2 U/ mL 肉毒碱乙酰转移酶 ] ,葎草酮组均加入 28
μmol/ L 终浓度的葎草酮 ,阴性对照组均加入等体
积细胞培养液 ,各组分别加入不同浓度的底物 PA2 BA ,37 ℃温育 5 min ,然后加入 200μL 1 mg/ mL的 AcCoA 开始反应。空白对照组不加 AcCoA ,而加入等量的双蒸水。AcCoA 终浓度为 0145 mmol/L 。将混合液于 37 ℃温育 6 h ,6 h 后加入 200μL20 % 三氯乙酸终止反应。H PL C 法测定 Ac2PABA的量 ,条件同 21212 项 ,观察葎草酮对细胞质液中NA T1 活性的影响。214 　数据处理 :数据以 x ±s 表示 ,采用 t 检验对数据进行处理。3 　结果311 　葎草酮对 SGC27901 完整细胞 NA T1 酶动力学的影响 :结果显示 Ac2PABA 生成的量在一定范围内随着底物终浓度的升高逐渐升高 ,在相同底物浓度下 ,与相应的阴性对照组比较 ,葎草酮能够抑制Ac2PABA 生成的量 (表 1) 。依据米氏方程 ,采用双倒数作图法观察葎草酮对 NA T1 动力学常数的影响 (图 1) ,发现拟合的两条回归方程交于 x 轴的负轴处。
表 1 　不同浓度底物 PABA 条件下葎草酮对 SGC27901 完整细胞生成 Ac2PABA 的量的影响 ( x ±s , n = 3)
Table 1 　Effect of humulon on production of Ac2PABA in intact SGC27901 cells for different
substrate concentration ( x ±s , n = 3)
组 　别
C/
(μmol ·L - 1 )
不同浓度底物 PABA 条件下 Ac2PABA 的生成量/ nmol (1 ×106细胞)
51 625μmol ·L - 1 111 25μmol ·L - 1 221 50μmol ·L - 1 451 00μmol ·L - 1 671 50μmol ·L - 1
阴性对照 0 01 262 5 ±01 009 6 01315 8 ±01 012 8 01 385 5 ±01 008 9 01393 5 ±01 012 2 01 429 3 ±01 012 3
葎草酮 28 01 235 1 ±01 009 3 3 3 01300 2 ±01 012 3 3 3 01 338 9 ±01 011 8 3 3 01358 3 ±01 009 8 3 3 01 379 1 ±01 009 4 3 3
　　与阴性对照组比较 : 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 01 01 vs negative cont rol group
图 1 　双倒数作图法测定 SGC27901 完整细胞中
NAT1 酶的 Vmax和 Km
Fig. 1 　Lineweaver2Burk double reciprocal plot of Vmax and
Km in SGC27901 cells by intact cells examination
312 　葎草酮对 SGC27901 细胞质中 NA T1 酶动力
学的影响 :结果显示 Ac2PABA 生成的量在一定范
围内随着底物浓度的升高而升高 ,在相同底物浓度
下 ,葎草酮组与阴性对照组比较能够抑制 Ac2PA2
BA 的生成 (表 2) 。依据米氏方程 ,采用双倒数作
图法观察葎草酮对 NA T1 动力学常数的影响 (图
2) ,发现拟合的两条回归方程交于 x 轴的负轴处。
313 　葎草酮对 SGC27901 细胞 NA T1 酶动力学常
数的影响 :依据米氏方程 ,采用双倒数作图法 ,用
Excel 软件拟合出不同的回归方程 ,根据回归方程
分别计算出完整细胞中 NA T1 酶及细胞质中
NA T1 酶的 Km和 V max ,并统计葎草酮对 NA T1 动
力学常数的影响 (表 3) ,结果表明与阴性对照组比
较 ,葎草酮能够显著降低完整 SGC27901 细胞和细
胞质的 V max ( P < 0101) ,而对于完整 SGC27901 细
胞和细胞质的 Km均没有影响。
4 　讨论
　　流行病学调查发现 ,肿瘤大约有 90 % 是由外
源性因素引起的 ,而这些外源性因素中 70 % 是由
化学致癌物引起的[7 ] 。其中芳香烃、芳香胺硝基化
合物和偶氮化合物是重要代表。芳香胺类化合物本
身无致癌性 ,但是经过体内 N2乙酰基转移酶 ( N2
acetylt ransferase , NA T) 等代谢酶代谢之后能转变
·339·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月
表 2 　不同浓度底物 PABA 条件下葎草酮对 SGC27901 细胞质生成 Ac2PABA 的量的影响 ( x ±s , n = 3)
Table 2 　Effect of humulon on production of Ac2PABA in cytoplasm of SGC27901 cells for different substrate concentration ( x±s , n = 3)
