全 文 ：蟾毒它灵体内外抗肿瘤作用的研究
于垂亮, 侯惠民*
(上海医药工业研究院 药物制剂国家工程研究中心,上海 201203)
摘 要:目的 评价蟾毒它灵的体内外抗肿瘤作用。方法 采用 SRB 测试察蟾毒它灵对人非小细胞肺癌细胞
A549、人肝癌细胞 Bel7402、人胃癌细胞 SGC7901 和人宫颈癌细胞 HeLa 的生长抑制活性。通过静脉恒速输注
方式给药,对 S180及 H 22荷瘤小鼠进行蟾毒它灵体内药效评价, 包括高剂量短时程给药和低剂量长时程给药。
结果 蟾毒它灵对 SGC7901、A549、Bel7402、H eLa 细胞作用 72 h 的 IC50值分别为 0 018、0 017、0 052、0 013
g/ mL。蟾毒它灵采用恒速输注给药方式可以实现 50% 以上的抑瘤率。结论 蟾毒它灵在体内外均具有很好的
抗肿瘤效果。
关键词:蟾酥; 蟾毒它灵; 抗肿瘤; 恒速输注
中图分类号: R286 91 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2010) 10 1683 04
传统中药蟾酥具有很好的抗肿瘤效果, 蟾毒它
灵为其中的一个主要成分 [ 1] , 与同类其他化合物相
比,蟾毒它灵抗肿瘤活性较好,毒性较低, 值得深入
研究开发。研究表明, 蟾毒它灵体外对肿瘤细胞的
生长具有抑制活性[ 26] ,但其在动物体内的抗肿瘤作
用尚未见报道。蟾毒它灵在小鼠体内的生物半衰期
( t1/ 2 ) 很短, 为 28 min。在药动学上称之为超速处
置类药物,此类药物在临床用药实践中,为维持体内
有效血药浓度必须多次给药。若按药物的 t1/ 2给
药,则给药过于频繁; 若药物毒性不大, 可适当加大
剂量, 给药周期可适当延长。但如果药物的治疗指
数小, t1/ 2又较短,临床多采用静脉恒速滴注给药 [ 7]。
蟾毒它灵正是治疗指数小, t 1/ 2又较短的一类化合
物,因此在评价其药效时, 合理的给药方式十分重
要。本研究主要从体外细胞水平初步评价蟾毒它灵
的抗肿瘤作用, 并进一步通过体内动物实验考察蟾
毒它灵以恒速输注给药方式对荷瘤小鼠的肿瘤抑制
作用,为其临床合理应用提供理论依据。
1 材料
1 1 仪器: YP2001N 型电子天平 (上海精密科学
仪器有限公司) ; BS 110S 电子分析天平 ( Sartori
us) ; TS2 60 恒流泵 (保定兰格恒流泵有限公司) ;
CSF 18 型超声波洗涤器 (上海超声波仪器厂) ; 酶
标仪 (美国 Beckman 公司 DG3022 型) ; 全自动
CO 2孵箱 (杜邦公司 N apco 6100)。
1 2 药品与试剂: 蟾毒它灵 (自制, 质量分数为
97 5% ) ; 5FU (南通精华制药有限公司, 质量分数
为 99%) ; RPM I 1640 培养液 (美国 Gibcobrl 公
司) ;小牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公
司) ;磺酰罗丹明 B ( SRB) (美国 Sigma 公司) ; Cre
mophor EL (德国 BASF 公司 ) , 水为灭菌注射用
水;其他试剂均为色谱纯或分析纯。
1 3 细胞株:人非小细胞肺癌 A549 细胞、人肝癌
Bel7402细胞、人胃癌 SGC7901 细胞、人宫颈癌
HeLa 细胞 (中国科学院上海细胞库)。
1 4 动物: 昆明种小鼠 (中国科学院上海实验动物
中心提供) , 雌雄各半, 体质量 18~ 22 g。
2 方法
2 1 体外抗肿瘤实验:采用 SRB 法 [ 89]。取对数生
长期 4种癌细胞, 用新鲜的 RMPI 1640培养基配制
成一定浓度的细胞悬液,按每孔 200 L 接种于 96
孔板中,每孔加入 2 L 不同质量浓度的蟾毒它灵
溶液 ( DM SO 终体积分数 ! 0 5%) , 37 ∀ 下培养
72 h,离心弃去上清。每孔细胞中加入预冷的 80%
三氯醋酸 50 L,置 4 ∀ 固定 1 h,用水冲洗 5 次,
空气干燥。每孔加入 0 4% SRB 的 1% 醋酸溶液
50 L 并在室温静置 30 m in。用 1% 醋酸水清洗 4
次,除去未结合的游离 SRB 染料。每孔加入 150
