全 文 ：寒凉药对热证大鼠肝线粒体蛋白质组的影响
李毅，卢德赵，唐利华，沃兴德，杨贞
（浙江中医药大学 生命科学学院，浙江 杭州 ３１００５３）
［摘要］ 自２０世纪６０年代起，现代科学开始对热证的本质进行研究，但有关热证的病理机制和寒凉药物的作用机制等
尚未深入系统研究。该研究以具有代表性的热性中药喂饲动物造成热证模型，后用寒凉药进行实验性治疗，拟采用双向电泳
及质谱分析技术对热证模型大鼠及寒凉药治疗后的大鼠肝线粒体蛋白组进行比较，从中发现热证及寒凉药治疗后的特异性
相关蛋白质。
［关键词］ 寒凉药；热证；线粒体；蛋白质组
［收稿日期］ ２０１３０６１８
［基金项目］ 浙江省中医药管理局重点项目（２００６Ｚ００２）；浙江省中
医药管理局项目（２００７ＣＢ１３９）
［通信作者］ 杨贞，Ｔｅｌ：（０５７１）８６６１３６２６，Ｅｍａｉｌ：ｍｓｙａｎｇｚｈｅｎ＠
１６３ｃｏｍ
寒热是用以概括机体阴阳盛衰的两类证候。祖
国医学认为“阳胜则外热”、“阴虚则内热”，在临床
上热证主要表现为：恶热喜冷，烦躁不安，口眼干燥，
面红目赤，咳痰黄稠，舌红脉数等，综合起来以基础
代谢率偏高，机体能量过剩为特征。热证的形成机
理有很多，中医古籍《黄帝内经》等对其病因均有介
绍，自２０世纪６０年代起，现代科学开始对热证的本
质进行研究，然而目前有关热证的病理机制和寒凉
药物的作用机制等，尚未深入系统研究［１］。
肝脏是人体重要的代谢器官，肝细胞中的线粒
体则是重要的细胞器，是细胞呼吸链和氧化磷酸化
的中心，在能量代谢中发挥着重要的作用。本研究
以具有代表性的热性中药喂饲动物造成热证模型，
后用寒凉药进行实验性治疗，拟采用双向电泳及质
谱分析技术对热证模型大鼠及寒凉药治疗后的大鼠
肝线粒体蛋白组进行比较，从中发现热证及寒凉药
治疗后的特异性相关蛋白质，在线粒体蛋白质组水
平阐述中医热证能量代谢障碍的内在物质基础及寒
凉药的作用机制，进而指导中医的临床诊断与治疗。
１ 材料与方法
１１ 药材与试剂 所有中药均采购于杭州方回春
堂药店。温热药以附子、干姜、肉桂按１∶１∶１比例，
常规煎２次，合并浓缩至 １ｇ·ｍＬ－１；寒凉药以黄
芩、黄连、黄柏按１∶１∶１比例，常规煎２次，合并浓缩
至１ｇ·ｍＬ－１。双向电泳相关试剂均购自 ＢｉｏＲａｄ
公司，酶解试剂均购自Ｓｉｇｍａ公司。
１２ 动物分组及造模 清洁级 ＳＤ雄性大鼠 １８
只，体重１８０～２２０ｇ，购自浙江大学动物实验中心，
随机分为正常对照组、热证模型组和药物治疗组。
参照徐志伟等［２］的实验方法，正常对照组动物正常
饮食，每鼠每日灌喂生理盐水４ｍＬ，共４周；热证模
型组每鼠每日灌以温热药４ｍＬ（约含４ｇ生药），造
模２周后继续每鼠每日４ｍＬ生理盐水灌胃２周；药
物治疗组为造模２周后每鼠每日继续灌以寒凉药４
ｍＬ（约含４ｇ生药）２周。
１３ 常规生理指标检测 ４周后开始分别测定３
组大鼠体重增长值，２４ｈ尿量，饮水量和饮食量，并
测定肛温。
１４ 血清激素含量测定 ４周后采用眼眶后静脉
丛取血法。每组每只大鼠采血３～４ｍＬ，分离出血
清，运用双抗体夹心化学发光两步法检测血清 Ｔ３，
Ｔ４含量；应用固相竞争化学发光酶免疫分析法测定
睾酮含量。
１５ 大鼠线粒体蛋白质提取及差异蛋白质分析 ４
周后处死大鼠，取肝脏匀浆，按文献方法提取肝脏线
粒体蛋白质［３４］，进行双向电泳，每组重复３次。经
ＵＭＡＸＩｍａｇｅＳｃａｎｎｅｒ凝胶扫描仪扫描图谱，运用Ｉｍ
ａｇｅＭａｓｔｅｒ软件分别进行两两比较。分别取 ２组间
相互匹配且具有明显表达差异（Ｖａｒｉａｔｉｏｎ＞２０，Ｐ＜
００５）的蛋白质进行酶解及质谱鉴定。
２ 结果
２１ 常规生理指标观察 热证大鼠体消瘦，烦躁、
多动，口渴喜饮，厌食，皮毛干燥无光泽，竖毛易掉
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落，灌药时挣扎较明显，尿液少且颜色明显红赤，大
便干硬。经寒凉药治疗后大鼠各项症状、体征均有
明显改善，见表１。
与对照组大鼠比较，模型组大鼠饮食及体重
