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Dynamic change of phenolic acids in soils around rhizosphere of  replanted Rehmannia glutinosa

连作地黄根际土壤中酚酸类物质的动态变化


目的:通过对正茬和重茬地黄进行大田生物测试,并检测土壤中的一元酚酸类物质,为缓解地黄化感自毒作用和消减连作障碍提供理论依据。方法:采用HPLC检测不同生育时期的正茬和重茬地黄根际土壤中与化感现象密切相关的5种酚酸(阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香豆酸和丁香酸)。结果:正茬地黄生长健壮。收获时,正茬地黄的块根干重和体积分别为重茬地黄的6.02,7.71倍。结论:苗期和伸长期是连作地黄自毒作用发生的关键时期,此时期,重茬地黄土壤中阿魏酸、香豆酸、丁香酸和对羟基苯甲酸的含量和重茬地黄叶片、块根的生长有较强的反比关系,其中阿魏酸对重茬地黄的抑制作用占主要方面。

Objective: To determine 5 phenolic acids in the soils around rhizosphere of Rehmannia glutinosa in the field under normal rotation and successive cropping. Method: Phenolic acids related to allelopathy effect in the soils around rhizosphere of R. glutinosa were determined by HPLC. Result: The growth of R. glutinosa under normal rotation was strong. During harvest, the dry weight of the root tube and the volume of the R. glutinosa under normal rotation were 6.02 and 7.71 times of the ones under successive cropping. Conclusion: The seeding stage and elongating stage are the crucial periods for the autotoxic effect of the R. glutinosa under continuous cropping. During these periods, the content of coumaric acid, 4-hydroxybenzoic acid, syringic acid, and ferulic acid of R. glutinosa under successive cropping are notably negative correlation with the growth of the leaf and root tuber of R. glutinosa under successive cropping. Among them, ferulic acid plays a major role in the restriction effect on R. glutinosa under successive cropping.


全 文 :连作地黄根际土壤中酚酸类物质的动态变化
杜家方1,尹文佳1,李 娟1,张重义1,2
(1.河南农业大学 中药材研究所,河南 郑州 450002;
2.福建农林大学 农业生态研究所,福建 福州 350002)
[摘要] 目的:通过对正茬和重茬地黄进行大田生物测试,并检测土壤中的一元酚酸类物质,为缓解地黄化感自毒作用
和消减连作障碍提供理论依据。方法:采用HPLC检测不同生育时期的正茬和重茬地黄根际土壤中与化感现象密切相关的5
种酚酸(阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香豆酸和丁香酸)。结果:正茬地黄生长健壮。收获时,正茬地黄的块根干重和体积
分别为重茬地黄的602,771倍。结论:苗期和伸长期是连作地黄自毒作用发生的关键时期,此时期,重茬地黄土壤中阿魏
酸、香豆酸、丁香酸和对羟基苯甲酸的含量和重茬地黄叶片、块根的生长有较强的反比关系,其中阿魏酸对重茬地黄的抑制作
用占主要方面。
[关键词] 连作障碍;根际土壤;化感;酚酸
[收稿日期] 20080715
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30772729);国家“十一五”科
技支撑计划项目(2006038077028XX)
[通信作者] 张重义,Tel:(0371)63555721,Email:hauzzy@163.
