目的:研究锁阳多糖(CSP)对D-半乳糖衰老模型小鼠血液及脑组织细胞染色体末端端粒长度的影响,观察锁阳多糖的抗衰老作用机制。方法:昆明小鼠腹腔注射D-半乳糖(500 mg·kg-1·d-1)制作衰老模型,动物分成正常组、模型组、CSP低(20 mg·kg-1)、中(40 mg·kg-1)、高(80 mg·kg-1)剂量、黄芪多糖(40 mg·kg-1)各组,连续灌胃给药56 d后,应用荧光实时定量PCR方法测定各组小鼠血细胞及脑组织端粒的相对长度。结果:高、中剂量CSP组血细胞相对端粒长度T/S ratio分别为1.64±0.36,1.33±0.28,较衰老模型组1.01±0.13明显增加(P<0.01),脑组织高、中、低剂量CSP组分别为3.34±0.58,2.30±0.75,1.55±0.58,较衰老组1.04±0.33均明显增加(P<0.01)。结论:CSP可以通过抑制D-半乳糖衰老小鼠血细胞和脑细胞染色体末端端粒长度的缩短,从而延缓组织细胞的衰老进程。
Objective: To study the effects of Cynomorium songaricum polysaccharide (CSP) on telomere length in blood and brain tissues of aged mice in order to provide some evidence for CSP‘s development and applying in the clinical uses. Method: Kunming mice were intraperitoneal injected D-galactose (500 mg·kg-1·d-1) to make the aging models, and different dosages of CSP (20, 40, 80 mg·kg-1) were given by gavage for 56 days. The average length of telomere was determined by real-time fluorescence quantitative PCR. Result: The relative T/S ratio of the group high and middle dosages of CSP in blood were 1.64±0.36 and 1.33±0.28, respectively, and higher than that of the group of senescence 1.01±0.13 (P<0.01). Values of the group of high, middle, and low dosages of CSP in brain tissues were 3.34±0.58, 2.30±0.75 and 1.55±0.58, respectively, and significantly higher than that of the group of senescence 1.04±0.33 (P<0.01). Conclusion: CSP can exert the anti-aging effects by increase telomere length of senescence mice.
全 文 :锁阳多糖对 D半乳糖衰老小鼠血细胞和
脑细胞染色体端粒长度的影响
马丽杰1,2,陈贵林1,聂丽莎2,爱 民2
(1.内蒙古大学 生命科学学院,内蒙古 呼和浩特 010021;
2.内蒙古医学院 药理教研室,内蒙古 呼和浩特 010059)
[摘要] 目的:研究锁阳多糖(CSP)对D半乳糖衰老模型小鼠血液及脑组织细胞染色体末端端粒长度的影响,观察锁阳
多糖的抗衰老作用机制。方法:昆明小鼠腹腔注射D半乳糖(500mg·kg-1·d-1)制作衰老模型,动物分成正常组、模型组、
CSP低(20mg·kg-1)、中(40mg·kg-1)、高(80mg·kg-1)剂量、黄芪多糖(40mg·kg-1)各组,连续灌胃给药56d后,应用
荧光实时定量PCR方法测定各组小鼠血细胞及脑组织端粒的相对长度。结果:高、中剂量 CSP组血细胞相对端粒长度 T/S
ratio分别为164±036,133±028,较衰老模型组101±013明显增加(P<001),脑组织高、中、低剂量 CSP组分别为
334±058,230±075,155±058,较衰老组104±033均明显增加(P<001)。结论:CSP可以通过抑制 D半乳糖衰老
小鼠血细胞和脑细胞染色体末端端粒长度的缩短,从而延缓组织细胞的衰老进程。
[关键词] 锁阳多糖;抗衰老;定量PCR;端粒