表１ 各组大鼠代谢指标的测定（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ｔａｂｌｅ１ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｉｎｄｅｘｅｓｉｎｒａｔｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别 体重 ２４ｈ饮食量／ｇ ２４ｈ饮水量／ｍＬ ２４ｈ尿量／ｍＬ 肛温／℃
对照 ３５３３±３１４ １４５８±２１７ ２００８±２３３ ９５０±１５２ ３８１３±０２４
模型 ２２１７±３６６２） １２０８±１９３１） ２５１７±２９８１） ７３３±１３７ ３８３７±０２１
治疗 ２９５０±４１４３） １４１７±２７９３） ２１００±１９２３） ８４２±１５３ ３８１８±０１７
注：与对照组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１；与模型组比较３）Ｐ＜００５，４）Ｐ＜００１（表２同）。
显著下降，饮水量显著增加，尿量及肛温无明显改
变，使用寒凉药治疗后大鼠饮食及体重显著增加，饮
水量显著下降，其余指标未明显改变。
２２ 激素水平变化 甲状腺激素在体内的主要作
用是促进组织氧化及产热，使机体能量代谢维持一
定水平，从而稳定体温［５］。中医认为：阳盛则热，与
对照组比较，模型组大鼠血清 Ｔ３，Ｔ４明显升高；在
经过寒凉药治疗后血清 Ｔ３，Ｔ４显著降低。睾酮可
使血循环增加，增加促血红素生成，提高血红蛋白含
量，符合热证特征，为构成热证的因素之一［６］。与
对照组比较，模型组大鼠血清睾酮含量显著升高，而
寒凉药治疗后显著降低，见表２。
表２ 各组大鼠血清激素水平的测定（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ｔａｂｌｅ２ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅｒｕｍｈｏｒｍｏｎｅｉｎｒａｔｓ（珋ｘ±ｓ，
ｎ＝６） ｎｍｏｌ·Ｌ－１
组别 Ｔ３ Ｔ４ 睾酮
对照 ０８７±０１６ ３２６２±２０２ １５８３±４３７
模型 １３３±０２８１） ３６５８±２０９１） １８１５±２５０１）
治疗 ０９２±０１２３） ３３０６±１８３４） １５４３±１２７３）
２３ 大鼠肝脏线粒体蛋白质组学分析 经图谱分
析，见图１，对照组３块凝胶的平均蛋白质点为９６２
个，模型组３块凝胶的平均蛋白质点为８１６个，寒药
治疗组６块凝胶的平均蛋白质点为９９３个。分别进
行两两比较，与对照组相比，热证模型组有１２个蛋
白质表达显著改变，见表３；与模型组相比，寒药治
疗组有１７个蛋白质表达显著改变，见表４。
３ 分析与讨论
３１ 热证治疗前后糖、脂肪、蛋白质代谢的变化
热证大鼠中与糖和蛋白质代谢降低，主要表现为与
Ａ对照组；Ｂ模型组；Ｃ寒药治疗组。
图１ 大鼠肝线粒体蛋白质的双向电泳图谱（ｐＨ３～１０，２４
ｃｍ，ＮＬ）
Ｆｉｇ１ Ｔｈｅｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｔｈｒｅｅ
ｇｒｏｕｐｓｏｆｒａｔｌｉｖｅｒｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ
糖代谢有关的乙醛脱氢酶和与蛋白质代谢有关的异
戊酰辅酶Ａ脱氢酶（反映人体内亮氨酸代谢情况）
和３巯基丙酮酸硫基转移酶（反映人体内胱氨酸代
谢情况）表达降低，该抑制可能由于内热引起的糖
和蛋白质代谢过盛引起的反馈抑制。
寒凉药不影响热证大鼠的糖和蛋白质代谢，但
大鼠脂代谢增强，表现在与糖代谢相关的二氢硫辛
酰胺酰基转移酶（是丙酮酸脱氢酶系和 α酮戊二酸
脱氢酶系中的一个关键酶）和３羟酰基辅酶 Ａ脱
氢酶降低，此外，与蛋白质代谢相关的氨甲酰磷酸合
成酶和核糖体蛋白 Ｌ１２降低，而与脂肪代谢相关的
３羟基异丁酸脱氢酶、异戊酰辅酶Ａ脱氢酶、烯酰辅
酶Ａ水解酶，线粒体内膜移位酶表达均升高。说明
寒凉药能抑制糖和蛋白质的过度消耗，却能增加脂
肪的代谢，通过这种调节方式使机体从热证状态下
恢复过来，以维持正常的人体生理功能。
３２ 热证治疗前后能量代谢的变化 能量代谢非
常复杂并涉及到氧化磷酸化过程中的许多酶和因
