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HPLC-ESI-MSn analysis of chemical constituents in Semen Ziziphi Spinosae

HPLC-ESI-MSn分析酸枣仁有效部位的化学成分



全 文 :HPLCESIMSn分析酸枣仁有效部位的化学成分
王卫记,罗建光,孔令义
(中国药科大学 天然药物化学教研室,江苏 南京 210009)
[摘要] 目的:研究中药酸枣仁SemenZiziphiSpinosae有效部位中的化学成分。方法:甲醇提取,D101大孔树脂柱纯化
得有效部位;运用HPLCESIMSn联用技术分析化合物结构。结果:从中药酸枣仁有效部位中鉴定出13个化合物。结论:
HPLCESIMSn能简单、快速地分析酸枣仁黄酮苷及三萜皂苷类成分。
[关键词] 酸枣仁;黄酮苷;三萜皂苷;HPLCESIMSn
[收稿日期] 20090513
[通信作者] 孔令义,Tel:(025)83271405,Email:cpu_lykong@
126.com
  酸枣仁为鼠李科植物酸枣ZiziphusjujubaMil.
var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥成
熟种子,具有补肝、宁心、敛汗、生津之功效,用于
虚烦不眠,惊悸多梦,体虚多汗,津伤口渴等证[1],
其药用历史悠久,《本草纲目》中将其列为上品。
在各类治疗失眠的中药制剂中,酸枣仁最为常用。
文献报道,酸枣仁镇静安眠的有效成分为皂苷
类[2]和黄酮类[3]。近年来对酸枣仁中黄酮苷及皂
苷类定量分析研究较多,而目前广泛使用的高效
液相色谱与质谱联用技术对酸枣仁成分分析研究
鲜有报道,为了更加简便、快速地分析鉴定中药复
杂体系中的化学成分,作者对酸枣仁有效部位进
行了 HPLCESIMSn分析。通过准分子离子峰和多
级质谱裂解碎片并结合文献资料或与部分对照品
对照,鉴定出 8个黄酮苷成分和 5个三萜皂苷成
分,结构见图1。
图1 酸枣仁中8个黄酮苷和5个三萜皂苷化合物的结构
1 材料
Aglient1100LCMSDSeriesTrap系统,包括双
高压溶剂泵,在线真空脱气机,自动进样器,柱温箱,
光二极管阵列检测器(DAD),ESI接口的离子阱质
谱检测器。
乙腈(色谱纯),甲醇(分析纯),分析用水(乐百
氏纯净水,抽滤)。
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药材经中国药科大学中药资源学教授秦民坚鉴
定为鼠李科植物酸枣 Z.jujubavar.spinosa的干燥
成熟种子,标本储存在中国药科大学天然药物化学
教研室。对照品 spinosin,swertisin,kaempferol3ru
tinoside,6feruloylspinosin,jujubosideA,jujuboside
B,均为本实验室自制,HPLC检测,纯度均>98%。
2 方法
2.1 色谱条件 HanbonC18色谱柱(46mm×250
mm,5μm);进样量10μL;柱温35℃;DAD检测器;
检测波长204nm;流动相 A为01%甲酸水溶液,B
为乙腈,梯度洗脱,0~30min,15%~20%B;30~60
min,20%~25%B;60~90min,25%~60%B。
2.2 质谱检测条件 干燥气温度325℃;干燥气流
速100L·min-1;雾化气压力207kPa;离子化方式
ESI(±);电喷雾电压3500V。扫描范围m/z100~
1500。
2.3 提取和纯化 取干燥的酸枣仁,粉碎成粗粉,
甲醇超声提取,回收甲醇,浓缩。稠膏上 D101大孔
吸附树脂柱,分别用水、20%乙醇、75%乙醇洗脱,收
集75%乙醇洗脱液,得到酸枣仁黄酮和皂苷类成分
富集部位,回收溶剂,真空干燥并粉碎。取样品粉末
适量,用甲醇溶解制成25g·L-1的样品溶液,取
15μL样品溶液注入 HPLC系统,进行 HPLCESI
MSn分析。
3 结构鉴定
用HPLCESIMSn在上述色谱质谱条件下对酸
枣仁有效部位的化学成分进行定性分析,检测到各
峰的准分子离子峰[M+Cl]-,[M-H]-及[M+
Na]+,[M+H]+,由准分子离子峰确定其相对分子
质量,结合二、三级质谱的碎片信息,通过与文献报
道的成分或与部分对照品对照,推测色谱峰的可能
组成。(±)ESIMS质谱的总离子流色谱图见图2。
图2 (±)ESIMS质谱的总离子流色谱图
  化合物1 85~88min的一级负离子质谱给
出m/z5931[M-H]-,一级正离子质谱给出 m/z
5951[M+H]+,表明该化合物相对分子质量为
594。二、三级负离子质谱分别给出5330[M-H-