[收稿日期] 20081007
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30660015);内蒙古自然科学
基金项目(200607010905)
[通信作者] 陈贵林,教授,博士生导师。Tel:(0471)6992577,E
mail:guilinchen@yahoo.com.cn
锁阳 CynomoriumsongaricumRupr.首载于《本
草衍义补遗》,取名源于其药用功效“锁住阳气,长
盛不衰”,又被称为“不老药”。我国西部有丰富的
锁阳资源,内蒙古是其主产地之一。锁阳性味甘、
温,有补肾助阳、益精血,润肠通便等功效[1]。现代
研究发现,锁阳有清除氧自由基、抗氧化、抗缺氧、抗
应激、抗疲劳、抗癌、抗 HIV以及润肠通便等作
用[2]。本课题组在以往的工作中也发现以多糖为
主要成分的锁阳水提物有对衰老小鼠的抗氧化作
用,锁阳多糖有明显的抗免疫作用和促进体外培养
骨髓细胞增殖的作用。为探讨锁阳多糖对衰老小鼠
基因功能的影响,现进一步研究其抗衰老的作用
机制。
1 材料
1.1 动物
昆明种小鼠,内蒙古大学实验动物中心提供,合
格证号SCXK(蒙)20020001。
1.2 药物
锁阳,自采于内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗独贵特
拉镇,经内蒙古大学生命科学学院生物系陈贵林教
授鉴定。新鲜锁阳除去花序,自然干燥,粉碎,过80
目筛,置于硅胶干燥器中备用。
自制锁阳多糖:取锁阳粉末,加95%乙醇浸泡
脱脂,离心取沉淀,按料液比1∶15加水,94℃下水
浴提取2h,重复提取2次。上清液加95%乙醇使
醇含量达到80%以上,放置24h后离心,沉淀用丙
酮、无水乙醇、90%乙醇各洗涤2次得粗多糖。粗多
糖加水复溶,过滤除去沉淀,以5%三氯乙酸、Sevag
法去蛋白各2次,再次醇沉,沉淀物重新溶解于水,
去离子水透析 3d后醇沉,沉淀物经无水乙醇至
80%乙醇分级醇洗,真空干燥至恒重,得锁阳多糖
(CSP),CSP得率 124%。将所得 CSP加水溶解,
以苯酚硫酸法测得多糖含量为932%。经紫外光
谱测定,在260nm无吸收,280nm有小吸收峰,说
明CSP样品不含核酸类物质,含少量蛋白杂质。精
制的CSP经凝胶高效液相色谱测其平均分子质量
129×105。
黄芪多糖,自制,制备方法同CSP,含量918%。
1.3 试剂
离心柱法基因组 DNA提取试剂盒(天根生化
科技公司,批号 DP318);荧光定量 PCR试剂盒
SYBR(R)PremixExTaqTM(PerfectRealTime)(大
连宝生物公司,批号DRR041S)。
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1.4 仪器
ABI7300实时定量PCR仪(AppliedBiosceince,
FosterCity,CA)。
2 方法
2.1 动物分组及模型制备
小鼠60只,体重18~22g,雌雄各半。随机分
为6组:正常组、衰老模型组[3]、CSP低、中、高剂量
组、黄芪多糖组,每组10只,雌雄各半。模型组及给
药组每日腹腔注射 50g·L-1D半乳糖 500mg·
kg-1·d-1,正常组给同容积生理盐水。CSP低、中、
高组每日灌胃CSP剂量分别为20,40,80mg·kg-1
·d-1,黄芪多糖40mg·kg-1·d-1,正常组和模型
组以等量蒸馏水灌胃。
2.2 小鼠外周血细胞及脑组织DNA的提取
连续给药8周后摘眼球取血约1mL,颈椎脱臼
致死,取脑组织迅速液氮保存。血样经 1000r·
min-1离心10min,上清弃去,血凝块-20℃保存。
冰冻血凝块溶化后在 PE手套内挤碎,加入红
细胞裂解液1mL,混匀器混匀15s,1万r·min-1离
心1min,弃上清,加红细胞裂解液500μL再次处理
后按试剂盒操作,得到 DNA样品 100μL。所得
DNA样品-20℃保存待测。脑组织样品取约500
mg,研细后按试剂盒提取操作,步骤与血液相同,冷
冻保存DNA样品待测。经核酸测定仪测定DNA为
160~400mg·L-1,A260/A280=186~193。
2.3 实时荧光定量PCR测定端粒长度
2.3.1 引物的设计 端粒上游引物5′GGTTTTT
GAGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGGAGGGT3′,下游
引 物 5′TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATC
CCTATCCCTA3′[4]。参比的单拷贝基因为36B4基