L T ris 非缓冲液 ( 10 mmol/ L , pH 10. 5) 溶解蛋
白结合染料,用酶标仪测定每孔在 520 nm 处的吸
光度 ( A ) 值。在同一 96孔板中的样品每个浓度设
置 3 个复孔, 另设 3 孔作为对照。取 3 孔平均 A
#1683#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100422 基金项目:国家重大科技专项 ( 2009ZX09103385)作者简介:于垂亮( 1978 ) ,男,山东青岛人,助理研究员,博士研究生,从事天然药物及药剂研究。
T el : ( 021) 51320211 Em ail: yucl@ nper c. com. cn
* 通讯作者 侯惠民,中国工程院院士 Tel: ( 021) 51320211 Email: houhm@ nperc. com . cn
值,计算细胞增殖抑制率 [ 911 ]。
抑制率= ( A 对照- A 样品 ) / A 对照 ∃ 100%
2 2 对 S18 0荷瘤小鼠的抗肿瘤作用
2 2 1 S180荷瘤小鼠模型制备:移植 S180肿瘤,本实
验室传代维持。无菌条件下抽取 S180荷瘤小鼠腹
水,用生理盐水稀释成 1 ∃ 106 / mL 的肿瘤细胞悬
液。每只健康小鼠右前肢腋下注射 0 2 mL 肿瘤细
胞悬液。接种后小鼠自由进食进水。
2 2 2 分组与给药: 将荷瘤小鼠称体质量, 随机分
成 4组, 为模型组、5FU 组、蟾毒它灵单次尾 iv 给
药组、蟾毒它灵恒速静脉输注给药组, 每组 10 只。
将蟾毒它灵溶于适量表面活性剂 cremophor EL 及
乙醇, 以生理盐水配成 1 mg/ mL 溶液, 0 22 m 微
孔滤膜滤过, 控制 cremophor EL 及乙醇在最终溶
液中的量不超过 10 mg/ mL。
接种第 2 天开始给药, 连续 7 d。蟾毒它灵单
次尾 iv 给药组以 5 mg/ kg 剂量每天单次给药; 蟾
毒它灵恒速静脉输注给药组以首个半 衰期
5 mg/ ( kg ∃ 28 min) 给药, 第 2 个半衰期以 2 5
mg/ ( kg ∃ 28 m in ) 给药, 其后以 2 mg/ ( kg ∃ 28
min) 给药,持续给药 8 h;模型组尾 iv 给予等体积
生理盐水。5FU 阳性对照组, 以 25 mg/ kg ip 给
药,给药 7次。
2 2 3 抑瘤率评价方法:接种肿瘤后第 10天,即末
次给药后次日, 小鼠称体质量,脱颈椎处死, 剥取皮
下实体瘤体组织,冲洗干净,滤纸吸干, 称质量,计算
各组平均瘤质量, 计算抑瘤率 (模型组的平均瘤质
量应在 1 g 以上, 且肿瘤小于 400 mg 的小鼠比例低
于 20% )。
抑瘤率= (模型组瘤质量- 给药组瘤质量) /模型组瘤质
量∃ 100%
2 2 4 统计学分析及疗效评价标准: 各组数据以
x % s 表示,统计学分析采用 t 检验。抑瘤率大于
40% ,且经 t 检验, 有显著差异时, 连续 3次疗效稳
定,则评定此药有一定疗效。
2 3 对 H 22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用
2 3 1 H 22荷瘤小鼠模型制备:小鼠肝癌 H 22移植
性肿瘤,由本实验室传代维持。无菌条件下抽取肝
癌 H2 2荷瘤小鼠腹水, 用生理盐水稀释成 1 ∃ 107 /
mL 的肿瘤细胞悬液。每只健康小鼠右前肢腋下注
射 0 2 mL 肿瘤细胞悬液。接种后小鼠自由进食、
进水。
2 3 2 分组与给药:高剂量短时程给药方案具体如
下,荷瘤小鼠称体质量,随机分成 4组, 分别为模型
组、蟾毒它灵每日两次尾 iv 给药组、蟾毒它灵短时
程 ( 12 h) 恒速静脉输注给药组、5FU 组, 每组 10
只。接种第 2 天开始给药, 连续 7 d。蟾毒它灵尾
iv 给药组以 5 mg/ kg 剂量给药, 每日早晚各 1次;
蟾毒它灵恒速静脉输注给药组以首个半衰期 5 mg/
kg ∃ 28 min 给药, 第 2个半衰期以 3 mg / ( kg ∃ 28
m in) 给药,其后以 2 5 mg / ( kg ∃ 28 m in) 给药,持
