目的:采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术(UPLC/Q TOF MS)对紫花杜鹃中黄酮类成分进行分析和鉴别。方法:用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱,以0.1%甲酸水溶液(A) 甲醇(B)为流动相梯度洗脱,检测波长360 nm,使用ESI离子源,分别在正离子和负离子模式下采集数据。结果:推断出紫花杜鹃中黄酮类化合物7个,分别是杨梅素 3 O β D 葡萄糖苷(1)、杨梅素 3′ O β D 吡喃木糖苷(2)、金丝桃苷(3)、异槲皮苷(4)、广寄生苷(5)、槲皮苷(6)、槲皮素(7)。结论:经过超高效液相色谱的分离,借助Q TOF MS测定的相对分子质量及正负离子信息可以鉴定紫花杜鹃中主要的黄酮类成分,为其成分鉴定提供了1种准确有效的方法。
Objective: To investigate the flavonoids in Rhododendron mariae. Method: The constituents in R. mariae were determined by UPLC/Q TOF MS. The chromatographic separation was performed on a C18 column (2.1 mm×50 mm, 1.7 μm) with a gradient elufion of methanol water containing 0.1% formic acid. The mass specfrometer eqaipped with elecfrospay ionizafion source was usedas defecfor and operated in data was collected under the positive and negative ion modes. Result: Seven constituents were identified as myricetin 3 O β D gluconside (1), myricetin 3′ O β D xylopyraoside (2), hyperoside (3), isoquercitrin (4), avicularin (5), quercitroside (6) and quercetin (7). Conclusion: In this study, the main flavonoids in R. mariae were separated by UPLC, and identified through the information of positive ion and negative ion and relative molecular mass which were determined by Q TOF MS. It is an accurate and effective method which can be applied for the constituent identification of R. mariae.
全 文 :紫花杜鹃中黄酮类成分的 UPLC/QTOFMS分析
黄辉强,冯毅凡,芮 雯,姜苗苗,韩 亮
(广东药学院 中心实验室,广东 广州 510006)
[摘要] 目的:采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术(UPLC/QTOFMS)对紫花杜鹃中黄酮类成
分进行分析和鉴别。方法:用ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱,以01%甲酸水溶液(A)甲醇(B)为流动相梯度洗脱,检测波
长360nm,使用ESI离子源,分别在正离子和负离子模式下采集数据。结果:推断出紫花杜鹃中黄酮类化合物7个,分别是杨
梅素3OβD葡萄糖苷(1)、杨梅素3′OβD吡喃木糖苷(2)、金丝桃苷(3)、异槲皮苷(4)、广寄生苷(5)、槲皮苷(6)、槲皮素
(7)。结论:经过超高效液相色谱的分离,借助QTOFMS测定的相对分子质量及正负离子信息可以鉴定紫花杜鹃中主要的
黄酮类成分,为其成分鉴定提供了1种准确有效的方法。
[关键词] 紫花杜鹃;黄酮;UPLC/QTOFMS
[收稿日期] 20081208
[基金项目] 广州市科学技术局资金项目(2007Z3E5171)
[通信作者] 冯毅凡,男,教授,硕士研究生导师,从事中药新剂型