因,上游引物 5′ACTGGTCTAGGACCCGAGAAG3′,
下游引物5′TCAATGGTGCCTCTGGAGATT3′[5],引
物均由大连宝生物公司合成。引物使用浓度 10
μmol·L-1。
2.3.2 实时荧光定量PCR反应体系和条件 每个
PCR反应体系包括:SYBRPremixEXTaq10μL,
ROXReferenceDye04μL,上、下游引物各04μL,
稀释100倍后 DNA模板1μL,加灭菌水至20μL。
混匀后扩增。端粒扩增条件:94℃ 10s预变性,然
后95℃5s,52℃31s,40个循环。36B4基因扩增
条件:94℃10s预变性,然后95℃5s,54℃31s,
40个循环。应用 ABI7300实时定量 PCR仪进行检
测、记录和分析。
2.3.3 标准曲线的制备 任意取一份待测样品作
为模板,按10倍梯度稀释共5个浓度作标准曲线,
以模板样品的稀释倍数的 log值对样品达到一定阈
值所需的循环数(thresholdcycle,Ct)做标准曲线。
2.3.4 样品实时荧光定量测定及数据处理方法
待测DNA稀释样品取1μL加入到20μLPCR反应
体系,每份模板分别测定端粒基因及36B4基因的
Ct值,重复测定3次,取平均值进行计算。以 T/S
ratio计算端粒 DNA的长度。T/Sratio=[2Ct(telo)/
2Ct(36b4)]-1=2-[Ct(telo)-Ct(36b4)]=2-ΔCt。为比较观察
药物的作用,再以 D半乳糖衰老模型组的平均 ΔCt
为对照,求相对T/Sratio,相对T/Sratio=2-ΔΔCt。
2.4 统计方法
实验数据以 珋x±s表示,应用 SPSS110软件采
用单因素方差分析比较各组间的显著性差异。P<
005表示差异有显著性。
3 结果
3.1 端粒基因和36B4基因标准曲线
模板梯度稀释的端粒基因引物标准曲线 r2=
0990,斜率 =-302,36B4基因标准曲线 r2 =
0993斜率 =-349。端粒基因在模板浓度 1~
10-3倍稀释线性关系良好,扩增效率高。36B4基因
线性范围1×10-1~10-4倍。熔点曲线见图1,2,可
见扩增产物特异,适合定量。
图1 36B4基因熔点曲线
3.2 荧光定量分析结果
结果显示,CSP中、高剂量组T/Sratio与模型组
相比在血液和脑组织中差异均有统计学意义,两组
织的端粒长度变化趋势一致。血细胞和脑组织中
D半乳糖致衰老模型组同正常组相比相对端粒长度
均明显缩短(P<001)。给药后,血细胞中、高剂量
CSP给药组和黄芪多糖组同模型组相比,相对端粒
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图2 端粒基因熔点曲线
长度均有明显增加(P<001),低剂量组没有明显
影响。脑组织各给药组同模型组相比相对端粒长度
均有明显增加(P<001)。血细胞与脑组织端粒长
度在正常与衰老模型小鼠中均有明显不同
(P<005)(表1)。
4 讨论
实时定量(realtimequantitative)PCR法包括荧
光嵌合法(SYBRGreenⅠ),荧光探针法等,SYBR
Green法简单易行,价格相对较低,该法测定端粒相
对长度准确性强、灵敏度好,该方法可用来替代传统
的Southernblot,QFISH等方法测定端粒、端粒酶。
表1 CSP对衰老小鼠血细胞及脑组织端粒长度的影响(珋x±s,n=10)
组别 剂量/mg·kg-1·d-1 2-ΔCT血 2-ΔΔCT血 2-ΔCT脑 2-ΔΔCT脑
正常 - 55122±8202 170±025 43309±144593) 293±0983)
模型 - 32610±42371) 101±0131) 15433±48351,3) 104±0331,3)
CSP 20 34272±6739 106±021 22920±86112) 155±0582)
40 42892±91432) 133±0282) 43309±111592) 230±0752)
80 53129±116112) 164±0362) 49447±86382) 334±0582)
黄芪多糖 40 47061±85362) 145±0262) 34521±99932) 233±0682)
注:与正常组比1)P<001;与衰老模型组比2)P<001;与血细胞相比3)P<005。
端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构,
由端粒DNA和端粒蛋白质组成。端粒DNA是富含
G的高度保守的重复核苷酸序列,人和其他哺乳动
物的端粒DNA序列均由5′3′方向(TTAGGG)n反
复串联组成,它参与 DNA复制,对维持染色体的稳