组 　别
C/
(μmol ·L - 1 )
不同浓度底物 PABA 条件下 Ac2PABA 的生成量/ (pmol ·mg - 1 )
201 45μmol ·L - 1 40190μmol ·L - 1 811 80μmol ·L - 1 1631 60μmol ·L - 1 327120μmol ·L - 1
阴性对照 0 11 840 ±01098 31380 ±01 101 71 540 ±01097 111 400 ±01 079 201 600 ±01 135
葎草酮 28 11 460 ±01083 3 3 31110 ±01 145 3 3 41 980 ±01112 3 3 81 250 ±01 132 3 3 141 600 ±01 141 3 3
　　与阴性对照组比较 : 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 01 01 vs negative cont rol group
图 2 　双倒数作图法测定 SGC27901 细胞质中
NAT1 酶的 Vmax和 Km
Fig. 2 　Lineweaver2Burk double reciprocal plot of Vmax
and Km in cytoplasm of SGC27901 cells
表 3 　葎草酮对 SGC27901 完整细胞和细胞质中 NAT1 酶的
Km和 Vmax的影响 ( x ±s , n = 3)
Table 3 　Effect of humulon on Km and Vmax of NAT1
in intact SGC27901 cells and SGC27901
cytoplasm ( x ±s , n = 3)
组　别
完整 SGC27901 细胞
Km /
(μmol ·L - 1 )
V max / pmol
(1 ×106个细胞)
SGC27901 细胞质
Km /
(mmol ·L - 1 )
V max / (pmol ·
mg - 1 ·min - 1 )
阴性对照 31910 ±01087 01306 0 ±01006 7 01760 2 ±01210 2 01191 0 ±01043 7
葎草酮 31830 ±01123 01275 0 ±01005 8 3 3 01449 0 ±01072 9 01094 0 ±01010 4 3
　　与阴性对照组比较 : 3 P < 01 05 　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105 　3 3 P < 01 01 vs negative cont rol group
为活性很强的终极致癌物。此外还包括有胺类代谢
产物 ,如羟胺等化合物 ,其中一些具有很强的致癌
性。NA T 是大多数哺乳动物体内参与二相乙酰化
反应的代谢酶 , NA T 在人体中具有 NA T1 和
NA T2 [8 ]两个亚型 ,NA T 在人体内活性的大小与肿
瘤的易感性密切相关[9 ] 。对于酶的活性目前从技术
上还难以直接测定 ,而 PABA 是 NA T1 的特异性
底物 ,NA T1 能够将 PABA 乙酰化为 Ac2PABA ,因
此测定单位时间内 Ac2PABA 生成的量即可间接反
映 NA T1 酶的活性。本实验即采用 H PL C 法测定
Ac2PABA 的生成量而观察 NA T1 的催化活性及葎
草酮对 NA T1 酶动力学的影响。
前期研究中以人胃癌细胞 SGC27901 为研究模
型 ,在观察葎草酮对 SGC27901 细胞株细胞毒作用
的基础上 ,以 NA T 酶为研究靶点 ,揭示葎草酮预防
肿瘤发生及抑制肿瘤的作用机制 ,发现葎草酮对人
胃癌细胞 SGC27901 有较好的抑制作用 ,作用机制
与抑制肿瘤细胞内 NA T1 的活性和基因表达有
关[6 ] ,即葎草酮是一种 NA T1 酶抑制剂。本研究采
用 H PL C 法 ,依据酶动力学中的米氏方程理论 ,采
用双倒数作图法 ,分别测定不同浓度底物下 NA T1
酶的活性 ,计算 V max 和 Km ,以此推断葎草酮作为
NA T1 酶抑制剂的抑制类型。实验结果表明 ,对于
人胃癌细胞 SGC27901 ,无论完整细胞还是细胞质
中 ,葎草酮均能够降低 NA T1 的 V max ,而对 Km都无
影响。这一结果表明葎草酮是 NA T1 酶的一种非
竞争性抑制剂。也就是说葎草酮不与底物 PABA
竞争结合位点 ,即葎草酮作用于 NA T1 酶的位点与
PABA 结合 NA T1 酶的位点不同 ,这为进一步研究
葎草酮作用于 NA T1 酶的具体结合位点和作用机
制提供了线索。在后续的研究中 ,将从 PABA 与
NA T1 酶结合位点以外的其他位点研究葎草酮与
NA T1 酶结合的方式。
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·439· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 6 期 2010 年 6 月