子，而这些酶和因子起着网络调控作用，目前对它代
谢中的复杂代谢途径及通路了解尚少［７８］。在经过
寒凉药治疗后，电子传递黄素蛋白和 ＡＴＰ合酶 β亚
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表３ 热证模型组与对照组之间差异蛋白质质谱鉴定结果分析
Ｔａｂｌｅ３ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｏｍｉｃｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｈｅａｔｓｙｎｄｒｏｍｅｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ
蛋白质名称 相对分子质量／Ｄａ 等电点 表达差异
应激反应蛋白 热休克蛋白７０ ７３４１５６ ５８１ ３１↑
热休克蛋白６０ ６０９２７４ ５９１ ３４↑
热休克蛋白蛋白１２ １４２９４６ ７７９ ２４↑
伴侣素ｇｒｏＥＬ前体 ６０９０３４ ５９１ ２２↑
葡萄糖调节蛋白５８ｋＤ ５６５５３７ ５８８ ２１↑
能量代谢 Ｈ＋转运ＡＴＰ合酶 １２４８６６ ９４３ ２１↑
糖、脂肪、蛋白质代谢 乙醛脱氢酶 ５４２９９４ ５８３ ２２↓
３巯基丙酮酸硫基转移酶 ３２９１９４ ５８８ ２５↓
异戊酰辅酶Ａ脱氢酶 ４６４０５８ ８０３ ２６↓
其他蛋白 ３甲基２氧桥丁酸脱氢酶 ５０１３２９ ７６８ ３０↓
甲状腺素转运蛋白 １３０６４５ ６０４ ２２↑
Ｃｕｔｌ１蛋白 ７６２０６３ ５３２ ２８↑
注：↑，↓均表示相对于对照组，热证模型组该蛋白表达下降或升高的倍数。
表４ 治疗组与热证模型组之间差异蛋白质的质谱鉴定结果
Ｔａｂｌｅ４ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｏｍｉｃｂｅｔｗｅｅｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐａｎｄｈｅａｔｓｙｎｄｒｏｍｅｇｒｏｕｐ
蛋白质名称 相对分子质量／Ｄａ 等电点 表达差异
应激反应蛋白 热休克蛋白１２ １４２９４６ ７７９ ３７↓
Ｅｒｐ２９ ２８５５６９ ６２３ ２６↓
能量代谢 ＡＴＰ合酶β亚单位 ５１１７０６ ４９２ ３４↑
电子转移黄素蛋白 ３５０１７５ ８６２ ２７↑
Ｈ＋转运ＡＴＰ合酶 ２５６３９４ ７０３ ２１↓
糖、脂肪、蛋白质代谢 二氢硫辛酰胺酰基转移酶 ５３４２５１ ８７１ ３７↓
３羟基异丁酸脱氢酶 ３５２７９６ ８７３ ２８↑
异戊酰辅酶Ａ脱氢酶 ４６４０５８ ８０３ ２４↑
烯酰辅酶Ａ水解酶１Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ过氧物酶体 ２３６５１ ５２０ ５２↑
烯酰基辅酶Ａ水解酶辛酰基辅酶Ａ复合物Ｆ链 ２８２６９５ ６４１ ３２↑
３羟酰基辅酶Ａ脱氢酶 ２７０９７５ ８９１ ３８↓
氨甲酰磷酸合成酶 １６４４７５５ ６３３ ２１↓
核糖体蛋白Ｌ１２ ２１６９９ ９１４ ３７↓
线粒体内膜移位酶 １０３３７２ ６７１ ３０↑
其他蛋白 谷胱甘肽过氧化物酶 ２２２４４４ ７６６ ５４↓
孕酮结合蛋白 ２１５８４７ ４４５ ６０↑
血红素结合蛋白１ ２１１１０４ ５３３ ３３↓
注：↑，↓均表示相对于热证模型组，药物治疗组该蛋白表达下降或升高的倍数。
单位表达升高，电子传递黄素蛋白是呼吸链的组成
成分［９］，ＡＴＰ合酶 β亚单位存在于线粒体内膜［１０］，
是ＡＴＰ合酶的催化亚基，二者的表达升高说明寒凉
药物能够恢复细胞内的能量代谢，减少应激反应。
Ｈ＋转运ＡＴＰ合酶是催化线粒体ＡＴＰ生成的关
键酶［１１］，热证大鼠肝脏线粒体 Ｈ＋转运 ＡＴＰ合酶表
达升高，经寒凉药治疗后 Ｈ＋转运 ＡＴＰ合酶表达降
低，说明Ｈ＋转运ＡＴＰ合酶可作为判断寒证、热证疾
病发生和痊愈的指标之一。
３３ 热证治疗前后应激反应蛋白的变化 动物应
用温热药造模后，热证大鼠代谢紊乱，热休克蛋白
６０、热休克蛋白７０、热休克蛋白１２、伴侣素 ｇｒｏＥＬ前
体（参与蛋白质折叠）和葡萄糖调节蛋白５８ｋＤａ均