60]-,5030[M-H-90]-,4730[M-H-120]-,
4129[M-H-120-60]-,3829[M-H-120-
90]-,3529[M-H-120-120]-,3249[3529-
CO]-,2969[3529-2CO]-。两次给出脱去60,
90,120质量单位的碎片离子,可以推断化合物1为
由2个六碳六氧糖分别与苷元直接相连的黄酮二碳
苷。通过对酸枣仁中黄酮碳苷化合物进行文献[4]
检索,以上离子碎片符合 viceninⅡ的裂解规律,由
以上信息可推测此化合物为viceninⅡ。
化合物2 175~179min的一级负离子质谱
给出m/z5932[M-H]-,6291[M+Cl]-,一级正
离子质谱给出 m/z5952[M+H]+,表明该化合物
相对分子质量为594。二、三级负离子质谱分别给
出产物离子峰4139[M-H-Glc-H2O]
-,3539
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[M-H-Glc-H2O-60]
-,3240[M-H-Glc-
H2O-90]
-,2929[M-H-Glc-H2O-120]
-,有
规律地产生脱去60,90,120质量单位的碎片峰,基
本可以判断为六碳六氧糖的黄酮碳苷类化合物;二、
三正离子分别给出离子峰4331[M+H-Glc]+,
3131[M+H-Glc-120]+。根据酸枣仁中黄酮类
化合物的结构特点,以上离子碎片符合isovitexin2″
OβDglucopyranoside的裂解规律,并和文献[5]报
道基本一致。由以上信息可推测此化合物为 isovi
texin2″OβDglucopyranoside。
化合物3 197~201min的一级负离子质谱
给出m/z6072[M-H]-,6432[M+Cl]-,一级正
离子质谱给出 m/z6092[M+H]+,表明该化合物
相对分子质量为608。经文献检索,spinosin,isospi
nosin,zivulgarin相对分子质量,均为608。二、三级
负离子质谱分别给出产物离子峰 4269[M-H-
Glc-H2O]
-,3670[M-H-Glc-H2O-60]
-;二
级正离子质谱给出4472[M+H-Glc]+。以上3
个化合物均为六碳糖基的黄酮碳苷,但在多级负离
子中未能给出有规律的脱60,90,120质量单位的碎
片,仅出现脱60质量单位的碎片峰,只有 zivulgarin
的裂解规律[6]与其相符。这可能因为 spinosin,
isospinosin的糖链为(1→2)连接,在脱去1个Glc和
H2O后,形成双键在内侧糖的C2与C1间;而zivulga
rin的糖链为(1→4)连接,在脱去1个 Glc和 H2O
后,形成双键在内侧糖的 C4与 C3间,无法进一步脱
CH2O和2CH2O,见图3。由以上信息可推测此化合
物为zivulgarin。
图3 spinosin和zivulgarin的部分质谱裂解过程
  化合物4 202~208min的一级负离子质谱
给出m/z6430[M+Cl]-,6071[M-H]-,一级正
离子质谱给出 m/z6093[M+H]+,6313[M+
Na]+,表明该化合物相对分子质量为 608。二、三
级负离子质谱分别给出 4270[M-H-Glc-H2
O]-,3670[M-H-Glc-H2O-60]
-,3371[M-
H-Glc-H2O-90]
-,3069[M-H-Glc-H2O-
120]-,可推知为六碳糖基的黄酮碳苷类化合物;
二、三级正离子质谱分别给出 4471[M+H-
Glc]+,3271[M+H-Glc-120]+。根据酸枣仁中
黄酮类化合物的结构特点,以上离子碎片符合 spi
nosin或 isospinosin的裂解规律[7,5],二者糖基连接
苷元的 6或 8位,用质谱无法确定。经与 spinosin
对照品比较,质谱裂解规律和 HPLC保留时间以及
UV图谱均完全一致,鉴定此化合物为spinosin。
化合物5 241~246min的一级负离子质谱
给出m/z4450[M-H]-,一级正离子质谱给出m/z
4471[M+H]+,表明该化合物相对分子质量为
446。二、三级负离子质谱分别给出3850[M-H-
60]-,3549[M-H-90]-,3249[M-H-120]-,
2969[M-H-120-CO]-,2818[M-H-120-
CO-CH3]
-;二、三级正离子质谱分别给出 4291
[M+H-H2O]
+,3271[M +H-120]+。以上离
子碎片符合 swertisin的裂解规律[7],经与 swertisin
对照品比较,质谱裂解规律和 HPLC保留时间以及
UV图谱均完全一致,鉴定此化合物为swertisin。