续给药 12 h;模型组尾 iv 给予等体积生理盐水。5
FU 阳性对照组,以 25 mg/ kg ip 给药, 给药 7 次。
低剂量长时程给药方案具体如下, 荷瘤小鼠称体质
量,随机分成 3 组, 分别为模型组、5FU 阳性对照
组,恒速静脉输注 ( 24 h) 给药组,每组 10 只。接种
第 2天开始给药, 蟾毒它灵恒速静脉输注给药组给
药 5 d, 隔日给药 1次,以首个半衰期 2 mg/ ( kg ∃ 28
m in) 给药, 第2个半衰期以 1 mg / ( kg ∃ 28 m in) 给
药,其后以 1 mg/ ( kg ∃ 28 min) 给药,持续给药 24
h;模型组尾 iv 给予等体积生理盐水。5FU 阳性对
照组,以 25 mg/ kg ip 给药,给药 7次。
2 3 3 抑瘤率评价方法、统计学分析及疗效评价标
准同 2 2 3与 2 2 4项内容。
3 结果
3 1 体外抗肿瘤实验结果: 表 1 结果表明,蟾毒它
灵对于不同的实体瘤细胞系均具有较好的细胞生长
抑制活性, 蟾毒它灵对 SGC7901、A549、Bel7402、
HeLa 细胞作用 72 h 的 IC50值分别为 0 018、
0 017、0 052、0 013 g / mL, 显示了广谱抗肿
瘤活性。
表 1 蟾毒它灵对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用
Table 1 Inhibition of bufotalin on proliferation
of diff erent tumour cell lines
蟾毒它灵/
( g# mL- 1)
细胞增殖抑制率/ %
SGC7901 A549 Bel7402 H eLa
0 1 97 4 80 4 69 1 97 1
0 05 86 3 75 3 50 7 96 0
0 025 54 4 62 7 21 2 78 3
0 012 5 33 9 49 3 13 5 58 6
0 006 3 16 0 21 8 0 13 8
3 2 对 S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用: 肉眼可观察到
荷瘤小鼠右腋窝有明显包块, 右前肢行动困难。解
剖后取出瘤体,瘤体形状不规则,颜色粉白。质地软
硬不均。蟾毒它灵对小鼠移植性肿瘤 S180的抑制作
用结果见表 2。模型组肿瘤生长良好, 平均瘤质量
在 1 g 以上。各给药组与模型组比较, 其瘤质量均
降低,以蟾毒它灵恒速输注组抑瘤效果好,与模型组
比较差异显著 ( P< 0 001)。
#1684# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
表 2 蟾毒它灵对 S180荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用
Table 2 Inhibition of bufotalin on tumor in S180
tumorbearing mice
组 别 动物/只
开始 结束
瘤质量/ g 抑瘤率/ %
模型 9 9 1 99 % 0 54 -
5FU 9 9 0 81 % 0 23* * * 59 3
蟾毒它灵单次 iv 给药 10 10 1 20 % 0 39* * 39 7
蟾毒它灵恒速输注给药 10 10 0 85 % 0 19* * * 57 3
与模型组比较: * * P < 0 01 * * * P < 0 001
* * P< 0 01 * * * P< 0 001 v s m odel group
3 3 对 H 22荷瘤小鼠抗肿瘤作用
3 3 1 高剂量短时程给药方案下实验结果: 蟾毒它
灵高剂量短时程给药对小鼠移植性肝肿瘤 H 22的抑
制作用结果见表 3。模型组肿瘤生长良好, 平均瘤
质量在 1 g 以上。各给药组与模型组比较, 其瘤质
量均降低,以恒速输注 ( 12 h) 组抑瘤效果更好, 与
模型组比较差异显著 ( P< 0 001) ; 每日两次尾 iv
给药组也有一定的抑瘤效果 ( P< 0 001)。
3 3 2 低剂量长时程给药方案下实验结果: 蟾毒它
灵低剂量长时程给药对小鼠移植性肝肿瘤 H 22的抑