升高，机体应激反应强烈。寒凉药治疗后，热休克蛋
白６０和伴侣素ｇｒｏＥＬ前体的表达下降，谷胱甘肽过
氧化物酶表达降低，提示寒凉药使热证缓解，机体的
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能量代谢水平下降，机体细胞过氧化状态得到改善，
因此参与清除过氧化物的谷胱甘肽过氧化物酶表达
也降低［１２］，细胞线粒体稳定性增加。
３４ 热证治疗前后其他相关蛋白的变化 用温热
药造成热证动物出现甲状腺素转运蛋白表达增加，
可能是温热药具有促进甲状腺素合成的功能，并能
使甲状腺素转运蛋白含量升高，甲状腺激素经甲状
腺激素转运蛋白流经全身，引起热证动物表现为能
量代谢增高的一系列症候。
热证动物经寒凉药治疗后还能使血红素结合蛋
白１和线粒体内膜移位酶表达均降低，而孕酮结合
蛋白表达升高，其作用机制有待进一步研究。
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ｒａｔｓｗｉｔｈｈｅａｔｓｙｍｐｔｏｍ
ＬＩＹｉ，ＬＵＤｅｚｈａｏ，ＴＡＮＧＬｉｈｕａ，ＷＯＸｉｎｇｄｅ，ＹＡＮＧＺｈｅｎ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｉｎｔｈｅ１９６０ｓ，ｍｏｄｅｒｎｓｃｉｅｎｃｅｂｅｇａｎｉｎｖｏｌｖｉｎｇｔｈｅｅｓｓｅｎｃｅｏｆｈｅａｔｓｙｎｄｒｏｍｅ，ｂｕｔｔｈｅｒｅｈａｖｅｓｔｉｌｎｏｉｎｄｅｐｔｈｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓｏｎｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｈｅａｔｓｙｎｄｒｏｍｅａｎｄａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃｏｌｄａｎｄｃｏｏｌｈｅｒｂｓＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅａｎｉｍａｌ
ｍｏｄｅｌｗｉｔｈｈｅａｔｓｙｎｄｒｏｍｅｗａｓｓｅｔｕｐｂｙｆｅｅｄｉｎｇｈｅｒｂｓｗｉｔｈｈｏｔｐｒｏｐｅｒｔｙ，ａｎｄｔｈｅｎｃｏｌｄａｎｄｃｏｏｌｈｅｒｂｓｗａｓａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｔｈｅｒａｐｙＴｈｅｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎｄｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｗｅｒｅａｄｏｐｔｅｄｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｌｉｖｅｒｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｐｒｏ
ｔｅｏｍｅｏｆｔｈｅｒａｔｓｏｆｔｈｅｈｅａｔｓｙｎｄｒｏｍｅｍｏｄｅｌａｎｄｔｈｅｏｎｅｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｃｏｌｄａｎｄｃｏｏｌｈｅｒｂｓ，ｓｏａｓｔｏｄｉｓｃｏｖｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ
ａｆｔｅｒｈｅａｔｓｙｎｄｒｏｍｅａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｃｏｌｄａｎｄｃｏｏｌｈｅｒｂｓ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｃｏｌｄａｎｄｃｏｏｌｈｅｒｂｓ；ｈｅａｔｓｙｍｐｔｏｍ；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ；ｐｒｏｔｅｏｍｅ
ｄｏｉ：１０．４２６８／ｃｊｃｍｍ２０１３２３３１
［责任编辑 张宁宁］
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