及质量控制研究,Tel:(020)39352522,Email:yfeng@139.com
[作者简介] 黄辉强,在读硕士研究生,Email:hhqwxh@163.com
紫花杜鹃为杜鹃花科植物紫花杜鹃 Rhododen
dronmariaeHance的干燥叶或带叶嫩枝[1]。味微
辛,性微温,具有止咳、祛痰功能,临床上用于慢性气
管炎,咳嗽痰多等症。据文献报道紫花杜鹃中的化
学成分有挥发油、黄酮类、三萜类等,其中发挥止咳
祛痰作用的活性物质为黄酮类成分,包括槲皮素、槲
皮苷、金丝桃苷等10余种成分[2]。
由于《中国药典》及卫生部颁布的中药标准均
无紫花杜鹃药材的鉴别及含量测定方法[3],使得市
售紫花杜鹃的品种混乱,质量千差万别,从而影响了
紫花杜鹃的有效利用。UPLC/QTOFMS技术是目
前科学研究中应用较好的定性测定方法,UPLC是
较先进的液相色谱技术,具有超高压、超高灵敏度、
超高分离度等特点,QTOFMS是高分辨串联质谱,
其显著特点是灵敏度高和选择性强,得到的质谱图
数据完整且品质高,可以测得化合物准确分子质量。
该实验通过UPLC/QTOFMS对紫花杜鹃中黄酮类
成分进行快速分析,为中药的质量评价及研究提供
有价值的参考。
1 仪器和试药
美国 WatersACQUITYUPLC/QTOFMS系统,
采用电喷雾电离(ESI),二元高压泵、在线脱气装
置、自动进样器、柱温箱和 TUV检测器。数据采集
与处理采用 Masslynx41软件。甲醇为色谱纯(美
国,TEDIA公司),甲酸为色谱纯(美国,DIMA公
司),水为超纯水器所制(德国,Sartorius公司)。
金丝桃苷(批号111521200303)、异槲皮苷(批
号 111538200403)、槲皮素对照品(批号 0081
9304),均购自中国药品生物制品检定所。紫花杜
鹃药材采自广西以及广东的罗定、清远、高要等地,
经广东药学院生药学教研室鉴定为紫花杜鹃 R.
mariae的干燥叶和带叶嫩枝。
2 方法
2.1 供试品溶液的制备 取紫花杜鹃药材粉碎过
24目筛,称取 1g粗粉于锥形瓶中,加入甲醇 25
mL,加热回流提取30min,放置室温过滤,过 022
μm微孔滤膜,即得。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取金丝桃苷对照
品1005mg、异槲皮苷对照品1005mg、槲皮素对
照品1019mg,加甲醇分别配成为 5025,5025,
2038μg·L-1的对照品溶液。
2.3 色谱条件 WatersSUNFIREC18色谱柱(46
mm×200mm,5μm)。流动相 01%甲酸水溶液
(A)甲醇(B);梯度洗脱,0~34min,30% B;34~36
min,30%~35% B;36~50min,35% B;50~52min,
35% ~45% B;52~75min,45% B。进样量为 10
μL,流速为10mL·min-1;检测波长360nm;柱温
30℃。
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WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(21
mm×50mm,17μm),流动相 01%甲酸水溶液
(A)甲醇(B);梯度洗脱,0~1min,20% B;1~5
min,20% ~30% B;5~6min,30% B;6~62min,
30%~35% B;62~8min,35% B;8~105min,
35%~45% B;105~12min,45% B;12~125min,
45%~20% B。进样量为 2μL,流速为 03mL·
min-1;检测波长360nm;柱温30℃。
2.4 质谱条件 LCMS系统使用ESI离子源,在正
离子模式与负离子模式下分别采集数据。数据采集
范围 m/z150~500。离子源参数 ESI:Samplecone
30V,气化室温度350℃,离子源温度100℃,雾化
气(N2)体积流量50L·h
-1,脱溶剂气(N2)体积
流量500L·h-1。
LockMass为5羟基7(4羟基3甲氧苯基)1
苯3庚酮,[M+H]+3291753,[M-H]-3271596。
3 结果
以01%甲酸水溶液甲醇为流动相进行线性梯
度洗脱,UPLC和 HPLC均可得到较好的分离效果,
见图1。紫花杜鹃中的黄酮类化合物极性相对较大
且具热不稳定性,因此使用ESI离子源;其分子中的
羟基容易形成稳定的氧负离子,故用负离子模式检
测所得总离子流图(TIC)有较好的信噪比。质谱
正、负离子模式的总离子流图与360nm波长下紫外
