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Study on in vitro mucosal permeation properties and factors affecting mucosal permeability of paeonol

丹皮酚体外黏膜渗透性及影响因素的考察



全 文 :丹皮酚体外黏膜渗透性及影响因素的考察
陈晓兰1,2,杜守颖1,陆洋1,姚宗玲1
(1北京中医药大学 中药学院,北京 100102;2贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002)
[摘要] 目的:考察牡丹皮提取物丹皮酚的体外黏膜渗透性及影响因素。方法:选择离体牛蛙皮肤为渗透模型,采用改
良的Franz扩散池进行体外经皮吸收实验;HPLC测定丹皮酚的含量,研究接收液、蛙皮及药物浓度对丹皮酚体外黏膜渗透的
影响。结果:接收液的渗透压和pH对丹皮酚的渗透有一定的影响;同一牛蛙不同部位的皮肤对丹皮酚渗透的影响较大,其表
观渗透系数:腹皮>背皮>侧腹皮;丹皮酚黏膜渗透性良好,累积渗透率与时间符合一级吸收过程。结论:以离体牛蛙腹皮为
渗透模型,丹皮酚的体外渗透性质与黏膜吸收的特点有相似性。
[关键词] 丹皮酚;离体蛙皮;黏膜渗透;表观渗透系数(Papp)
[收稿日期] 20090403
[基金项目] 科技部“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09502
008)
[通信作者] 杜守颖,教授,博士生导师,主要从事中药新剂型与
新技术研究,Tel:(010)84738645,Email:dushouying@263.net
[作者简介] 陈晓兰,在读博士研究生,主要从事中药经鼻给药系
统研究
  非胃肠道黏膜给药系统受到越来越多的关注,
药物经(口腔、鼻、舌下等)黏膜吸收可以避免首过
效应,提高生物利用度,达到全身治疗的目的;同时
黏膜给药有一定的靶向作用,用法方便,患者易于接
受。但黏膜渗透模型即离体动物黏膜来源有限,分
离困难,一定程度阻碍了药物黏膜渗透研究[1]。
牡丹皮为毛茛科植物牡丹 PaeoniaSufruticosa
Andr.的干燥根皮,有清热凉血、和血化瘀的功能,丹
皮酚是其主要有效成分之一。丹皮酚是一个小分子
的酚类化合物,具有镇痛、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样
硬化等药理作用。近年来,随着对传统中药的开发研
究不断深入,丹皮酚的应用范围进一步扩大,已有文
献报道,丹皮酚对脑缺血具有一定的脑保护作用[2]。
本研究利用蛙皮与黏膜的结构相似性,采用离体蛙皮
模型考察了接收介质、蛙皮部位及药物浓度对牡丹皮
提取物丹皮酚体外黏膜渗透的影响,以此评价以离体
蛙皮模型研究丹皮酚的黏膜渗透的可行性,为丹皮酚
的黏膜给药制剂的进一步研究和开发奠定基础。
1 材料
高效液相色谱仪(LC10AD,SPD1020A检测
器,岛津);超声波清洗器(CX100型,北京医疗设
备厂);电子分析天平(BS110S型,北京赛多利斯
公司);智能透皮试验仪(TP2A型,南京红蓝电子
科技有限公司)。
牛蛙,体重(500±10)g,由北京中医药大学实
验动物中心提供。
丹皮酚对照品(中国药品生物制品检定所,批
号110708200505);丹皮酚(由本实验室采用水蒸
汽蒸馏法提取所得,纯度>99%);甲醇(promptar公
司,色谱纯);娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团);其
他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
21 HPLC测定丹皮酚方法学
211 色谱条件
DiamonsilTM钻石 C18柱(46mm×250mm,5
μm);流动相甲醇水(60! 40),流速 10mL·
min-1;检测波长 274nm;柱温常温;进样量 10μL。
丹皮酚的相对保留时间约为151min。渗透液其他
物质无干扰见图1。
212 线性关系考察
丹皮酚质量浓度(C)在5056~101120mg·
L-1与峰面积(A)线性关系良好,回归方程 A=5
354C+17838(r=09999)。
213 精密度试验
精密度试验取低、中、高浓度(20,40,80mg·
L-1)的丹皮酚甲醇溶液,按上述色谱条件各连续进
样6次,记录峰面积,计算 RSD分别为 033%,
012%,012%。
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A空白渗透液;B丹皮酚对照品;C丹皮酚渗透样品;1丹皮酚。
图1 丹皮酚蛙皮渗透样品HPLC图
22 丹皮酚体外黏膜渗透试验
221 离体皮肤的制备
牛蛙断颈处死,分离蛙腹部皮肤,用生理盐水反
复冲洗,至无混浊为止。用塑料薄膜包裹后于

20
℃冷冻保存,1周内用完。
222 体外渗透试验[3]
将蛙皮固定在渗透扩散装置的扩散室与接收室
之间,外侧皮肤面向扩散室。在接收室中注入脱气
生理盐水作为接收液,排除气泡,使液面完全与皮肤