com
  地黄 RehmanniaglutinosaLibosch.为玄参科多
年生草本植物,以干燥块根入药。鲜地黄清热生津,
凉血,止血;生地黄清热凉血,养阴,生津;熟地黄滋
阴补血,益精填髓[1]。怀地黄因主产于古“怀庆府”
(今河南焦作)一带而得名,是我国著名的“四大怀
药”之一,为我国传统大宗地道中药材,一直被视为
药材中的上品[23],目前河南省焦作地区年种植面积
均在12万hm2以上,总产值达到数10亿元。
地黄是已知块根类药材中连作障碍最严重的
药用植物,连作障碍突出表现为块根不能膨大,多
须根,每茬收获后需隔 8~10年方可再植[4]。对
地黄的研究结果表明,化感自毒作用是地黄连作
障碍的主要原因[56],国内外关于化感自毒作用的
研究多集中在水稻,大豆,黄瓜等作物,而地黄的
根际微生态环境研究较少。试验表明引起连作障
碍的化感物质众多,酚酸类物质是目前研究最多、
活性较强的一类化感物质,大量试验表明,酚酸类
物质影响植物的膜系统、光合作用、酶活性、土壤
微生物活性以及内源激素,对植物生长产生抑制
作用,研究者均把酚酸类物质作为化感自毒作用
研究的重点,已成为公认的化感物质[712],其中香
草酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、香豆酸和阿魏酸是
文献中经常报道的几种一元酚酸类化感物
质[1317]。本实验通过对不同生育时期的重茬地黄
根际土壤进行生物测试,并通过 HPLC检测了地黄
根际土中与化感现象相关的 5种酚酸,旨在为缓
解地黄化感自毒作用和消减连作障碍、提高其产
量和质量提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 生物测试
试验点设在河南省温县农业科学研究所。供试
品种为“温855”,“芦头”(块根繁殖材料,种栽)由
温县农业科学研究所提供,经河南农业大学高致明
教授鉴定为R.glutinosa。
常规整地施肥,按照株距20cm、行距30cm,于
2007年4月25日种植重茬地黄,并设正茬地黄作
为对照。地黄出苗后70d开始采样,每隔25d采1
次,每次取10~15株,共6次,并取其根际土壤(地
黄取出后,小心抖落大块土壤,最后附着在根上的少
量土壤,用软毛刷刷下来);测量叶片鲜重、干重,块
根鲜重、干重,块根体积。数据采用SPSS130处理
软件进行统计分析。
1.2 HPLC检测
1.2.1 仪器和试剂 Waters2695高效液相色谱
仪,Waters2487可变波长检测器(美国 Waters公
司);Empower色谱数据工作站;高纯水制备仪
(MiliQ,Milipore)。阿魏酸、香草酸、对羟基苯甲
酸、香豆酸、丁香酸均购自 ACROS公司。流动相使
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用的甲醇为色谱醇。液相色谱用水为高纯水,所有
流动相均过022μm微孔滤膜。
1.2.2 溶液配制 称取对羟基苯甲酸258mg,香
草酸258mg,丁香酸107mg,香豆酸218mg,阿
魏酸229mg,分别置于100mL量瓶中,先用少量
甲醇溶解,后用高纯水定容,作为单一标样的母液,
并将其稀释100倍作为单一标样工作液。
称取对羟基苯甲酸252mg,香草酸278mg,
丁香酸113mg,香豆酸 198mg,阿魏酸 221mg
置于同一100mL量瓶中,先用少量甲醇溶解,后用
高纯水定容,作为混合标样的母液,并将其稀释100
倍作为混合标样工作液。
测试土(不同时期的正茬重茬根际土)阴凉处
风干,破碎后过40目筛。称取土样125g,量取蒸馏
水500mL加入2个烧杯中,充分搅拌振荡后静置
24h,取上清液置于50℃旋转蒸发仪蒸发至干,然
后加高纯水定容至25mL,进样前过022μm微孔
滤膜作为土壤进样品。
1.2.3 色谱条件 分离柱采用 AglientXDBC18柱
(46mm×250mm,5μm),检测波长280nm,柱温
35℃,进样量50μL,流动相组为甲醇高纯水(25∶
75),高纯水用冰醋酸调节 pH为26[18],采用 A和
B双泵系统,双泵体积流量10mL·min-1,通过调
整两泵的流速来达到分离5种酚酸的目的。
1.2.4 线性关系考察 量取5个酚酸单一标样2,
4,6,8,10mL于5个10mL量瓶中,加甲醇稀释至
刻度,摇匀。20μL进样,在上述色谱条件下,测定
峰面积,求得回归方程(表1)。
表1 5种酚酸的回归分析(n=5)
酚酸 回归方程 r 线性范围/mg·L-1
香豆酸    Y=1240638X-1142825 099998 000099~007920
对羟基苯甲酸 Y=5002054X-1198438 099277 001255~010040