化合物6 263~266min的一级负离子质谱
给出m/z5931[M-H]-,一级正离子质谱给出m/z
5951[M+H]+,6171[M+Na]+,表明该化合物
相对分子质量为594。经文献检索,kaempferol3ru
tinoside,viceninⅡ和 isovitexin2″OβDglucopyrano
side相对分子质量均为 594。二、三级负离子质谱
分别给出 m/z2849,2568碎片,未出现黄酮碳苷
裂解的特征碎片,据此可以排除 viceninⅡ和 isovi
texin2″OβDglucopyranoside。且 m/z2849[M-
H-rutinosyl]-,2568[M-H-rutinosylCO]-符合
kaempferol3rutinoside的 裂 解 规 律[8]。 经 与
kaempferol3rutinoside对照品比较,质谱裂解规律
和HPLC保留时间以及 UV图谱均完全一致,鉴定
此化合物为kaempferol3rutinoside。
化合物7 364~370min的一级负离子质谱
给出m/z8491[M+Cl]-,8132[M-H]-,一级正
离子质谱给出 m/z8153[M+H]+,表明其相对分
子质量为814。二、三级负离子质谱分别给出6071
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[M-H-sinapoyl]-,4269[M-H-sinapoyl-Glc-
H2O]
-,3672[M-H-sinapoyl-Glc-H2O-
60]-,3369[M-H-sinapoyl-Glc-H2O-90]
-,
3071[M-H-sinapoyl-Glc-H2O-120]
-;二、三
级正离子质谱分别给出4470[M+H-sinapoyl-
Glc]+,3271[M+H-sinapoyl-Glc-120]+,4291
[M+H-sinapoyl-Glc-H2O]
+,3090[M+H-
sinapoyl-Glc-H2O-120]
+。根据酸枣仁中黄酮
类化合物的结构特点,以上离子碎片符合 6si
napoylspinosin的裂解规律,并和文献[7]报道基本
一致。由以上信息可推测此化合物为 6sinapoyl
spinosin。
化合物8 390~396min的一级负离子质谱
给出m/z8194[M+Cl]-,7832[M-H]-,一级正
离子质谱给出 m/z7853[M+H]+,8073[M+
Na]+,表明该化合物相对分子质量为 784。二、三
级负离子质谱分别给出6070[M-H-feruloyl]-,
4269[M-H-feruloyl-Glc-H2O]
-,3668[M-
H-feruloyl-Glc-H2O-60]
-,3370[M-H-fer
uloyl-Glc-H2O-90]
-,3069[M-H-feruloyl-
Glc-H2O-120]
-。根据酸枣仁中黄酮类化合物
的结构特点,以上离子碎片符合 6feruloylspinosin
或 6feruloylisospinosin的裂解规律[7,5],二者糖基
分别连接苷元的6或8位,用质谱难以确定。经与
6feruloylspinosin对照品比较,质谱裂解规律和
HPLC保留时间以及UV图谱均完全一致,鉴定此化
合物为6feruloylspinosin。
化合物9,10 446~454min和462~470
min的一级负离子质谱都给出 m/z9785[M+
Cl]-,9425[M-H]-,一级正离子质谱都给出m/z
9443[M+H]+,9664[M+Na]+,表明化合物相
对分子质量均为943。相对分子质量为奇数,应含
有奇数个 N原子。二、三级负离子质谱中均给出
m/z6071,4269,3370,3077碎片,与 spinosin质
谱裂解碎片相似。综上可对其结构预测为 spinosin
连接一个含奇数N原子的基团组成。轰击裂解时,
先脱去含N基团,然后出现黄酮碳苷 spinosin碎片
离子。经文献检索未发现酸枣仁中有相对分子质量
与其相符的报道。推测可能是两种未知成分。
化合物11,12 628~633min和635~641
min的一级负离子质谱都给出 m/z11545[M+
Cl]-,11184[M-H]-,一级正离子质谱都给出
m/z11204[M+H]+,11425[M+Na]+,表明化
合物相对分子质量均为1119。二、三级负离子质谱
中均给出 m/z7832,6070,4270,3670,3370,
3069碎片,与 6feruloylspinosin质谱裂解碎片相
似。综上可对其结构预测为6feruloylspinosin连接
1个含奇数N原子的基团组成。轰击裂解时,先脱