内层接触,300r·min-1磁力搅拌,恒温至37℃,扩
散室中加入05mL1g·L-1丹皮酚溶液,计时,在
设定时间取样055mL并补加相同体积的新鲜接收
液。样液用HPLC测定丹皮酚含量。计算相应时间
的丹皮酚质量浓度C,按下式计算累积透过量(Q)
式中Q为累积透过量(μg·cm-2);V为接收室
中接收液的体积(mL);Cn为第n个取样点测得的药
物质量浓度(mg·L-1);S为渗透面积(cm2)。
以dQ/dt对时间 t做图,其斜率为药物的渗透
速率Js(μg·cm-2·min-1),截距为时滞Tlag,药物
的表观渗透系数 Papp=Js/C,C为扩散池中药物浓
度。
2221 蛙皮对丹皮酚稳定性的研究 取一定浓
度丹皮酚生理盐水溶液25mL置锥形瓶中,按1mg
·L-1加入剪碎的蛙腹皮,37℃水浴恒温,300r·
min-1磁力搅拌,于 0,2,4,6,8,10,12h取样 05
mL,过滤,HPLC测定各时间溶液中丹皮酚含量,计
算RSD068%。结果表明,12h内丹皮酚在蛙皮渗
透液中稳定性良好。
2222 接收液对丹皮酚表观渗透系数的影响 分
别以生理盐水、纯水、18%NaCl、生理盐水(pH
401)和生理盐水(pH1000)作为接收液,考察接收
液渗透压和pH对药物表观渗透系数的影响,见表1。
表1 接收液(渗透介质)对丹皮酚表观渗透
系数的影响(n=3)
接收液 Qt r Papp/10-5cm2·s
纯水
y = 1991x +
3720
09928 173±009
18%NaCl y=2194x9748 09994 192±005
生理盐水(pH688)
y = 2146x +
1668
09953 184±008
生理盐水(pH401)
y = 1053x +
8335
09917 181±002
生理盐水(pH1000)
y = 0051x +
0607
09895164±008
由表1可知,用t检验进行统计学分析,接受液
的渗透压和 pH对丹皮酚的渗透有一定的影响,
18%NaCl组的表观渗透系数比其他组大,但与生
理盐水组无显著差异,而时滞较生理盐水组长;在酸
性条件下丹皮酚的表观渗透系数比生理盐水组小但
无显著性差异,而在碱性条件下丹皮酚的表观渗透
系数明显减小。总体来说,丹皮酚在符合体内环境
的渗透介质(生理盐水)中透过率较大,时滞短。
2223 同一牛蛙的不同部位皮肤对丹皮酚表观
渗透系数的影响 取同一只牛蛙的正背皮、侧面皮和
正腹皮,考察不同部位蛙皮对药物表观渗透系数的
影响,见表2。
表2 同一牛蛙不同部位对丹皮酚表观渗透
系数的影响(n=3)
皮肤 Qt r Papp/10-5cm2·s
腹皮  y=2070x+8503 09900 179±002
背皮  y=1205x12938 09993 107±006
侧腹皮 y=0938x12720 09975 084±016
  注:P<001vs腹皮。
由表2可知,同一牛蛙不同部位的蛙皮对丹皮
酚的渗透有较大的影响,其表观渗透系数为腹皮 >
背皮>侧皮。
2224 不同牛蛙腹皮对丹皮酚渗透影响 取3只
牛蛙的正腹皮,考察不同牛蛙腹皮对药物表观渗透
系数的影响,见表3。
由表3可知,选择质量在500g左右牛蛙的腹
皮作为丹皮酚体外黏膜渗透模型,不同的牛蛙之间
表观渗透系数无显著性差异。
2225 丹皮酚浓度对渗透的影响 考察不同质
量浓度(001,002,01,05,1,25,5,10g·L-1)
丹皮酚表观渗透系数,见表4。
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表3 不同牛蛙腹皮对丹皮酚表观渗透系数的影响(n=3)
牛蛙 Qt r Papp/10-5cm2·s
1 y=2093x+72159 09944 181±008
2 y=2224x+17567 09908 191±005
3 y=2037x+1583 09928 175±007
  注:P<005vs牛蛙1;P<001vs牛蛙1。
表4 丹皮酚质量浓度对渗透的影响
给药质量
浓度/g·L-1
Qt r Papp/10-5cm2·s
0.01 y=0.019x+0.48150.9911 1.61±0.09
0.02 y=0.040x+0.4901 0.9874 1.67±0.05
0.1 y=0.204x+1.8944 0.9900 1.75±0.09
0.5 y=1.080x+11.715 0.9865 1.84±0.11
1.0 y=2.037x+15.830 0.9928 1.75±0.07
2.5 y=4.745x-20.297 0.9999 1.68±0.16
5.0 y=7.903x-28.504 0.9995 1.40±0.10
10.0 y=9.420x-18.787 0.9981 0.70±0.06
  注:P<005vs1g·L-1;P<001vs1g·L-1。
由表4可知,25g·L-1以下质量浓度的丹皮
酚的渗透速率差异不明显,质量浓度≥50时,由于
扩散池内药物结晶析出而影响药物的渗透,从而导
致渗透速率减小。可以认为在符合漏槽条件下,丹
皮酚的表观渗透系数与浓度无关。
223 丹皮酚累积渗透曲线
累积渗透率时间曲线 以生理盐水为接收液,
按222项下方法研究丹皮酚累积渗透率时间(R
t)曲线。