香草酸    Y=1273211X-1057613 099988 001285~010280
丁香酸    Y=3643169X-1834878 099998 000575~004600
阿魏酸    Y=2285959X-3053587 099997 001105~008840
1.2.5 精密度试验 5个酚酸单一标样连续进样5
次,进样量20μL,记录峰面积,计算相对标准差,香
豆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸的
RSD 分 别 为 088%,051%,026%,092%,
045%。表明5种酚酸的检测精密度良好。
1.2.6 稳定性试验 取供试土壤水提液,每隔2h
进样,共 5次,进样量 20μL。测定峰面积,计算
RSD值为056%。表明供试品溶液在8h内所测得
结果基本一致。
1.2.7 加样回收率试验 从供试样品和标样母液
中吸取同样体积的溶液,混合,20μL进样,对本方
法的回收率进行测定,5次重复,计算平均回收率为
9922%,RSD048%。
2 结果与分析
2.1 不同生育时期地黄植株的形态指标
根据地黄块根的发育情况将地黄整个生育期按
照块根的形态变化分为6个生育时期。在地黄整个
生育期内,正茬地黄的各项形态指标均高于重茬地
黄(表2)。正茬地黄的叶片数、叶干重和叶面积在
地黄膨大前期达到最高值,而重茬地黄的叶片数、叶
干重和叶面积在块根伸长期达到最高值,比正茬地
黄提早25d;正茬地黄的叶片数、叶干重和叶面积最
大值分别为重茬地黄的13,23,46倍。正茬和重
茬地黄的块根干重和块根体积均在收获期达到最高
值,前者为后者的60,77倍;收获时正茬和重茬鲜
地黄产量分别为27500,3700kg·hm-2,前者为后
者的74倍。从地黄整个生育期上看,重茬地黄从
生长前期开始就受到抑制,重茬地黄和正茬地黄的
块根干重、块根体积在苗期的差异已经较大,后者分
别为前者的 73,111倍,但地黄叶片生长区别不
大;从块根伸长期开始,重茬地黄叶片生长开始受到
抑制,正茬地黄的叶片数和叶干重分别为重茬的
13,28倍,此时期正茬地黄的块根干重和块根体
积分别为重茬的96,119倍。
2.2 地黄根际土壤中酚酸类物质的动态变化
在地黄整个生育时期内,正茬和重茬土壤中阿
魏酸、香草酸、香豆酸和丁香酸的含量整体上呈
“⌒”形趋势,而正茬和重茬土壤中对羟基苯甲酸的
含量整体呈现“~”趋势。重茬土壤中阿魏酸、香豆
酸和丁香酸的浓度自地黄生育中后期开始低于正茬
土壤(表3);重茬土壤中对羟基苯甲酸和香草酸的
浓度自地黄生育前期开始低于正茬土壤。重茬土壤
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表2 重茬和正茬地黄各生育时期形态指标比较(珋x±s,n=3)
生育时期 出苗后天数/d 土壤类型 叶片数 叶干重/g 叶面积/cm2 根干重/g 根体积/cm3
苗期     70 正茬 15±114 355±026 8349±713 176±027 100±09
    重茬 15±084 211±011 5781±825 024±007 09±018
块根伸长期  95 正茬 18±112 885±035 26526±1245 1086±114 678±213
    重茬 14±130 322±028 6276±635 113±017 57±040
块根膨大前期 120 正茬 20±114 1116±070 28785±762 1432±077 869±577
    重茬 16±116 282±020 5597±589 097±018 38±104
块根彭大中期 145 正茬 20±158 968±052 16634±1286 1667±218 1041±477
    重茬 14±084 254±036 5113±577 079±006 48±068
块根膨大后期 170 正茬 20±167 746±046 12037±1082 2597±118 1459±517
    重茬 11±131 489±019 4679±572 225±027 74±052
收获期    195 正茬 21±130 487±025 0 2757±208 1650±620
    重茬 10±119 186±033 0 458±045 214±267
  注:正茬为对照,收获时地上部分已经干枯。
中阿魏酸含量自地黄出苗后120d开始低于正茬土
壤中的含量;重茬土壤中对羟基苯甲酸含量自地黄
出苗后70d开始低于正茬土壤中的含量;重茬土壤
中香草酸含量自地黄出苗后开始低于正茬土壤中的
含量;重茬土壤中香豆酸含量自地黄出苗后120d