去含 N基团,然后出现黄酮碳苷6feruloylspinosin
碎片离子。经文献检索未发现酸枣仁中有相对分子
质量与其相符的报道。推测可能是两种未知成分。
化合物13 793~796min的一级负离子质
谱给出m/z12417[M+Cl]-,12058[M-H]-,
表明该化合物相对分子质量为1206。二、三级负离
子质谱分别给出10734[M-H-Xyl]-,9113[M-
H-Xyl-Glc]-,7495[M-H-Xyl-2Glc]-;根据
酸枣仁中皂苷类化合物的结构特点,以上离子碎片
符合jujubosideD或jujubosideA1的裂解规律
[910],两
者区别是在相同的位置一个连有 D岩藻糖一个连
有L岩藻糖,用质谱无法确定,由以上信息可推测
此化合物可能为jujubosideD或jujubosideA1。
化合物14 805~809min的一级负离子质
谱给出m/z12418[M+Cl]-,12055[M-H]-,
一级正离子质谱给出 m/z12074[M+H]+,
12298[M+Na]+,表明该化合物相对分子质量为
1206。二、三级负离子质谱分别给出10736[M-
H-Xyl]-,9276[M-H-Xyl-Rha]-,7476[M-
H-Xyl-Rha-Glc-H2O]
-;二级正离子质谱给出
1067[M+Na-162]+。以上离子碎片符合 jujubo
sideA的裂解规律[11],经与 jujubosideA对照品比
较,质谱裂解碎片和 HPLC保留时间以及 UV图谱
均完全一致,鉴定此化合物为jujubosideA。
化合物15 816~819min的一级负离子质
谱给出m/z12417[M+Cl]-,12054[M-H]-,
一级正离子质谱给出m/z12298[M+Na]+,表明
该化合物相对分子质量为1206。二、三级负离子质
谱分别给出10737[M-H-Xyl]-,9276[M-H-
Xyl-146]-。以上离子碎片符合 jujubosideA1或
jujubosideD的裂解规律[910],由以上信息可推测此
化合物可能为jujubosideA1或jujubosideD。
化合物16 831~835min的一级负离子质
谱给出m/z10796[M+Cl]-,10435[M-H]-,
一级正离子质谱给出m/z10678[M+Na]+,表明
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该化合物相对分子质量为1044。二、三级负离子质
谱分别给出9115[M-H-Xyl]-,7652[M-H-
Xyl-rha]-,7495[M-H-Xyl-Glc]-,6030[M-
H-Xyl-Rha-Glc]-;以上离子碎片符合 jujubo
sideB的裂解规律[11],经与 jujubosideB对照品比
较,质谱裂解碎片和 HPLC保留时间以及 UV图谱
均完全一致,鉴定此化合物为jujubosideB。
化合物17 842~845min的一级负离子质
谱给出m/z10797[M+Cl]-,10435[M-H]-,
一级正离子质谱给出 m/z10455[M+H]+,表明
该化合物相对分子质量为1044。二、三级负离子质
谱分别给出9475[M+Cl-Xyl]-,9115[M-H-
Xyl]-,7492[M-H-Xyl-Glc]-,6032[M-H-
Xyl-Rha-Glc]-。以上离子碎片符合 jujuboside
B1的裂解规律
[12],由以上信息可推测此化合物可能
为jujubosideB1。
化合物18 883~889min的一级负离子质
谱给出m/z12237[M+Cl]-,11877[M-H]-,
一级正离子质谱给出 m/z10896[M+H]+,表明
该化合物相对分子质量为1188。二、三级负离子质
谱分别给出10556[M-H-132]-,8934[M-H-
132-Glc]-,8755[M-H-132-Glc-H2O]
-,
7314[M-H-2Glc]-碎片离子。与酸枣仁皂苷类
成分质谱行为相似,但经文献检索未发现酸枣仁中
有相对分子质量与其相符的报道,推测可能是未知
皂苷成分。
4 讨论
对甲醇水、乙腈水2种流动相体系进行试验,
后者洗脱能力较强,分离效果较好;流动相中加入
01%甲酸有利于减少拖尾,改善峰形;通过 D101
大孔树脂柱梯度洗脱得到的样品,去除了大部分极
性杂质,从而使被测物质分离度、峰形都较为理想。
采用正负离子模式可以得到更多的结构信息,
增强分析结果的准确可靠性。特别是对未知化合物
进行结构推测时,如本实验中的化合物9~12,根据
正负离子模式下给出的准分子离子峰[M+Cl]-,
[M-H]-及[M+Na]+,[M+H]+来确定化合物相
对分子质量,有较好的可靠性。