色谱图基本吻合,但总离子流图的基线噪声较大。
随后又对紫外色谱图中出现的色谱峰分别进行正、
负离子的二级质谱的研究。
A.紫花杜鹃样品HPLCUV图;B.紫花杜鹃样品UPLCUV图;
C1.正离子模式下紫花杜鹃样品总离子流图(TIC);
C2.负离子模式下紫花杜鹃样品总离子流图(TIC)。
图1 紫外波长检测的色谱图和质谱总离子流图
根据正、负离子模式的一级质谱的分子离子峰
得到化合物的准确分子量,计算出其元素组成,结果
见表1。
表1 紫花杜鹃中黄酮类成分的准确分子量
No. tR/min 测定值/m/z 分子式 理论值/m/z 误差
1 508 4810965 C21H20O13 4810982 35
2 621 4510855 C20H18O12 4510877 48
3 690 4651048 C21H20O12 4651033 32
4 714 4651010 C21H20O12 4651033 49
5 840 4350946 C20H18O11 4350927 43
6 880 4491067 C21H20O11 4491084 38
7 1087 3030510 C15H10O7 3030505 16
注:离子模式[M+H]+。
再由正、负离子的二级质谱中碎片信息,结合文
献,对紫花杜鹃 UPLC分离出的7个主要峰进行分
析,推断出其可能的结构,结果见表2。
4 讨论
4.1 实验用药材的确定 该实验采集了8批不同
来源及产地的紫花杜鹃药材,在相同的流动相和检
测波长下分析各个样品,HPLC图上各批药材中主
要的色谱峰大致相同,其中的3个色谱峰分别与金
丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素对照品的出峰时间一致,
初步判断药材中含有上述3种黄酮类化合物,且以
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表2 紫花杜鹃中黄酮类成分的UPLC/MS分析
No.
正离子模式
[M+H]+ 二级碎片
负离子模式
[M-H]- 二级碎片
化合物
1 4810965 3190728,4200225,3912782 4790897 3170246,2710095 杨梅素3OβD葡萄糖苷[4]
2 4510855 3190554,3912867,3291065 4491096 3170137,2850376 杨梅素3′OβD吡喃木糖苷[5]
3 4651048 3030644,3431694 4630843 3010355,2710175 金丝桃苷[5]
4 4651010 3030644,3912750,2791557 4630855 3010355,2710335 异槲皮苷[6]
5 4350946 3030644,3912867 4330787 3010306,2710095 广寄生苷[7]
6 4491067 3030728 4470869 3010355,2710175 槲皮苷[8]
7 3030510 2290625 3010403 2270248 槲皮素[8]
罗定的紫花杜鹃样品色谱峰更为明显,从而选取其
作为代表性的样品进行UPLC/QTOFMS分析。
4.2 分子式的确定 黄酮苷类化合物极性较强、难
以气化及对热不稳定,在 EIMS上既不显示分子离
子峰,也不显示糖基的碎片,故不宜用 EIMS测定。
而QTOFMS是高分辨串联质谱,一级质谱是四极
杆,主要起选择离子的作用,二级质谱为飞行时间质
谱,是该仪器的主要质量分析器,可以测得经 UPLC
快速分离之后得化合物准确分子量。正、负离子流
图上均有和紫外色谱图对应的尖锐的峰出现,由一
级质谱的分子离子峰得到的精确分子量计算出其元
素组成,通过化学结构数据库(htp://www.chems
pider.com)检索得到可能的化学结构。
4.3 化合物的确定 黄酮苷类化合物的糖基多结
合在3,5,7位及3′,4′,5′位,依据正、负离子的二级
质谱碎片峰信息,推定其结构关系,结合黄酮类裂解
规律并与对照品比较,最终推定化合物结构。可以
得到以下结果,见图2(以正离子模式为例)。
图2 紫花杜鹃中黄酮类化合物结构式
化合物1 QTOFMS给出准分子离子峰 m/z
4810965[M+H]+,3190为失去1个葡萄糖基的
杨梅素苷元碎片的离子峰[(M+H)-162]+,结合
文献推断为杨梅素3OβD葡萄糖苷[4]。
化合物2 QTOFMS给出准分子离子峰 m/z
4510855[M+H]+,3190为失去1个木糖的杨梅
素苷元碎片的离子峰[(M+H)-132]+,结合文献