制作用结果见表 4。
表 3 蟾毒它灵高剂量短时程给药对 H22荷瘤小鼠的
肿瘤的抑制作用
Table 3 Inhibition of short term at high dose of bufotalin
on tumor in H22 tumorbearing mice
组 别 动物/只
开始 结束
瘤质量/ g 抑瘤率/ %
模型 9 9 2 73 % 0 61 -
5FU 9 9 1 31 % 0 43* * * 52 0
蟾毒它灵 iv 给药 9 9 1 64 % 0 45* * 39 9
蟾毒它灵恒速输注 ( 12 h) 给药 10 10 1 35 % 0 34* * * 50 5
与模型组比较: * * P < 0 01 * * * P < 0 001
* * P< 0 01 * * * P< 0 001 v s m odel group
表 4 蟾毒它灵低剂量长时程给药对 H22荷瘤小鼠的
肿瘤抑制作用
Table 4 Inhibition of longterm at low dose of bufotalin
on tumor in H22 tumorbearing mice
组 别 动物/只开始 结束 瘤质量/ g 抑瘤率/ %
模型 10 10 3 32 % 0 71 -
5FU 10 10 1 58 % 0 68* * * 52 4
蟾毒它灵恒速输注 ( 24 h) 给药 10 10 1 35 % 0 55* * * 59 3
与模型组比较: * * * P < 0 001
* * * P < 0 001 v s model group
4 讨论
本研究首次考察了蟾毒它灵在荷瘤小鼠体内的
抗肿瘤作用,结果表明蟾毒它灵在体内具有较好的
抗肿瘤效果。
蟾毒它灵的生物半衰期很短, t 1/ 2< 1 h, 在药动
学上称之为超速处置类药物,在临床用药实践中,为
维持体内有效血药浓度必须多次给药, 给药次数要
比一般药物更频繁。当给药周期 = t1/ 2时,按一定
的剂量,一定间隔多次给药后,体内的药物浓度逐渐
达到稳定水平,约需 6个 t1/ 2 ,给药速率等于药物在
体内的消除速率, 不会出现蓄积中毒, 若 < t1/ 2时,
则易引起中毒。蟾毒它灵是治疗指数小, t1/ 2又较短
的一类化合物,因此在评价其药效时,合理的给药方
式十分重要。寻找选择性高的抗癌药物, 应提高新
药筛选质量,增加筛选工作的可靠性和预见性, 减少
筛选结果的假阴性和假阳性,研制出有代表性的各
类肿瘤的筛选模型和筛选方法[ 8]。本研究工作正是
考虑到蟾毒它灵的一些特点,充分考察蟾毒它灵抗
肿瘤作用的潜力,降低假阴性的可能性。给药方式
不合理,生物达不到体内有效药物浓度,或有效药物
浓度的维持时间不够长,都会影响药物疗效。
本研究过程中建立了一套小鼠清醒状态下实现
长时间给药的装置[ 12] ,小鼠可以自由饮食、饮水及
排泄,可模拟临床静脉滴注的给药方式,并且可实现
多次反复给药,能够客观评价药物的潜在临床应用
价值。就蟾毒它灵这种 t1/ 2比较短的药物而言, 单次
注射给药不能很好体现药效,会造成给药方式不当
引起的假阴性结果。本研究通过不同给药方式进行
药效评价,基本肯定了蟾毒它灵对荷瘤小鼠的抗肿
瘤药效,其抗肿瘤作用机制有待进一步研究。
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2010201453364 20100330
卷柏提取物对去卵巢大鼠骨代谢的影响
郑晓珂1, 2 ,陈克宇2 , 侯庆伟2 , 王小兰2 ,张 鑫2 ,李冬梅2 *
( 1 河南中医学院,河南 郑州 450008; 2 河南省中药开发工程技术研究中心, 河南 郑州 450008)
摘 要:目的 研究卷柏提取部位 ( A、B、C、D) 对去卵巢大鼠血清雌二醇水平及骨代谢生化指标的影响, 并初步探
讨其作用机制。方法 采用 6 月龄雌性 Wistar 大鼠 70 只, 按体质量随机分为假手术组、模型组、阳性对照组和 4
个卷柏不同提取部位用药组,每组 10 只。除假手术组外, 其余各组切除双侧卵巢建立模型。手术 1 周后开始给
药,连续给药 26 周后处死大鼠。用放射免疫法检测雌二醇 ( E2 )、肿瘤坏死因子 ( T NF )、血清骨钙素 ( BGP )、降