酸枣仁的黄酮类化合物中大多为黄酮碳苷,在
负离子模式下,质谱裂解有较强的规律性,一般产生
脱去60,90,120质量单位的碎片峰,且与苷元直接
相连的糖为六碳糖。ESI是一种软电离方式,皂苷
类成分主要出现脱糖基的碎片。当化合物结构非常
相似,多级质谱裂解规律相同时,如无对照品对照,
应用此法不能准确归属,如本实验中的 jujuboside
A1和jujubosideD。
HPLCESIMSn技术,可以方便、快速地对中药
单体化合物、组分或部位进行结构分析,在中药研究
中具有巨大应用潜力。
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HPLCESIMSnanalysisofchemicalconstituentsinSemenZiziphiSpinosae
WANGWeiji,LUOJianguang,KONGLingyi
(DepartmentofNaturalMedicinalChemistry,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210038,China)
[Abstract] Objective:TostudyonthechemicalconstituentsofefectivepartofSemenZiziphiSpinosae.Method:Thesample
wasextractedwithmethanolandpurifiedbymacroporousresin.Thestructureswereidentifiedbyhighperformanceliquidchromatogra
phy/electrosprayionizationwithmultistagetandemmassspectrometry.Result:Thirteencompoundswereidentifiedfromtheefective
partofSemenZiziphiSpinosae.Conclusion:Themethodissimpleandrapidfortheidentificationoftheflavonoidsandtriterpenoid
saponinsfromSemenZiziphiSpinosae.
[Keywords] SemenZiziphiSpinosae;flavonoids;triterpenoidsaponins;HPLCESIMSn
[责任编辑 王亚君]
《中国中药杂志》2010年征订启事
《中国中药杂志》系中国科协主管,中国药学会主办,中国中医科学院中药研究所承办的综合性中药学
术期刊。1955年7月创刊,为中国创刊最早、发行量最大的中药学术刊物,在药学期刊中,本刊的文献量、信
息交流量、期刊影响因子、引文频次、文章发表周期等均名列前茅,全面反映我国中医药科研最高学术水平。
主要报道该领域新成果、新技术、新方法与新思路,内容包括栽培、资源与鉴定、炮制、药剂、化学、药理、不良
反应、临床等。设有专论、综述、研究论文、研究报告、临床、学术探讨、药事管理、经验交流、信息等栏目。主
要读者对象为各级管理部门、研究院所、大专院校、工厂企业以及医院等从事中医药科研、管理、生产、医院制
剂及临床等方面的人员。
目前,《中国中药杂志》在国际国内医药学、生物学等相关科技领域内具有广泛影响:被国际著名权威专
业数据库收录,如:美国SciFinder数据库,进入医学索引 Medline;进入《化学文摘》(CA);Elsevier公司 Sco
pus数据库;《国际药学文摘》(IPA);《毒物学文摘》(ToxFile);俄罗斯《文摘杂志》(AJ);荷兰《医学文摘》
(EM);波兰《哥白尼索引》(IC)等;在国内,为“中国科学引文数据库”和“中国学术期刊综合评价数据库”来
源期刊;为中国中文核心期刊,中国科技核心期刊,中国自然科学核心期刊,统计源期刊,中国精品科技期刊
等。
《中国中药杂志》荣获第三届国家期刊奖百种重点期刊。荣获国家中医药管理局“以岭杯”第三届全国
中医药优秀期刊评选一等奖;荣获第五届中国百种重点学术期刊;获得中国科协精品科技期刊工程项目 B
类资助。
《中国中药杂志》为半月刊,128~144页,2010年定价每期3000元,全年24期定价为72000元。国内
刊号112272/R,国际刊号11015302。
本刊网址www.cjcmm.com.cn或www.中国中药杂志.com。
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第34卷第21期
2009年11月
                           
Vol.34,Issue 21
 November,2009