开始低于正茬土壤中的含量;重茬土壤中丁香酸含
量自地黄出苗后145d开始低于正茬。
3 讨论
表3 重茬和正茬地黄各生育时期根际土壤中酚酸类物质的含量比较(n=3) μg·g-1 
酚酸
土壤
类型
生育时期
播种期 苗期 块根生长期 块根膨大前期 块根膨大中期 块根膨大后期 收获期
阿魏酸    正茬 0D 00100C 00200A 00200A 00133B 0D 00133B
  重茬 00333D 00467B 00400A 00200C 0D 0D 0D
对羟基苯甲酸 正茬 07900D 09200C 10200B 05800E 02870F 01600G 14900A
  重茬 17900A 07000C 04530D 02930E 02470F 01200G 11700B
香草酸    正茬 00333C 00267D 00200E 00400B 00467A 00133F 00133F
  重茬 00133C 00133C 00133C 00200B 00333A 0D 0D
香豆酸    正茬 00133C 00200B 00133C 00200B 00267A 00133C 00133C
  重茬 00200B 00200B 00267A 00200B 00133C 0D 0D
丁香酸    正茬 0C 0B 00067C 0B 00200A 00133C 0C
  重茬 0D 00333A 00067C 00133B 0D 00133B 0D
  注:正茬为对照,进行新复极差分析,大写字母表示001水平的极显著差异。
3.1 地黄根际土壤中酚酸的作用
阮维斌等[18]研究发现香草酸是一种大豆胞囊
线虫性激素,其类似物丁香酸在温室条件下也显著
影响大豆胞囊线虫的密度,土壤中丁香酸和残茬腐
解产物中香草酸等物质的存在可能促进了胞囊线虫
的繁殖,使线虫密度达到危害阈值。实验调查中发
现重茬地黄线虫病发病率较正茬高,影响了地黄的
正常膨大,加剧了地黄的连作障碍,因此可以说明连
作地黄前期土壤中一元酚酸含量较高,导致地黄根
际微环境中线虫群体数量急剧增加,加剧了对地黄
块根膨大的危害。
地黄连作表现为块根不能膨大,多须根。薛建
平[19]研究表明吲哚乙酸(IAA)是引起地黄块根膨
大的主要内源激素之一。IAA是植物体内一种重要
的激素,酶氧化是它的主要降解方式,包括脱羧降解
和不脱羧降解,其中,IAA脱羧降解是被IAA氧化酶
氧化为3亚甲基氧吲哚,放出二氧化碳,而一元酚
酸是吲哚乙酸氧化酶的辅基,其含量高低直接影响
吲哚乙酸氧化酶的活性[2021]。因此可以推测,土壤
中的相对高浓度的酚酸引起地黄根系吸收酚酸较
多,提高了地黄块根中吲哚乙酸氧化酶的活性,氧化
分解了吲哚乙酸,地黄块根的膨大受阻。据此分析
表2,3,在地黄的块根膨大期之前,重茬地黄土壤中
对羟基苯甲酸、阿魏酸、香豆酸和丁香酸的含量均高
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于正茬,其中重茬土壤中阿魏酸含量为正茬的2~5
倍,而在此时期,重茬地黄的叶片、块根等测量指标
远低于正茬,由此可以看出:地黄土壤中酚酸物质的
含量和地黄块根生长之间存在较强的负相关性,阿
魏酸、香豆酸、丁香酸和对羟基苯甲酸在重茬地黄的
生长前期起到一定的抑制作用,其中阿魏酸的抑制
作用较强。
3.2 重茬地黄根际土壤中酚酸类物质含量的动态
变化及其互作效应
各方面的研究都认为[22],药用植物的初生生长
与次生代谢存在一定的平衡关系,有利于初生代谢
的环境条件不利于次生代谢,不利于初生代谢的条
件反而增加次生代谢。地黄生长中前期初生代谢较
缓慢,可能导致酚酸类物质的次生代谢旺盛,而地黄
生长中后期则相反,这可能是土壤中阿魏酸、香草
酸、香豆酸和丁香酸的含量呈现“⌒”形趋势的原因
之一。同时,由于重茬地黄生长缓慢,其化感自毒物
质的分泌也相对较少,应该是造成地黄生长后期重
茬土壤中酚酸含量低于正茬的原因。不同的次生代
谢物质有不同的代谢途径和规律,在不同的土壤环
境中,由于微生物和其他非生物因素的原因,这些规
律又会发生变化,其深层机制有待进一步研究。
研究表明植物化感作用潜力是植物所释放出的
所有化感物质综合作用的结果[23]。Einhelig[24]认
为在田间环境下,植物所释放的化学物质浓度一般
都低于其抑制作用的起始浓度。因此,化感物质间
的互作规律非常重要。研究发现2种酚酸类物质在
浓度水平较低时,物质间的作用是增效;若物质浓度
水平提高,其作用是相互拮抗。对表3和表4的分
析可知,在地黄的生长过程中,前期主要进行叶片的
生长和发育,后期主要是块根的膨大和干物质积累。
因此在重茬地黄的生长中前期,酚酸的作用一方面
通过影响 IAA和根细胞的有丝分裂和伸长[25]从而