钙素 ( CT ) 水平,用常规生化法检测血清碱性磷酸酶 ( ALP )、抗酒石酸酸性磷酸酶 ( T RAP) 活性。结果 大鼠去
除卵巢以后, E2、CT 水平明显降低, ALP、T RAP、BGP、T NF 水平明显升高。给药 26 周后,用药组 ALP、T RAP、
BGP、T NF 水平比模型组明显降低 ( P< 0 01) ; E2、CT 水平明显升高 ( P < 0 01)。结论 卷柏提取物对去卵巢
大鼠骨代谢有一定的调节作用,能够提高血清雌激素水平,提示卷柏提取物对骨质疏松症有一定预防和治疗作用。
关键词:卷柏; 去卵巢; 雌二醇; 骨代谢; 骨质疏松症
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2010) 10 1686 04
卷柏为蕨类卷柏科 ( Selaginellaceae) 植物卷柏
Selag inel la tamar iscina ( Beauv. ) Spring 的全草,
为多年生草本植物, 又名长生不死草、九死还魂草、
石莲花、万年青 [ 1]。卷柏为传统中药,早在)本经∗中
已有记载,将其列为上品,述其&主治五脏邪气,女子
阴中寒热痛, 癥瘕血闭绝子。(卷柏和垫状卷柏 S.
pulv inata ( Hook. et Gr ev. ) M ax im. 一直被)中国
药典∗(一部)收载,作为卷柏的药材使用。
本实验室前期对卷柏化学成分进行了全面系统
的研究,从中分离得到大量的黄酮类、木脂素类、核
苷类和其他多酚类化合物成分 [ 28] ,并对其药理活性
进行了初步的研究。在前期实验中发现, 卷柏提取
物能增加性未成熟小鼠子宫系数,可使小鼠子宫质
量增加,具有雌激素样作用[ 910]。去卵巢大鼠所引
起的生物学上的变化与妇女绝经后生理上改变相
似,主要是由于体内雌激素水平下降而引起骨质疏
松[ 11]。本实验选用去卵巢大鼠模型, 探讨卷柏提取
物长期作用对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响, 为卷
柏抗骨质疏松有效成分的活性筛选及其机制的研究
提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1 1 实验动物:雌性 Wistar 大鼠 70 只, 6月龄,平
均体质量 200~ 220 g (郑州大学河南省动物实验中
心,合格证号:豫 20080013) , 实验期间在二级动物
房喂养,环境温度为 ( 25 % 1) ∀ 。
1 2 药物制备:卷柏购自本草国药堂责任有限公司
(批号 20080321) , 经河南中医学院陈随清教授、董
诚明教授鉴定为卷柏属植物卷柏 S . tamar iscina
( Beauv. ) Spring。卷柏干燥全草 8 98 kg , 80% 乙
醇回流提取 2次, 每次 2 h, 合并滤液, 减压干燥,得
到 A ( 350 1 g, 总部位) , 然后上聚酰胺柱, 用水和
不同体积分数乙醇梯度洗脱,得到 B ( 100 8 g, 水部
位)、C ( 66 34 g , 50% 乙醇部位)、D ( 86 06 g, 80%
乙醇部位) 4个部位。
1 3 主要试剂和仪器: 尼尔雌醇片 ( Tabellae
Nilest rioli) , 1 mg /片 (上海华联,批号 071103) ;碱
性磷酸酶 ( ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶 ( TRAP)
试剂盒 (南京建成生物工程研究所生产) ; 雌二醇
#1686# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100116 基金项目: & 重大新药创制(国家科技重大专项 ( 2009ZX09103440) ; 重大公益性科研招标项目 ( 08110091800)作者简介:郑晓珂( 1962 ) ,女,博士,教授,硕士生导师,主要从事中药活性成分及其作用机制研究。
T el : ( 0371) 65575963 Email: zh engxk . 2006@ yahoo. com. cn