推断为杨梅素3′OβD吡喃木糖苷[5]。
化合物3 QTOFMS给出准分子离子峰 m/z
4651048[M+H]+,3030为失去1个半乳糖的槲
皮素苷元碎片的离子峰[(M+H)-162]+,结合文
献推断为槲皮素3O半乳糖苷,即金丝桃苷[5],且
与对照品数据一致。
化合物4 QTOFMS给出准分子离子峰 m/z
4651010[M+H]+,3030为失去1个葡萄糖基的
槲皮素苷元碎片的离子峰[(M+H)-162]+,结合
文献推断为槲皮素3O葡萄糖苷,即异槲皮苷[7],
且与对照品数据一致。
化合物 5 QTOFMS给出分子离子峰 m/z
4350946[M+H]+,3030为失去1个阿拉伯糖基
的槲皮素苷元碎片的离子峰[(M+H)-132]+,结
合文献推断为槲皮素3O阿拉伯糖苷,即广寄生苷
(蓄苷)[6]。
化合物6 QTOFMS给出准分子离子峰 m/z
4491067[M+H]+,3030为失去1个鼠李糖基的
槲皮素苷元碎片的离子峰[(M+H)-146]+,结合
文献推断为槲皮素3O鼠李糖苷,即槲皮苷[8]。
化合物7 QTOFMS给出准分子离子峰 m/z
3030510[M+H]+,结合文献推断为槲皮素[8],且
与对照品数据一致。
在紫花杜鹃提取液水解之后的HPLC图可见几
个主要的色谱峰全都消失,变成只有1个与槲皮素
对照品的位置一致的色谱峰,也证实了紫花杜鹃药
材中的黄酮类成分大都是以槲皮素为苷元的黄酮苷
类化合物。由于极性的不同,黄酮苷类化合物先出
峰,黄酮苷元后出峰;黄酮苷类的流出顺序与糖分子
结构也有一定关系[9]。本实验通过 UPLC/QTOF
MS对紫花杜鹃中黄酮类成分进行分析,具有快速、
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准确的特点,是一种相对较好的定性测定方法,为今
后紫花杜鹃药材的质量控制及应用提供方法基础。
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AnalysisofflavonoidsinRhododendronmariaebyUPLC/QTOFMS
HUANGHuiqiang,FENGYifan,RUIWen,JIANGMiaomiao,HANLiang
(CentralLaboratoryofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheflavonoidsinRhododendronmariae.Method:TheconstituentsinR.mariaewere
determinedbyUPLC/QTOFMS.ThechromatographicseparationwasperformedonaC18column(21mm×50mm,17μm)with
agradientelufionofmethanolwatercontaining01% formicacid.Themassspecfrometereqaippedwithelecfrospayionizafionsource
wasusedasdefecforandoperatedindatawascolectedunderthepositiveandnegativeionmodes.Result:Sevenconstituentswere
identifiedasmyricetin3OβDgluconside(1),myricetin3′OβDxylopyraoside(2),hyperoside(3),isoquercitrin(4),avicula
rin(5),quercitroside(6)andquercetin(7).Conclusion:Inthisstudy,themainflavonoidsinR.mariaewereseparatedby
UPLC,andidentifiedthroughtheinformationofpositiveionandnegativeionandrelativemolecularmasswhichweredeterminedbyQ
TOFMS.ItisanaccurateandefectivemethodwhichcanbeappliedfortheconstituentidentificationofR.mariae.
[Keywords] Rhododendronmariae;flavonoids;UPLC/QTOFMS
[责任编辑 王亚君]
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