图2 丹皮酚蛙皮渗透累积渗透率(n=3)
3 小结与讨论
药物黏膜吸收需要适宜的水溶性和脂溶性,以
便能透过生物膜脂质双分子层[4]。在前期研究中,
作者采用HPLC对牡丹皮提取物丹皮酚在生理盐水
中的平衡溶解度和表观油水分配系数进行了测定,
以期为中药成分的构效关系、吸收代谢研究提供借
鉴;结果丹皮酚在生理盐水中的平衡溶解度为
53290mg·L-1,符合漏槽条件;表观正辛醇/水分
配系数为 P=16597,lnP=222。经典理论认为
lnP较小的化合物吸收差,lnP大于1的化合物吸
收较好。本实验结果表明,丹皮酚表观渗透系数较
大,能以较快的速率透过蛙皮,8h累积渗透率在
90%左右;这与上述理论的结果一致。
实验中必须使用脱气渗透介质,否则实验过程
中会产生大量气泡吸附于蛙皮上,影响实验结果,如
有气泡也应及时排出。接受液的渗透压和 pH对丹
皮酚的渗透有一定的影响,总体来说,在符合体内环
境的渗透介质(生理盐水)中透过率较大,时滞短;
动物皮肤个体差异对丹皮酚渗透也有一定的影响,
在该研究中选择质量在500g左右牛蛙的腹皮实验
结果较好,误差小;而同一牛蛙不同部位的蛙皮对丹
皮酚的渗透有较大的影响,其渗透系数:腹皮 >
背皮>侧皮;质量浓度在25g·L-1以下的丹皮酚
的渗透速率无显著差别,质量浓度过高时,由于扩散
池内药物结晶析出而影响药物的渗透,从而导致渗
透速率减小。
丹皮酚体外蛙皮渗透性良好,符合一级吸收过
程,蛙皮没有角质层,故渗透过程的时滞作用不明
显,这与黏膜吸收特点一致。
[参考文献]
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民卫生出版社,1991:635
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究[J]中国中药杂志,2009,34(3):273
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Studyoninvitromucosalpermeationpropertiesandfactorsafecting
mucosalpermeabilityofpaeonol
ChenXiaolan1,2,DUShouying1,LUYan1,YAOZongling1
(1SchoolofChinesePharmacy,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;
2GuiyangColegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China)
[Abstract] Objective:Tostudytheinvitromucosalpermeationpropertiesofpaeonolandthefactorsthatafectsuchpermeabil
ityMethod:Bulfrogskinwasselectedasthepermeationmodel,andthemodifiedFranzdifusioncelwasadoptedtoinvestigatethe
percutaneousadsorptioninvitroContentofpaeonolwasquantifiedbyHPLCKindsofreceivingsolution,partsofbulfrogskinandim
pactsofdrugconcentrationonpercutaneousadsorptioninvitroweresystematicalystudiedResult:Percutaneouspermeationofpaeonol
wastosomeextentafectedbyosmoticpressureandpHvalueofthereceivingsolutionAbdominalskin,lateralabdominalskinanddor
salskin,withthepermeabilitycoeficientformhightolow,hadgreatinfluenceonthepermeationofpaeonolThereexistedagoodper
cutaneouspermeationofpaeonolAndtherelationshipbetweenthecumulativepermeabilityrateandtimewascoincidedwiththefirst
orderkeneticalprocessConclusion:Takentheinvitroabdominalskinofbulfrogasthepermeationmodel,somesimilaritieswerere
vealedbetweeninvitropercutaneouspermeationofpaeonolandmucosaladsorption
[Keywords] paeonol;frogskin;mucosalpermeability;Papp
[责任编辑 周驰]
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