影响重茬地黄的根系生长和吸收,另一方面破坏地
黄的光合作用[24]而导致重茬地黄叶片制造光合产
物的能力下降;随着生长中心的转移,重茬地黄自生
长中后期开始进行块根的分化和发育。这个时期酚
酸浓度的变化出现拐点开始下降,但重茬地黄的块
根生长依然受到抑制,根据上述研究结论,酚酸浓度
的降低很可能导致酚酸的互作效应增强,从而抑制
重茬地黄块根的膨大。试验中所检测的5种一元酚
酸类物质都属于苯丙素类化合物中的苯丙酸类,化
学结构十分类似,因此对根系细胞膜的作用位点基
本相同。由于5种酚酸的作用特性不同,对地黄根
系细胞膜的作用力也略有区别,具有更强竞争力的
酚酸往往能够捕获不止一个作用位点(或至少干涉
较近的其他位点)。当在地黄的根系细胞膜周围聚
集了比分子总数更多的开放位点时,酚酸物质间的
作用是增效的(在物质的浓度较低时出现的情况)。
反之,若分子总数比细胞膜的位点更多时,这时具有
更强竞争力的酚酸将能捕获到更多的作用位点,而
竞争力较弱的酚酸捕获到的位点就少,这样由于2
种酚酸化合物的作用效果没有得到充分的表达(在
物质的浓度较高时出现的情况),引起“拮抗作用”。
虽然这解释了酚酸的互作效应影响地黄块根膨大的
机制,但具体到单一的酚酸及其作用临界浓度,还需
要进一步的深入研究。
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Dynamicchangeofphenolicacidsinsoilsaroundrhizosphereof
replantedRehmanniaglutinosa
DUJiafang1,YINWenjia1,LIJuan1,ZHANGZhongyi1,2
(1.InstituteofChineseMedicinalMaterials,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China;
2.InstituteofEcology,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China)
[Abstract] Objective:Todetermine5phenolicacidsinthesoilsaroundrhizosphereofRehmanniaglutinosainthefieldunder
normalrotationandsuccessivecropping.Method:PhenolicacidsrelatedtoalelopathyefectinthesoilsaroundrhizosphereofR.glu
tinosaweredeterminedbyHPLC.Result:ThegrowthofR.glutinosaundernormalrotationwasstrong.Duringharvest,thedryweight
oftheroottubeandthevolumeoftheR.glutinosaundernormalrotationwere6.02and7.71timesoftheonesundersuccessivecrop
ping.Conclusion:TheseedingstageandelongatingstagearethecrucialperiodsfortheautotoxicefectoftheR.glutinosaundercon
tinuouscropping.Duringtheseperiods,thecontentofcoumaricacid,4hydroxybenzoicacid,syringicacid,andferulicacidofR.glu
tinosaundersuccessivecroppingarenotablynegativecorelationwiththegrowthoftheleafandroottuberofR.glutinosaundersucces
sivecropping.Amongthem,ferulicacidplaysamajorroleintherestrictionefectonR.glutinosaundersuccessivecropping.
[Keywords] continuouscroppingobstacles;soilsaroundrhizosphere;alelopathy;phenolicacid
[责任编辑 吕冬梅]
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第34卷第8期
2009年4月
                             
Vol.34,Issue 8
 April,2009