定和完全复制有重要作用。正常动物细胞 DNA的
端粒随着细胞分裂而缩短,端粒的长度在多种类型
的衰老的体细胞中都呈现出末端重复序列的丢失,
当端粒缩短到临界长度时细胞将停止增殖并死亡。
端粒的丢失可以用来衡量培养基中再生细胞的衰老
程度,而且在体内可根据它判断细胞供体的年龄,这
种功能已经在人类多种细胞或可再生组织中得到了
证实[6]。由于端粒的功能性丧失可以触发细胞周
期的停止引起衰老,因此对引发端粒重复序列丢失
的模型的研究将会成为抗衰老药物发现和开发的另
一个途径。
本实验的致衰模型采用 D半乳糖法,D半乳糖
是一种二醛糖,在醛糖还原酶作用下被还原成半乳
糖醇后,不能被细胞进一步代谢,而堆积在细胞内,
引起氧化应激、自由基损伤及诱导醛糖还原酶活性
增强等一系列病理生理变化,使细胞肿胀、代谢紊
乱,引发衰老。本实验发现D半乳糖能明显降低血
液和脑组织细胞端粒长度,可能通过端粒机制触发
衰老过程,进一步说明了用D半乳糖造衰老模型的
方法是可行的。
已有研究表明,不同组织的端粒长度并不完全
相同[7],本实验研究的结论与之类似,2种组织端粒
长度在正常小鼠和衰老小鼠均有明显差异(P<
005)。
本实验研究发现,CSP能够明显延长衰老模型
小鼠脑组织细胞染色体末端端粒长度,较高剂量的
CSP也能延长血细胞端粒长度,但未能达到或超过
正常水平,说明对衰老小鼠而言,给药后仅延长了衰
老进程,而没有显示细胞端粒不再缩短的永生化性
质。作者将进一步观察 CSP对肿瘤细胞端粒长度
的影响,以研究其是否对衰老细胞和肿瘤细胞有双
向调节的作用。
[参考文献]
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EfectofCynomoriumsongaricumpolysaccharideontelomerelengthin
bloodandbrainofDgalactoseinducedsenescencemice
MALijie1,2,CHENGuilin1,NIELisha2,AIMin2
(1.ColegeofLifeScience,InnerMongoliaUniversity,Hohhot010021,China;
2.Departmentofpharmacology,InnerMongoliaMedicalColege,Hohhot010059,China)
[Abstract] Objective:TostudytheefectsofCynomoriumsongaricumpolysaccharide(CSP)ontelomerelengthinbloodand
braintissuesofagedmiceinordertoprovidesomeevidenceforCSP'sdevelopmentandapplyingintheclinicaluses.Method:Kun
mingmicewereintraperitonealinjectedDgalactose(500mg·kg-1·d-1)tomaketheagingmodels,anddiferentdosagesofCSP
(20,40,80mg·kg-1)weregivenbygavagefor56days.Theaveragelengthoftelomerewasdeterminedbyrealtimefluorescence
quantitativePCR.Result:TherelativeT/SratioofthegrouphighandmiddledosagesofCSPinbloodwere164±036and133±
028,respectively,andhigherthanthatofthegroupofsenescence101±013(P<001).Valuesofthegroupofhigh,middle,
andlowdosagesofCSPinbraintissueswere334±058,230±075and155±058,respectively,andsignificantlyhigherthan
thatofthegroupofsenescence104±033(P<001).Conclusion:CSPcanexerttheantiagingefectsbyincreasetelomerelength
ofsenescencemice.
[Keywords] Cynomoriumsongaricumpolysaccharide;antisenescence;quantitativePCR;telomere
[责任编辑 古云侠]
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